一株迟缓埃格特菌及其应用

摘要

本发明公开了一株迟缓埃格特菌及其应用。本发明所提供的迟缓埃格特菌具体为迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6847；本发明所提供的应用具体为所述迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847在生产肠二醇中的应用。本发明所提供的迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847在生物转化天然产物制备植物雌激素类成分肠二醇中具有重要应用，本发明所提供的生产肠二醇的工艺简单、生产成本低、无环境污染，适宜于大规模生产，具有重要的经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一株迟缓埃格特菌及其应用，特别设计一株迟缓埃格特菌及其在生产 肠二醇中的应用。

背景技术

近年来植物雌激素（phytoestrogens）类物质因其广泛的生理、药理学作用已引起 广泛关注。肠二醇（enterodiol，END）是国际公认的植物雌激素，具有类雌激素和抗 雌激素双向调节作用，以及抑制肿瘤、抗氧化、预防和治疗心血管疾病等多方面药理 活性。

肠二醇主要存在于哺乳动物体内，亦被称为哺乳动物木脂素。目前获得肠二醇的 主要途径为化学合成方法，但化学合成法成本较高，且污染环境。研究结果表明人体 肠道菌群能够转化植物中的多种木脂素类成分而生成为肠二醇，常见的木脂素类成分 包括开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（secoisolariciresinoldiglucoside，SDG）、开环异 落叶松树脂酚（secoisolariciresinol，SECO）、罗汉松脂酚（matairesinol，MAT）、落叶 松树脂醇（lariciresinol，LCS）、松脂醇（pinoresinol，PRS）、松脂醇二葡萄糖苷 （pinoresinoldiglucoside，PDG）、丁香树脂酚（syringaresinol，SYG）、牛蒡苷元 （arctigenin，ATG）、7-羟基罗汉松脂酚（7-hydroxymatariresinol，HYM）、牛蒡子苷 （arctiin，ARC）、芝麻脂素（sesamin）。富含此类成分的主要植物资源有亚麻籽 （flaxseed）、牛蒡子（ArctiiFructus）、海藻（seaweed）、油菜子（rapeseed）、黑小麦 （triticale）、大豆（soybean）、燕麦（oat bran）、玉米糠（corn bran）、麸皮等。

亚麻籽被认为是含有肠二醇前体物质最丰富的植物资源，榨油后的残渣（亚麻籽 粕）中SDG的含量可达到12~24mg/g。

发明内容

本发明的目的是提供一株迟缓埃格特菌及其应用。

本发明所提供的迟缓埃格特菌是人体肠道活性菌，自中国人体的肠道内容物中分 离得到，具体为迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III，该菌株已于2012年11月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.6847。

本发明的另一个目的是提供一种生产肠二醇的菌剂。

本发明所提供的生产肠二醇的菌剂，为菌剂A或菌剂B；

所述菌剂A的活性成分为所述迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No 6847和粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No. 6846；

所述菌剂B的活性成分为所述迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847。

所述迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847或所述菌剂在生产 肠二醇中的应用也属于本发明的保护范围。

在上述菌剂A的应用中，可以下述物质中的至少一种作为底物：开环异落叶松树 脂酚二葡萄糖苷、开环异落叶松树脂酚、罗汉松脂酚、落叶松树脂醇、松脂醇、松脂 醇二葡萄糖苷、丁香树脂酚、牛蒡苷元、7-羟基罗汉松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素； 亚麻籽、牛蒡子、海藻、油菜子、燕麦麸、黑麦麸、小麦麸、大麦麸和玉米麸。其中 前11种物质为11种化学成分，后9种物质来自于9种植物。在实际应用中，根据需 要对所述后9种物质进行适当的加工，如研磨粉碎获得粗粉，从而利于反应的进行， 使反应更加充分。

在本发明的一个实施例中，所述9种物质经研磨粉碎后获得粗粉粒径为 200μm~1000μm。

在所述迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847或所述菌剂B 的应用中，可以4,4′-二羟基肠二醇（4,4′-dihydroxyenterodiol,DHEND）作为底物。

在上述菌剂A的应用中，具体为以上述两株菌的活性混合菌液进行底物转化反应 获得END。所述活性混合菌液可由所述两株菌的混合菌液进行増菌获得，也可由所述 两株菌分别单独増菌后再混合而获得。所述増菌条件为25~40℃厌氧培养10~36小时。

在本发明中，上述所有的所述应用中，均采用厌氧培养的方式进行培养。

所述厌氧培养的温度可为25~40℃。在本发明的实施例中，具体为37℃。

为了使产物（如肠二醇）的产量达到峰值，通常需要在上述培养条件下培养3~10 天时间。

本发明还保护所述迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847在脱 羟基中的应用。在本发明中，所述迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847在脱羟基中的应用具体体现在将DHEND经所述脱羟基后转化为肠二醇。

本发明的还一个目的是提供一种生产肠二醇的方法。

本发明所提供的生产肠二醇的方法，可为如下（A）-（D）中的任一种：

生产肠二醇的方法，为如下（A）-（D）中的任一种：

（A）依次包括如下（a1）-（a3）的步骤：

（a1）将菌体含量均为5~9×10⁷cfu/mL的粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和迟 缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847三株菌的菌液按照体积比1： 1：1的比例混合，得到混合菌液；

（a2）取步骤（a1）中得到的混合菌液，按照体积比1：10的比例接种到厌氧液 体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到増菌液；

（a3）将步骤（a2）获得的増菌液，按照体积比1：10的比例接种到无碳源培养 基中，同时向培养体系中加入终浓度为20~30mg/mL（如20mg/mL或30mg/mL）的亚 麻籽粕，37℃厌氧培养3~10天（如8天），从培养液中获得肠二醇：

（B）依次包括如下（b1）-（b3）的步骤：

（b1）将菌体含量均为5~9×10⁷cfu/mL的粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和迟 缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847三株菌的菌液按照体积比1： 1：1的比例混合，得到混合菌液；

（b2）取步骤（b1）中得到的混合菌液，按照体积比1：10的比例接种到厌氧液 体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到増菌液；

（b3）将步骤（b2）获得的増菌液，按照体积比1：10的比例接种到庖肉培养基 中，同时向培养体系中加入终浓度为1mg/mL的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷，37 ℃厌氧培养3~10天（如8天），从培养液中获得肠二醇；

（C）依次包括如下（c1）-（c3）的步骤：

（c1）将菌体含量均为5~9×10⁷cfu/mL的粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和迟 缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847三株菌的菌液按照体积比1： 1：1的比例混合，得到混合菌液；

（c2）取步骤（c1）中得到的混合菌液，按照体积比1：10的比例接种到厌氧液 体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到増菌液；

（c3）将步骤（c2）获得的増菌液，按照体积比1：10的比例接种到厌氧液体培 养基中，同时向培养体系中加入终浓度为20mg/mL的底物A，37℃厌氧培养3~10天， 从培养液中获得肠二醇；所述底物A为如下中的至少一种：牛蒡子、海藻、油菜子、 燕麦麸、黑麦麸、小麦麸、大麦麸和玉米麸；

（D）依次包括如下（d1）-（d3）的步骤：

（d1）将菌体含量均为5~9×10⁷cfu/mL的粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和迟 缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847三株菌的菌液按照体积比1： 1：1的比例混合，得到混合菌液；

（d2）取步骤（d1）中得到的混合菌液，按照体积比1：10的比例接种到厌氧液 体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到増菌液；

（d3）将步骤（d2）获得的増菌液，按照体积比1：10的比例接种到厌氧液体培 养基中，同时向培养体系中加入终浓度为1mg/mL的底物B，37℃厌氧培养3~10天（如 8天），从培养液中获得肠二醇；所述底物B为如下中的至少一种：开环异落叶松树脂 酚、罗汉松脂酚、落叶松树脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香树脂酚、牛蒡苷 元、7-羟基罗汉松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素。

在上述方法中，所述无碳源培养基由NaCl、NH₄Cl、PBS和水按照3.0g：1.0g： 100mL：900mL的比例混合配制而成，pH 6.4；所述PBS由KH₂PO₄、K₂HPO₄和水按 照26.0g：18.5g：1L的比例混合配制而成。所述庖肉培养基由蛋白胨、牛肉粉、酵母 粉、NaH₂PO₄、葡萄糖、可溶性淀粉和水按照30.0g：5.0g：5.0g：5.0g：3.0g：2.0g： 1L的比例混合配制而成，pH 7.8。所述厌氧液体培养基由蛋白胨、酵母粉、大豆粉、 牛肉粉、葡萄糖、氯化钠、可溶性淀粉、半胱氨酸、磷酸二氢钾、氯化血红素、维生 素K1和水按照15.0g：5.0g：5.0g：5.0g：5.0g：5.0g：3.0g：0.5g：2.5g：0.005g：0.001g： 1L的比例混合配制而成，pH 7.3±0.2。

本发明还涉及一种分离纯化发酵液中肠二醇的方法。厌氧培养3-10天后，离心取 上清液，用大孔树脂色谱柱进行分离纯化，采用乙醇-水溶液或甲醇-水进行梯度洗脱， 收集含有肠二醇的洗脱液，减压浓缩干燥，得到肠二醇；所述大孔树脂色谱柱具体可 为XAD-2大孔树脂或D101大孔树脂。

本发明所提供的迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847在生物 转化天然产物制备植物雌激素类成分肠二醇中具有重要应用。本发明所提供的生产肠 二醇的工艺简单、生产成本低、无环境污染，适宜于大规模生产，具有重要的经济效 益。

保藏说明

分类命名：粘液真杆菌

拉丁名：（Eubacterium limosum）

参椐的生物材料：ZL-II

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2012年11月20日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6846

分类命名：迟缓埃格特菌

拉丁名：（Eggerthella lenta）

参椐的生物材料：ZL-III

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2012年11月20日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6847

分类命名：单形拟杆菌

拉丁名：（Bacteroides uniformis）

参椐的生物材料：Strain-I

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2011年5月25日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4897

附图说明

图1为ZL-III菌株的16S rRNA基因序列同源性分析及鉴定结果。其中，Strain ZL-III菌株即表示ZL-III菌株。

图2为三株菌的不同接种方式转化亚麻籽粕产生肠二醇(END)的结果比较图。其 中，“单独接菌”表示三株菌单独増菌24h再混合后接种；“混合接菌”表示三株菌混 合后増菌24h再接种。

图3为以开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（secoisolariciresinoldiglucoside，SDG） 为底物的三株菌随机组合培养48h的HPLC色谱图。其中，Strain I表示单形拟杆菌 （Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897；Strain ZL-II表示粘液真杆菌 （Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846；Strain ZL-III表示迟缓埃格特菌 （Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847。

图4为三株菌在SDG转化产生不同产物（SECO，DHEND，END）过程中的作 用。其中，Strain I表示单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897； Strain ZL-II表示粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846；Strain ZL-III表示迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

厌氧液体培养基（购自北京陆桥技术有限责任公司，产品目录号CM1513）。成分 （g/L）：蛋白胨15.0；酵母粉5.0；大豆粉5.0；牛肉粉5.0；葡萄糖5.0；氯化钠5.0； 可溶性淀粉3.0；半胱氨酸0.5；磷酸二氢钾2.5；氯化血红素0.005；维生素K₁0.001， pH 7.3±0.2。

庖肉培养基：称取32g庖肉培养基基础（购自北京陆桥技术有限责任公司，产品 目录号CM605）溶于1.0L蒸馏水中，摇匀，加石蜡油覆盖，121°C高压灭菌20min 待用。所制得的庖肉培养基（1L）中含有如下组分：蛋白胨(30.0g)，牛肉粉(5.0g)， 酵母粉(5.0g)，NaH₂PO₄(5.0g)，葡萄糖(3.0g)，可溶性淀粉(2.0g)，pH 7.8。

无碳源培养基：NaCl(3.0g)，NH₄Cl(1.0g)，PBS(100mL)，去离子水900(mL)， pH 6.4。使用前分装于10mL连盖塑料离心管，每管5mL；表面覆盖1mL液体石蜡； 121℃高压蒸汽灭菌20min；室温放置备用。PBS：KH₂PO₄(26.0g)，K₂HPO₄(18.5g)， 去离子水(1L)。

下述实施例中，所涉及的化合物标准品信息如下：

开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（Sigma Aldrich,No.S0202）、开环异落叶松树脂 酚（SigmaAldrich,No.60372）、罗汉松脂酚（SigmaAldrich,No.04157）、落叶松树脂 醇（Sigma Aldrich,No.06892）、松脂醇（Sigma Aldrich,No.40674）、松脂醇二葡萄糖 苷（Sigma Aldrich,No.10789）、丁香树脂酚（Sigma Aldrich,No.6288）、牛蒡苷元（Sigma Aldrich,No.1777）、7-羟基罗汉松脂酚（Sigma Aldrich,No.42945）、牛蒡子苷（Sigma Aldrich,No.sc-202064）、芝麻脂素（Sigma Aldrich,No.S9314）；肠二醇（Sigma Aldrich, No.45198）。

下述实施例中所涉及的样本中肠二醇（END）、4,4′-二羟基肠二醇（DHEND）和 开环异落叶松树脂酚（SECO）的HPLC检测方法如下：

取200μL培养液，加入400μL水饱和正丁醇萃取，4800rpm/min离心10min，取 上清液320μL于离心管中，氮气吹干，加入200μL色谱甲醇，10000rpm/min离心3min， 取上清液20μL进HPLC检测。色谱柱：Zorbax SB-C₁₈（4.6mm×25cm，5μm，美国 Agilent公司）；保护柱Zorbax SB-C₁₈（4.6mm×12.5mm，5μm，美国Agilent公司）； 流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0~30min（A：B体积比由100:0线性梯度变化至 50:50)，30~40min（A：B体积比由50:50线性梯度变化至0:100）；流速1.0mL/min； 检测波长280nm；温度25℃。

下述实施例中将涉及到肠二醇的含量测定，肠二醇的标准曲线为：

精密称定2.08mg肠二醇对照品，加入10mL容量瓶中，甲醇稀释到刻度，配成 208.0μg/mL对照品母液。将对照品母液逐级稀释，分别得到浓度为208.0~1.30μg/mL 的对照品溶液。吸取上述溶液分别进样20μL，进行HPLC分析。以肠二醇峰面积(Y) 对肠二醇进样量(X，mg/mL)进行回归计算，得回归方程：Y=9668X+13.17(R2=0.9990)， 线性范围为1.30~208.0μg/mL。定量限(S/N=10)为1.3μg/mL；检测限(S/N=3)为 0.33μg/mL。

实施例1、迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III的分离与鉴定

一、迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III的分离

采集新鲜人或小鼠粪便标本，经庖肉培养基增菌，得到肠道菌群样本，接种到5mL 无碳源培养基中，加入底物亚麻籽粕（粒径为200μm~1000μm）100mg，37℃厌氧培 养48h。取10μl无碳源培养基菌液，10倍梯度稀释。取10^-6倍稀释液涂平板，37℃厌 氧培养24h。挑取其中的单菌落，接种到5mL无碳源培养基中，加入底物亚麻籽粕（粒 径为200μm~1000μm）100mg，培养2天后进行HPLC检测，筛选可以产生END的单 菌落。取10μL活性菌的菌液加入庖肉液体培养基增菌，10^-5倍稀释液涂平板，厌氧 培养48h后观察，有白色且较大(Strain-I)、黄色(ZL-II)和透明且较小(ZL-III)三种 不同颜色和形态的菌落。

二、迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III的鉴定

1、取ZL-III菌种0.5mL接种到厌氧液体培养基5mL培养20h，取1mL菌液进行 基因组DNA提取。细菌基因组提取使用试剂盒（天根公司，目录号DP209），按照试 剂盒说明书操作，得到120uL基因组提取液。经琼脂糖凝胶电泳检测，证实细菌基因 组DNA提取成功。

2、16S rRNA扩增及测序

⑴引物设计：采用肠道菌通用引物，由上海生工公司合成。

正向引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

反向引物：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

⑵PCR反应体系：见表1。

表1.PCR扩增反应体系（50μL）

⑶PCR扩增反应程序：

⑷测序：PCR产物未纯化，送北京奥科生物公司测序。

3.16S rRNA序列分析

16S rRNA序列如序列表中序列1所示。对其16S rRNA基因序列进行同源性分析， 鉴定ZL-III为迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）（图1），该菌株Strain ZL-III已于2012 年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC， 地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.6847。

实施例2、迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847的应用

本实施例涉及迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847在生产肠 二醇中的应用。具体如下：

一、三株菌的混合菌转化亚麻籽粕产生肠二醇的研究（一）

1、增菌：取粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌液（菌 体含量为5×10⁷cfu/mL）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897 菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混合菌液。取混合 菌液0.5mL，接种到5mL厌氧液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到増菌液。

2、接种：取0.5mL步骤1获得的增菌液接种到无碳源培养基中至体系总体积为 5mL，加入亚麻籽粕（粒径为200μm～1000μm）100mg，37℃厌氧培养。

3、样本检测：每24h取样一次，进行HPLC分析，根据由肠二醇标准品制作的 标准曲线检测培养液中肠二醇的含量。实验重复三次，结果取平均值。

同时设置，将本发明中的迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）Strain ZL-III CGMCC No.6847替换为16S rRNA序列的GENBANK号为JQ085756的迟缓埃格特菌 （Eggerthella lenta）Strain ZL3，其余条件不变，进行对照。

4、实验结果：ZL-III组，自培养24h起，每次取样的培养液中均检测到了与肠二 醇标准品相同保留时间（Rt=24.1min）的色谱峰，并根据标准曲线计算相应培养液中 肠二醇的含量，经过24h的培养，培养液中肠二醇含量为12.1mg/L。从第2天到第8 天，培养液中肠二醇的含量稳步增加，在第8天的时候，肠二醇的含量达到峰值 61.1mg/L，并维持4天基本稳定。同样条件下，Strain ZL3组的生物转化活性均低于 Strain ZL-III组（见表2）。

表2.Strain ZL-III组/Strain ZL3组混合培养液中肠二醇（mg/L）的含量（5mL体系）

注：“a/b”为一组相对应的数值，a表示Strain ZL-III组数值，b表示Strain ZL3组数 值。

二、三株菌的混合菌转化亚麻籽粕产生肠二醇的研究（二）

1、增菌：取粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌液（菌 体含量为7×10⁷cfu/mL）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897 菌液（菌体含量为5×10⁷cfu/mL）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液（菌体含量为9×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混合菌液。取混合 菌液0.5mL，接种到5mL厌氧液体培养基中，37℃培养24h，从中取出1mL培养液 接种到200mL庖肉培养基中，37℃增菌培养24h，得到増菌液。

2、接种：取200mL步骤1获得的增菌液接种到含有无碳源培养基中至体系总体 积为2L，加入60g亚麻籽粕（粒径为200μm～1000μm）作为底物，37℃厌氧培养。

3、样本检测：前24h内，每6h取样一次，以后每24h取样一次，进行HPLC分 析，根据由肠二醇标准品制作的标准曲线检测培养液中肠二醇的含量。实验重复三次， 结果取平均值。

同时设置，将本发明中的迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847 替换为16S rRNA序列的GENBANK号为JQ085756的迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta） Strain ZL3。其余条件不变，进行对比实验。

4、实验结果：ZL-III组，自培养18h起，每次取样的培养液中均检测到了与肠二 醇标准品相同保留时间（Rt=24.1min）的色谱峰，并根据标准曲线计算相应培养液中 肠二醇的含量，经过18h的培养，培养液中检测到少量的肠二醇，从18h到24h，发 酵液中肠二醇含量增加迅速，24h时发酵液中肠二醇的含量为26.9mg/L，48h时肠二 醇浓度已达到较高值44.1mg/L。从第2天开始，发酵液中肠二醇的含量增加缓慢，在 第7天时呈现峰值58.0mg/L。而在相同条件下，ZL3组的生物转化活性均低于ZL-III 组（见表3）。

表3.ZL-III组/Strain ZL3组混合培养液中肠二醇（mg/L）的含量（2L体系）

  24h 48h 3天 5天 7天 重复1 27.1/0 43.3/15.6 48.0/20.0 56.7/31.0 56.3/30.1 重复2 27.7/0 45.1/17.3 50.9/19.3 55.0/28.7 58.0/33.0 重复3 25.9/0 43.9/19.0 49.0/20.3 56.9/27.6 59.6/32.9 平均值 26.9/0 44.1/17.3 49.3/19.8 56.2/29.1 58.0/32

注：“a/b”为一组相对应的数值，a表示ZL-III组数值，b表示Strain ZL3组数值。

三、接种方式对肠二醇产量的影响

以下将比较迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847、粘液真杆 菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846和单形拟杆菌（Bacteroides uniformis） Strain-I CGMCC No.4897这三株菌单独増菌24h后再混合接种入无碳源培养基，以及 将上述三株菌混合后増菌24h再接种入无碳源培养基这两种接种方式对肠二醇含量的 影响。

1、增菌：A.单独増菌：将粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No. 6846、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和迟缓埃格特菌 （Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847这三株菌的菌悬液各取0.5mL（测定粘液 真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846的菌体含量为5×10⁷cfu/mL、 单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897的菌体含量为5×10⁷cfu/mL、迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-II CGMCC No.6846的菌体含量为5× 10⁷cfu/mL），分别接种到5mL厌氧液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到三份单独 的増菌液。

B.混合増菌：取粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌液 （菌体含量为5×10⁷cfu/mL）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897菌液（菌体含量为5×10⁷cfu/mL）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液（菌体含量为5×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混合菌液。 取混合菌液0.5mL，接种到5mL厌氧液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到一份混 合増菌液。

2、接种：一方面，各取0.5mL步骤1获得的三份单独的增菌液接种到有含有亚 麻籽粕（粒径为200μm～1000μm）的无碳源培养基中至体系总体积为15mL（亚麻籽粕 在体系中的浓度为30mg/mL），37℃厌氧培养。另一方面，取0.5mL步骤1获得的一 份混合增菌液接种到装有含有亚麻籽粕（粒径为200μm～1000μm）的无碳源培养基中 至体系总体积为5mL（亚麻籽粕在体系中的浓度为30mg/mL），37℃厌氧培养。

3、样本检测：每24h取样一次，进行HPLC分析，根据由肠二醇标准品制作的标 准曲线测定培养液中肠二醇的含量。实验重复三次，结果取平均值。

结果如图2所示，迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847、粘 液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846和单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897这三株菌分别接种的情况下转化产生肠二醇的时 间需要48h，而三株菌混合增菌24h后再接种的情况转化产生肠二醇的时间仅需要24h， 而且转化产生肠二醇的量较多。

四、三株菌的混合菌转化多种底物产生肠二醇的研究

1、增菌：取粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌液（菌 体含量为9×10⁷cfu/mL）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897 菌液（菌体含量为9×10⁷cfu/mL）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液（菌体含量为5×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混合菌液。取混合 菌液0.5mL，接种到5mL厌氧液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到増菌液。

2、接种：配制厌氧液体培养基，加入不同底物粗粉（见表4，底物的粒径大小为 200μm～1000μm的粗粉），用1mL石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。将2.5mL步骤 1获得的增菌液接种到上述厌氧液体培养基中至体系总体积为25mL（不同底物粗粉在 体系中的浓度均为20mg/mL），37℃厌氧培养8天。

3、样本检测：每24h取样一次，进行HPLC检测分析，根据由肠二醇标准品制作 的标准曲线测定培养液中肠二醇的含量。实验重复三次，结果取平均值。

结果显示，迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）Strain ZL-III CGMCC No.6847、粘 液真杆菌（Eubacterium limosum）Strain ZL-II CGMCC No.6846和单形拟杆菌 （Bacteroides uniformis）Strain I CGMCC No.4897这三株菌的混合菌对不同底物均有 类似于亚对麻子粕的转化作用（每次取样的培养液中均检测到了与肠二醇标准品相同 保留时间Rt=24.1min的色谱峰）。培养到第4天时，发酵液中肠二醇的含量基本保持 稳定（见表4）。

表4.三株菌的混合菌对不同底物培养4天后培养液中肠二醇(END)的含量（mg/L）

底物名称 END的含量（mg/L） 牛蒡子粉(ArctiiFructus) 11.3 海藻籽粉(seaweed) 19.2 油菜子粉(rapeseed) 7.4 黑麦麸(Rye bran) 20.0 燕麦麸(oat bran) 22.6 大麦麸(Barley bran) 20.3 玉米麸(Corn bran) 17.0 小麦麸(Wheat bran) 11.9

五、三株菌对SDG的转化作用的研究

平均称取七份开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（secoisolariciresinoldiglucoside, SDG）加入5mL庖肉培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。选取如下七组菌各0.5mL 分别接种到5mL厌氧液体培养基中，37℃増菌厌氧培养24h，获得对应的七组増菌液。 从所得増菌液中取出500μL培养液接种入含有SDG底物的庖肉培养基中至体系总体 积为5mL（SDG在体系中的浓度为（1mg/mL），每4h取样一次进行HPLC检测，48h 时停止培养。

①单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897菌液，菌体含量 为7×10⁷cfu/mL。

②粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌液，菌体含量 为7×10⁷cfu/mL。

③迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液，菌体含量为 7×10⁷cfu/mL。

④单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和粘液真杆菌 （Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846的混合菌液，具体按照如下 方法制备得到：取单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897 菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）和粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混 合菌液。

⑤单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和迟缓埃格特菌 （Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847的混合菌液，具体按照如下方法 制备得到：取单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897菌 液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混 合菌液。

⑥粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846和迟缓埃格特菌 （Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847的混合菌液，具体按照如下方法 制备得到：取粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌 液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混 合菌液。

⑦单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897、粘液真杆菌 （Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847的混合菌液，具体按照如下方法制备得到：取 粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌液（菌体含量 为7×10⁷cfu/mL）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897 菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混 合菌液。

结果显示（图3）：①单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897 和⑤单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和迟缓埃格特菌 （Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847的混合菌培养液均检测到了与SECO标 准品保留时间（Rt=21.5min）相同的色谱峰，说明这两组菌可转化SDG产生SECO； ④单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和粘液真杆菌 （Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846的混合菌培养液检测到了与DHEND 标准品保留时间（Rt＝18min）相同的色谱峰，说明这组菌能够转化SDG产生DHEND； ⑦单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897、粘液真杆菌 （Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta） ZL-III CGMCC No.6847的混合菌培养液均检测到了与肠二醇标准品保留时间 （Rt=24.1min）相同的色谱峰，说明这组菌能够转化SDG产生肠二醇；而②③⑥组无 反应发生。

以上结果表明（图4）：单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897 能够转化SDG产生SECO，具有脱糖基的作用；粘液真杆菌（Eubacterium limosum） ZL-II CGMCC No.6846能够转化SECO产生DHEND，具有脱甲基的作用；迟缓埃格 特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847能够转化DHEND产生肠二醇，具 有脱羟基的作用。

六、三株菌的混合菌转化多种木脂素类成分产生肠二醇的研究

1、增菌：取粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846菌液（菌 体含量为5×10⁷cfu/mL）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897 菌液（菌体含量为9×10⁷cfu/mL）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847菌液（菌体含量为7×10⁷cfu/mL）各0.5mL，混合后得到混合菌液。取混合 菌液0.5mL，接种到5mL厌氧液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到増菌液。

2、接种：配制厌氧液体培养基，加入不同底物（见表5），用1mL石蜡油覆盖， 121℃高压灭菌15min。将0.5mL步骤1获得的增菌液接种到上述厌氧液体培养基中至 体系总体积为5mL（不同底物在体系中的浓度均为1mg/mL），37℃厌氧培养8天。

3、样本检测：每24h取样一次，进行HPLC检测分析，检测培养液中肠二醇的含 量，根据由肠二醇标准品制作的标准曲线测定培养液中肠二醇的含量。实验重复三次， 结果取平均值。

结果显示，粘液真杆菌（Eubacterium limosum）ZL-II CGMCC No.6846、单形拟 杆菌（Bacteroides uniformis）Strain-I CGMCC No.4897和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）ZL-III CGMCC No.6847这三株菌的混合菌对不同底物均有类似于对SDG的转 化作用（培养液中检测到了与肠二醇标准品相同保留时间Rt=24.1min的色谱峰），在 其培养液中可检测到肠二醇。培养到第4天时，发酵液中肠二醇的含量基本趋于稳定 （见表5）。

表5.三株混合菌液对不同底物培养4天的培养液中肠二醇(END)的含量(mg/L)

底物名称 END的含量(mg/L) 开环异落叶松树脂酚(secoisolariciresinol,SECO) 60.6 罗汉松脂酚(matairesinol,MAT) 70.0 落叶松树脂醇(lariciresinol,LCS) 64.1 松脂醇(pinoresinol,PRS) 52.0

松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinoldiglucoside,PDG) 47.8 丁香树脂酚(syringaresinol,SYG) 60.1 牛蒡苷元(arctigenin,ATG) 69.0 7-羟基罗汉松脂酚(7-hydroxymatariresinol,HYM) 67.2 牛蒡子苷(arctiin,ARC) 60.1 芝麻脂素(sesamin) 57.2