一种鉴定鲢、鳙杂交和遗传渐渗个体的微卫星标记与特异性引物和应用

摘要

本发明属于水产养殖中群体鉴定技术领域，具体的说是一种鉴定鲢与鳙的微卫星标记与特异性引物及其在鲢、鳙杂交和遗传渐渗个体鉴定中的应用。即提供18个鲢、鳙种间特异性微卫星位点，其核苷酸序列为SEQIDNO：1-18中的任一个，本发明还提供针对上述微卫星位点设计的引物，PCR扩增结果具有种间特异性，能够准确、有效地对鲢、鳙及其杂交和遗传渐渗个体进行鉴定，并可用来对自然水域和繁殖场亲本群体基因库纯度进行实时监测。本发明还公开了用于上述鲢、鳙及其杂交和遗传渐渗个体进行鉴定的试剂盒。本发明的鉴定方法具有准确度高、分辨率高和速度快的优势。

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖中群体鉴定技术领域，具体的说是一种鉴定鲢与鳙的 微卫星标记与特异性引物及其在鲢、鳙杂交和遗传渐渗个体鉴定中的应用。

背景技术

微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)是 指由1～6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物 种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组 中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共 显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记， 并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质 鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。

鲢、鳙在我国已有上千年的养殖历史，在我国水产养殖业中占有重要地位， 由于这两种鱼类的养殖产量高、成本低、病害少、管理简单，它们已被引入多 个国家和地区作为人类食物来源或调控水体水质。然而，由于国外环境与它们 原产地的栖息环境有差异，鲢、鳙间杂交和遗传渐渗在很多国家和地区都有报 道（Kolar CS et al.Asian Carps of the Genus Hypophthalmichthys(Pisces, Cyprinidae)–A Biological Synopsis and Environmental Risk Assessment.2005, Report to U.S.Fish and Wildlife Service per Interagency Agreement94400-3-0128； Tátrai I et al.Studies on the biological role and effects of Asian carps in Lake Balaton. A Balaton kutatásának,2006,évi eredményei Magyar Tudományos Akadémia  Budapest ISSN1419-1075；Verigin BV et al.A case of natural hybridization between  Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis(Pisces,Cyprinidae). Zoologicheskii Zhurnal,1979,58:190–196.）。此外，在我国也曾发现有鲢、鳙杂 交个体，但仅限于人工繁殖场内（龚珞军等.汈汊湖养殖场出现鳙鲢杂交现象. 湖北农业科学,1991,12:41.）。

鲢、鳙杂交个体生长速度均比鲢、鳙慢，其它方面也没有显示优势（龚珞 军等.汈汊湖养殖场出现鳙鲢杂交现象.湖北农业科学,1991,12:41.）。因此，鲢、 鳙之间的杂交和遗传渐渗势必会导致这两者经济性状的退化，这对我国“四大家 鱼”的养殖业来说是一个巨大的潜在威胁。因此必须采取行之有效的方法来鉴定 鲢、鳙杂交及遗传渐渗个体，并将这些个体清除，以保持我国鲢、鳙优良的基 因库。然而，仅仅依靠形态学方法并不能准确判断鲢、鳙纯种个体及其杂交和 遗传渐渗个体，因为很多鲢、鳙杂交和遗传渐渗个体并不表现出这二者的中间 性状，而是表现出倾向于这二者之一的表型，多代遗传渐渗的个体有可能在形 态特征上难以准确鉴定。因此，需要建立一种快速、准确的方法，对鲢、鳙杂 交和遗传渐渗个体进行有效鉴定。Mia等曾采用3个鲢、鳙间无共有等位基因 的微卫星标记来检测孟加拉国养殖场中的杂交个体(Mia MY,et al.Detection of  hybridization between Chinese carp species(Hypophthalmichthys molitrix and  Aristichthys nobilis)in hatchery broodstock in Bangladesh,using DNA microsatellite  loci.Aquaculture,2005,247:267–273.）。然而，该方法存在不足之处，因为仅凭 3个位点很难准确判断待测个体属于种间杂交还是遗传渐渗个体，甚至无法确定 纯种鲢、鳙，需要多个标记位点组合加以分析，才能有效区别，标记位点检测 得越多，识别就会越准确。因此本发明开发了18个鲢、鳙种间特异性微卫星标 记，通过这些位点的综合分析，可以更加精确地鉴别鲢、鳙杂交和遗传渐渗个 体。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定鲢与鳙的微卫星标记与特异性引物，即提供 18个对鲢、鳙物种特异性的微卫星标记以及相应的多态性引物，为鉴定鲢、鳙 杂交和遗传渐渗个体提供有效的工具。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案来实现：

本发明一方面提供对鲢、鳙物种特异性的微卫星标记，其核酸序列为SEQ ID NO:1-18中的任一个。

本发明另一方面还提供针对上述18个微卫星标记设计的引物对，其序列为 SEQ ID NO：19-54。

本发明的微卫星引物对用于鉴定鲢、鳙杂交和遗传渐渗个体的检测方法， 包括如下步骤：

1）基因组DNA的提取：提取目标个体基因组DNA；

2）微卫星PCR扩增：采用本发明设计的引物，目标个体基因组DNA为模 板进行PCR扩增，获得目标个体微卫星扩增产物；

3）电泳检测扩增产物：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及溴化乙锭染色法 检测微卫星扩增产物；

4）基因型分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型， 若某一个体在所有18个微卫星位点均表现为鲢等位基因，则该个体为纯种 鲢；若某一个体在所有18个位点均表现为鳙等位基因，则该个体为纯种鳙； 若某一个体在所有18个位点均同时显现鲢、鳙等位基因，则该个体为鲢、

鳙杂交个体；若某一个体在18个位点中的至少1个位点同时显现鲢、鳙等

位基因，则该个体为鲢、鳙遗传渐渗个体。

对上述技术方案的改进：提取目标个体基因组DNA，将其稀释为20-50ng/μL, 每个PCR反应中加入1μL，反应总体积为12.5μL。

对上述技术方案的进一步改进：所述PCR扩增的加样参数为：每个PCR反 应体系总体积12.5μL，包含20-50ng的模板DNA，0.4U Taq DNA聚合酶，1.25 μL10×PCR Buffer，0.4μL dNTP(2.5mM)，0.4μL正反向混合引物（各2.5μM）， 最后加适量灭菌超纯水至12.5μL；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为： 94℃预变性5分钟，（94℃变性35秒、50～60℃退火35秒、72℃延伸40秒） 35个循环；最后72℃终延伸8分钟，PCR产物于4℃保存。

对上述技术方案的进一步改进：将PCR产物在10％的非变性聚丙烯酰胺凝 胶,30W恒功率电泳2h进行分离；将胶板通过1%的溴化乙锭（EB）溶液显色 5-10分钟，即可得到目标个体在18个基因座位的基因分型。

本发明还提供了上述对鲢、鳙及其杂交和遗传渐渗个体进行鉴定的试剂盒， 该试剂盒包含上述用于鲢、鳙及其杂交和遗传渐渗个体进行鉴定的微卫星引物。 根据实际情况，所述的试剂盒进一步包含Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、 dNTPs、灭菌超纯水、MgCl₂。

当引物的合成、基因组DNA的提取、dNTPs和Taq DNA聚合酶试剂来自 不同批次时，PCR反应条件，包括退火温度等都会发生一定的变化。所以每次 进行大批量PCR前，都要选择少量个体进行温度梯度、引物浓度梯度PCR，进 行2％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果，以确定最佳的PCR反应条件。此外， 确定好单个标记引物PCR的退火温度(Tm)之后，可以根据PCR产物的大小， 适当对部分引物进行组合，再摸索多重PCR反应的条件。由于所用到的引物对 应的目标产物片段不超过300bp，所以循环中的延伸时间均控制在45秒左右。

应用上述引物和检测技术可以高效鉴定鲢、鳙杂交和遗传渐渗个体，可对 鲢、鳙自然群体和繁殖亲本的基因库纯度进行实时监测，并可取代在其他物种 中一直沿用的同工酶及多态微卫星位点等进行杂交和遗传渐渗的检测方法。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1.操作简单，判断准确；

2.检测速度快，由于等位基因数目少、易区分，无需进行复杂计算即可作 出判断；

3.分辨率高。

根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于鉴定鲢、鳙杂交和遗传 渐渗个体鉴定，本试剂盒具有使用方法简便、快速、灵敏的优点，不需要特殊 的仪器，适合常规实验室检测的需要，且检测结果可靠、稳定、准确，为高效 鉴定鲢、鳙杂交和遗传渐渗个体提供便利。

附图说明

图1为纯种鲢个体（左侧）和纯种鳙（右侧）个体在3个鲢、鳙种间特异性微 卫星位点的聚丙烯酰胺电泳带型图。

图2为鲢、鳙人工杂交家系个体在2个鲢、鳙种间特异性微卫星位点的聚丙烯 酰胺电泳带型图（第1泳道为DNA Marker，第2、3泳道分别为鲢、鳙亲本。）。 图3为一个遗传渐渗个体和一个杂交个体在随机选取的10个鲢、鳙种间特异性 微卫星位点的聚丙烯酰胺电泳带型图（图A为遗传渐渗个体，图B为杂交个体， 两侧为PBR322DNA Marker。）。

图4为根据18个鲢、鳙种间特异性微卫星标记对形态学上判断的鲢、鳙及其杂 交个体鉴定结果的柱形图（图中白色代表鳙特有的等位基因，黑色代表鲢特有 等位基因，每条竖线代表一个个体，竖线全为同一种颜色表示该个体为纯种鲢 或鳙；若某一个体白色和黑色长度相等，则该个体为杂交个体，若长度不等则 为遗传渐渗个体。）。

图5为根据8个多态性微卫星标记对形态学上判断的鲢、鳙及其杂交个体鉴定 结果的柱形图（图中白色代表能够在鳙中检测到的等位基因，黑色代表能够在 鲢中检测到的等位基因，每条竖线代表一个个体。）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方 法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆 实验指南（第三版），或按照制造厂商所建议的条件。

【实施例1】微卫星位点的筛选

本发明中的18个鲢、鳙种间特异性微卫星标记是通过三次严格筛选所获得。 本实验室先前的研究中已通过磁珠富集法构建了鲢、鳙微卫星富集文库，并通 过克隆测序获得了含微卫星重复的序列。从含有微卫星的序列中，选取核心重 复5次以上并符合引物设计要求的序列，采用Primer Premier5.0进行引物设计。主 要参数设置为：引物长度20-25bp，PCR产物片段长度范围120-350bp，最适退 火温度50-60℃。GC含量一般在40%-60%之间，尽量避免二级结构出现。最终 成功获得了227个可稳定扩增的鲢、鳙微卫星标记。

将这227个微卫星标记在鲢、鳙各5个来自不同群体的个体中进行扩增，如 果某一微卫星标记在鲢、鳙间无共有等位基因，则将该位点保留用于下一轮筛 选，若有共有等位基因则直接淘汰。通过第一轮筛选后，再将筛选出的微卫星 标记在14个鲢群体和15个鳙群体各8个个体中进行检测，如果某一微卫星标记仍 在鲢、鳙间无共有等位基因（图1），则将该位点保留备用，而如果出现了共有 等位基因，则将其淘汰。通过第二轮筛选后，将筛选出的微卫星标记在2个鲢、 鳙正、反交人工杂交家系各40个个体中筛选，如果某一标记在所有个体中均同 时表现出鲢、鳙特异等位基因，则该标记可作为鲢、鳙种间特异性微卫星标记， 并可应用于鲢、鳙的分子鉴定（图2）；而如果在某些个体中只表现出鲢或鳙的 等位基因，则该位点可能含零等位基因，如果用于鲢、鳙鉴定可能会造成误差， 因此这种微卫星标记也被排除。最终筛选出18个可用于对鲢、鳙及其杂交和遗 传渐渗个体进行分子鉴定的微卫星标记，SEQ ID NO：1-19，各标记的引物（SEQ  ID NO：19-54）信息如下表所示：

【实施例2】鲢、鳙种间特异性微卫星标记鉴定PCR体系及电泳检测扩增 产物体系的组成与配制

A).PCR体系组成：

dNTPs（10mM）为上海生工公司产品；Taq DNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR Buffer为大连TaKaRa公司产品；

B).10×PCR Buffer组成：

Tris-HCl(pH8.3)100mM、KCl500mM、MgCl215mM；

C).PCR反应体系配制：

总体积12.5μL，包含20-50ng的模板DNA，0.4U Taq DNA聚合酶， 1.25μL10×PCR Buffer，0.4μL dNTP(2.5mM)，0.4μL正反向混合引物（各2.5 μM），最后加适量灭菌超纯水至12.5μL；

D).聚丙烯酰胺凝胶配制：

30%丙烯酰胺8.5mL、5×TBE5mL、10%过硫酸铵0.5mL、TEMED5μL、 蒸馏水11.5mL。

【实施例3】鲢、鳙种间特异性微卫星标记鉴定形态学上判断的鲢、鳙及 其杂交个体

A).取根据形态特征判断为鲢、鳙和杂交种的三种待鉴定个体，利用苯酚/ 氯仿法抽提每个个体的基因组DNA，并将DNA稀释至20-50ng/μL的浓度。

B).以A)步所提DNA为模板，按照实施例2C)步的体系配制PCR反应混 合液。需另外配制以已鉴定为鲢、鳙纯种个体DNA为模板的PCR反应混合液 作为对照。

C).在PCR仪上进行扩增，94℃预变性5分钟后，进行35个PCR反应循 环，每个循环包括94℃变性35秒、适当的退火温度下退火35秒、72℃延伸 40秒；72℃终延伸8分钟。

D).PCR产物用按照实施例2D)步体系配制的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用 1%溴化乙锭（EB）溶液对完成电泳的凝胶进行染色，并用JS-A380（上海培清） 凝胶成像仪对每张凝胶扫描并拍照保存。

E).本发明的18个种间特异性微卫星标记在目标群体中进行PCR扩增后， 将PCR产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，将PCR产物加入适量上样缓冲液 后点于凝胶中进行电泳，电泳功率为30W，电压控制在230V，通过溴化乙锭（EB） 染色后即可在紫外凝胶成像仪上显现群体中各个体的扩增带型。通过以下方法 进行鲢、鳙种间杂交和遗传渐渗个体进行鉴别：若某一个体在所有18个标记位 点均表现为鲢等位基因，则该个体为纯种鲢；若某一个体在所有18个位点均表 现为鳙等位基因，则该个体为纯种鳙；若某一个体在所有18个位点均同时显现 鲢、鳙等位基因，则该个体为鲢、鳙杂交个体；若某一个体在18个位点中的至 少1个位点同时显现鲢、鳙等位基因，则该个体为鲢、鳙遗传渐渗个体。为了 更直观描述遗传渐渗和杂交个体的鉴别，随机选取了10个微卫星标记在遗传渐 渗和杂交各一个体中进行基因分型，如图3所示：图中A、B分别为一个遗传渐 渗个体和一个杂交个体在10个鲢、鳙种间特异性微卫星位点的聚丙烯酰胺电泳 带型图，两侧为PBR322DNA Marker，图A所示遗传渐渗个体只在部分位点表 现为杂合带型，图B所示鲢、鳙杂交个体则在所有位点均表现为杂合带型。

【实施例4】鲢、鳙种间特异性微卫星标记法和多态微卫星法鉴定效率和 准确率的比较

1、鲢、鳙种间特异性微卫星标记法：

从美国密西西比河和伊利诺斯河中共采集了167尾鲢、鳙样本，通过形态 学特征鉴定出其中有60尾鲢、83尾鳙及24尾杂交个体。每尾样本取适量肌肉 组织于液氮中粉碎，干燥后置于离心管中，并保存在4℃冰箱中备用。进行基 因组DNA提取时，取各样本的肌肉组织约10mg,裂解、消化后，利用苯酚/氯 仿法提取基因组DNA。基因组DNA提取完成后，用无菌超纯水稀释至20-50 ng/μl备用。按照实施例2C)步的体系配制PCR反应混合液，反应所用引物为本 发明中所公布的18对鲢、鳙种间特异性微卫星引物，其序列为SEQ ID NO： 19-54。将配制好的含反应混合液的PCR管置于ABI公司的Veriti96Well Thermal  Cycler PCR扩增仪上进行扩增反应，PCR循环所用程序按照实施例3C)步进行 设置。按照实施例2D)步的体系配置聚丙烯酰胺凝胶，将PCR产物加入适量上 样缓冲液后点于凝胶中进行电泳，电泳功率为30W，电压控制在230V，根据各 微卫星标记扩增产物的不同大小控制电泳时间在2-3h。电泳完成后，将凝胶在 1%的EB溶液中染色5-10min,染色完成后用JS-A380（上海培清）凝胶成像仪 对每张凝胶进行扫描并拍照保存。

统计电泳图像中每个个体在18个鲢、鳙种间特异性微卫星位点的基因型， 并根据实施例3E)步的鉴定方法鉴定每个个体属于鲢、鳙、杂交及遗传渐渗的 哪一类。另外将这18个标记的基因分型统计数据输入Structure2.2软件进行遗 传结构计算，以获得通过形态特征鉴定的鲢、鳙遗传渐渗的程度。利用18个鲢、 鳙种间特异性微卫星标记对167尾样本进行鉴定后发现形态学上鉴定的鲢、鳙 中存在大量遗传渐渗个体，如图4所示：图中白色代表鳙特有的等位基因，黑 色代表鲢特有的等位基因，每条竖线代表一个个体，竖线全为同一种颜色表示 该个体为纯种鲢或鳙；若某一个体白色和黑色长度相等，则该个体为杂交个体， 若长度不等则为遗传渐渗个体。该图能够准确、直观地反映鲢、鳙群体中的杂 交和遗传渐渗现象。另外，通过对每个个体在18个种间特异性微卫星标记中扩 增带型的分析，可以得到以下详细鉴定数据：

该鉴定结果显示，在美国水体中，通过形态学方法鉴定的鲢、鳙中有相当 部分的个体被鉴定为遗传渐渗个体，而通过形态鉴定的杂交个体实际上大部分 也是遗传渐渗个体。因此，随着鲢、鳙种间杂交和遗传渐渗的持续发生，仅仅 依靠形态方法对鲢、鳙进行种类鉴定的结果已经非常不可靠。

2.多态微卫星法：

从美国密西西比河和伊利诺斯河中共采集了167尾鲢、鳙样本，通过形态 学特征鉴定出其中有60尾鲢、83尾鳙及24尾杂交个体。取各样本干燥保存的 肌肉组织约10mg,裂解、消化后，利用苯酚/氯仿法提取基因组DNA。基因组 DNA提取完成后，用无菌超纯水稀释至20-50ng/μL备用。按照实施例2C)步 的体系配制PCR反应混合液，反应所用引物为本发明实施例1中第二轮筛选获 得的8对鲢、鳙多态性微卫星引物，SEQ ID NO：55-70，如下表所示：

将配制好的含反应混合液的PCR管置于ABI公司的Veriti96Well Thermal  Cycler PCR扩增仪上进行扩增反应，PCR循环所用程序安置实施例3C)步进行 设置。

按照实施例2D)步的体系配置聚丙烯酰胺凝胶，将PCR产物加入适量上样 缓冲液后点于凝胶中进行电泳，电泳功率为30W，电压控制在230V，根据各微 卫星标记扩增产物的不同大小控制电泳时间在2-3h。电泳完成后，将凝胶在1% 的EB溶液中染色5-10min,染色完成后用JS-A380（上海培清）凝胶成像仪对 每张凝胶进行扫描并拍照保存。

统计电泳图像中每个个体在8个鲢、鳙多态性微卫星位点的基因型，并将 这8个标记的基因分型统计数据输入Structure2.2软件进行遗传结构计算，以评 估鲢、鳙遗传渐渗的程度。如图5所示，尽管可以观察到代表鳙中能检测到的 等位基因的白色和代表鲢中能检测到的等位基因的黑色在某些个体中同时出 现，但由于鲢、鳙间共有等位基因的存在，无法通过该图判断混杂的颜色是由 共有等位基因还是由遗传渐渗所导致。因此，虽然采用多态性微卫星标记也能 发现鲢、鳙之间发生了杂交或遗传渐渗，但由于多态位点在鲢、鳙间具有相同 等位基因，因此不能准确区分杂交和遗传渐渗个体，也无法获得纯种、杂交和 遗传渐渗个体的具体数目和比例。另外，由于多态性微卫星标记分型后往往具 有多个等位基因，因此基因型的统计需消耗大量时间来进行，尤其有些位点的 等位基因间片段大小差异不大，仅用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳法很难区分这类 等位基因，即使能分型，也容易在统计中造成误差。若要对每个位点的等位基 因进行准确统计和记录，需要对每对引物进行荧光标记，采用测序仪进行基因 分型，这无疑大大增加了研究成本。

而本发明中所公开的18个鲢、鳙种间特异性微卫星标记的等位基因数目少， 且在鲢、鳙中等位基因范围已非常清楚，因此，采用本方法无需通过复杂的基 因分型和数据统计及计算方法，即可对研究对象进行准确、快速的鉴定。本方 法成本低、耗时短、操作简单、判断准确，值得在鲢、鳙鉴定工作中进行推广。