永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途

摘要

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途。本发明要解决的技术问题是为构建永生化人软骨终板干细胞系提供一种有效的制备方法。本发明的技术方案是采用慢病毒转染技术构建永生化人软骨终板干细胞系的制备方法，包括如下步骤：a、构建SV40T抗原病毒载体；b、SV40T抗原基因转染人终板干细胞；c、传代并筛选得到永生化软骨终板干细胞。本发明还提供了由上述方法得到的永生化人软骨终板干细胞系在制备骨组织工程材料中的用途。本发明可应用于组织工程骨的制备，为临床上一系列长骨缺损、骨不连病人提供一种价格低廉、成骨能力强的骨组织工程的种子细胞。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其 用途。

背景技术

临床上常由于某些原因如外伤、感染、肿瘤等造成开放性骨折、骨不连以及骨缺损， 是运动系统疾病中常见和处理困难的疾患，也是患者丧失劳动力的重要原因。解决长骨缺 损、骨不连等需要大量具有良好符合人体生物学、生物力学特性的骨移植材料。为此，许 多学者进行了相关的研究，取得了一些成绩，但是对于长骨缺损，仍然是运动系统疾病中 的难题。随着近年来组织工程技术的兴起，骨缺损的修复研究进入组织工程的时代。目前 的组织工程理论认为，种子细胞、支架材料、生长因子是组织工程的三要素。传统上一般 选用骨髓间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞，但其面临诸多的局限性，包括手术病 人抽取骨髓面临二次创伤，细胞数量受限，是否具备最佳的成骨能力等。比较而言，人软 骨终板干细胞（Cartilage Endplate Stem Cells,CESCs）具有取材方便，不会给病人带来二次 创伤，易于分离培养，体外增殖能力强，同时具有较强的成骨能力。而且CESCs作为其他 非组织工程的种子细胞也具有广阔前景，许多研究证实CESCs具有成体干细胞特性，表现 为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能。由于临床上对骨移植材料的需求量巨 大，同时组织工程技术的发展有望实现骨缺损的理想修复。但是分离原代培养的CESCs随 着传代次数的提高，其活力越来越差，最终发生凋亡，难以存活，因此构建永生化人退变 软骨终板干细胞系具有较强的实用价值，同时为研究人终板干细胞的生物学行为提供标准 细胞系，为组织工程基础研究提供平台，为临床应用提供足量种子细胞，并为建立人退变 软骨终板干细胞系提供一种有效、可靠的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为构建永生化人软骨终板干细胞系提供一种新选择。

本发明的技术方案是永生化人退变软骨终板干细胞系的制备方法，包括如下步骤：

将外源性猴肾病毒SV40T抗原基因转染人终板软骨干细胞而诱导获得永生化人终板软 骨干细胞系；其中，外源性SV40T抗原基因通过构建成慢病毒颗粒转染人终板软骨干细胞； 所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示；包括如下步骤：

a、构建SV40T抗原病毒载体：将表达SV40T抗原基因的逆转录病毒载体和包装载体 共转染人胚肾293细胞系HEK293，包装出表达SV40T抗原的逆转录病毒；

b、慢病毒转染：将人退变软骨终板原代干细胞传至第3代，使细胞密度为3×10³/ml， 按0.5ml/cm²培养面积添加含4μg/ml聚凝胺的逆转录病毒，病毒滴度为1×10⁸TU/ml，感染2 天后，换液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B筛选14天，形成筛选后的干细胞集落；

c、传代：将筛选后的干细胞集落扩增并进行连续传至30代以上，即得到永生化的人 退变软骨终板干细胞系iCESCs，冻存备用。

其中，步骤b中的人退变软骨终板原代干细胞采用如下方法制备：将手术中遗弃的软 骨终板标本，在无菌条件下去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织，得到透明 状的软骨终板；机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞。

其中，步骤b中人退变软骨终板原代干细胞传至第3代的培养条件如下：培养基为 90%DMEM/F12，含10%的FBS（胎牛血清），细胞长满接近培养皿80%后传代。

本发明还提供了由上述方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞系。

本发明还提供了由上述方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞系在制备骨组织工 程材料中的用途。

本发明的有益效果：本发明方法提供一种永生化的人椎间盘软骨终板干细胞的制备方 法。该方法得到的永生化干细胞与原代培养软骨终板干细胞具有相似的生物学特性，能向 骨、软骨及脂肪等方向诱导分化，而且较骨髓间充质干细胞具有更强的成骨分化能力，且 不具成瘤性。本发明提供了永生化人软骨终板干细胞的制备方法以及在骨组织工程中的应 用，主要可应用于组织工程骨的制备，为临床上一系列长骨缺损、骨不连病人提供一种价 格低廉、成骨能力强的骨组织工程的种子细胞。

附图说明

图1.琼脂糖悬浮培养筛选CESCs。A.接种于琼脂糖中的单个细胞。B.培养六周后的单细 胞克隆（黑色箭头）和单个细胞（红色箭头）。C.单细胞克隆的龙胆紫染色。D.经扩增培养 的CESCs。

图2包装的SV40T抗原慢病毒孔内可见病毒空斑。

图3转染后形成的单克隆细胞。

图4单克隆细胞扩大培养后。

图5iCESCs的干细胞标志物流式细胞术检测。A，B为细胞流式实验的结果。A图纵坐标 是对应CD标志物的荧光强度。浅色线是实验组，深色线是阴性对照组。

B图的横坐标是标志物的名称，横坐标下面的stem cell markers为干细胞标志物，Percentage of markers为标志物百分比。

图6iCESCs的体外成骨、成脂及成软骨诱导的组织学及分化相关基因表达的检测。A:正常 培养基，茜素红染色，阴性；B:诱导成骨培养基，茜素红，阳性；C：PCR检测成骨相关基 因表达情况；D：正常培养基，油红O染色，阴性；E：诱导成脂肪培养基，油红O染色， 阳性；F：PCR检测成脂肪相关基因表达情况；G：成软骨诱导培养基，微球培养后成软骨 情况；H：成软骨诱导培养基，微球培养后经阿尔新蓝染色；I：PCR检测成软骨相关基因 情况；J：第三代iCESCs倒置显微镜图片；K：成软骨诱导培养基，微球培养后经阿尔新蓝 染色后行石蜡包埋切片。

图7.A图为永生化后第1代。B图为永生化后第10代。C图为永生化后第30代。D图为 永生化后第50代。

图8植入3个月后动物体内L2-L3横突间干细胞-羟基灰石复合物，箭头所示为BM-MSCs- 羟基灰石复合物，三角所示为iCESCs-羟基灰石复合物。A:解剖标本，B:标本固定后。

图9通过Micro-CT分别选取BM-MSCs组和iCESCs组对应解剖位置的相同大小组织块。 Micro-CT照片显示如图，图A为MSC成骨，图B为iCESC成骨。其中蓝色代表羟基灰石 支架,橙黄色代表新生骨。

图10BM-MSCs组和iCESCs组的TMD值。（*：P<0.05）

具体实施方式

本发明永生化人终板软骨干细胞体系制备方法及体内植骨实验的实施例，通过目的基 因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因慢病毒构建、转染SV40T抗原基因 （SV40TAg），成功转然软骨终板干细胞稳定表达SV40T抗原基因，从而获得永生化软骨 终板干细胞体系，并通过体内植骨实验证实其具有较强的成骨能力。

外源性SV40T抗原的核苷酸序列（SEQ ID No.21）：

ATGGATAAAGTTTTAAACGGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGT GCCTGGGGGAATATTCCTCTGATGAGAAAGGCATATTTAAAAAAATGCAAGGAGTTTCATCCTGATA AAGGAGGAGATGAAGAAAAAATGAAGAAAATGAATACTCTGTACAAGAAAATGGAAGATGGAGTA AAATATGCTCATCAACCTGACTTTGGAGGCTTCTGGGATGCAACTGAGATTCCAACCTATGGAACTG ATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCAT CTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG AAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAAC TCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAA AAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCA CACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGT AAAGGGGTTAATAAGGAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCCATTTTCTGTTATTGAGGA AAGTTTGCCAGGTGGGTTAAAGGAGCATGATTTTAATCCAGAAGAAGCAGAGGAAACTAAACAAG TGTCCTGGAAGCTTGTAACAGAGTATGCAATGGAAACAAAATGTGATGATGTGTTGTTATTGCTTGG GATGTACTTGGAATTTCAGTACAGTTTTGAAATGTGTTTAAAATGTATTAAAAAAGAACAGCCCAGC CACTATAAGTACCATGAAAAGCATTATGCAAATGCTGCTATATTTGCTGACAGCAAAAACCAAAAAA CCATATGCCAACAGGCTGTTGATACTGTTTTAGCTAAAAAGCGGGTTGATAGCCTACAATTAACTAG AGAACAAATGTTAACAAACAGATTTAATGATCTTTTGGATAGGATGGATATAATGTTTGGTTCTACAG GCTCTGCTGACATAGAAGAATGGATGGCTGGAGTTGCTTGGCTACACTGTTTGTTGCCCAAAATGGA TTCAGTGGTGTATGACTTTTTAAAATGCATGGTGTACAACATTCCTAAAAAAAGATACTGGCTGTTTA AAGGACCAATTGATAGTGGTAAAACTACATTAGCAGCTGCTTTGCTTGAATTATGTGGGGGGAAAGC TTTAAATGTTAATTTGCCCTTGGACAGGCTGAACTTTGAGCTAGGAGTAGCTATTGACCAGTTTTTAG TAGTTTTTGAGGATGTAAAGGGCACTGGAGGGGAGTCCAGAGATTTGCCTTCAGGTCAGGGAATTA ATAACCTGGACAATTTAAGGGATTATTTGGATGGCAGTGTTAAGGTAAACTTAGAAAAGAAACACCT AAATAAAAGAACTCAAATATTTCCCCCTGGAATAGTCACCATGAATGAGTACAGTGTGCCTAAAACA CTGCAGGCCAGATTTGTAAAACAAATAGATTTTAGGCCCAAAGATTATTTAAAGCATTGCCTGGAAC GCAGTGAGTTTTTGTTAGAAAAGAGAATAATTCAAAGTGGCATTGCTTTGCTTCTTATGTTAATTTGG TACAGACCTGTGGCTGAGTTTGCTCAAAGTATTCAGAGCAGAATTGTGGAGTGGAAAGAGAGATTG GACAAAGAGTTTAGTTTGTCAGTGTATCAAAAAATGAAGTTTAATGTGGCTATGGGAATTGGAGTTT TAGATTGGCTAAGAAACAGTGATGATGATGATGAAGACAGCCAGGAAAATGCTGATAAAAATGAAG ATGGTGGGGAGAAGAACATGGAAGACTCAGGGCATGAAACAGGCATTGATTCACAGTCCCAAGGC TCATTTCAGGCCCCTCAGTCCTCACAGTCTGTTCATGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGG TTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACA

实施例1CESCs的获取、分离和鉴定

制定标本来源的病例纳入标准：经患者知情同意，年龄小于65岁，大于30岁；无结 核、肝炎、肿瘤、糖尿病等传染性疾病及自身免疫性疾病；行颈椎、胸椎和腰椎融合手术。

将手术中遗弃的软骨终板标本，在无菌条件下用解剖显微镜对软骨终板标本进行分离， 去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织，用尖刀仔细刮除粘附于软骨终板上的 髓核，剩下透明状的软骨终板，并经苏木精-伊红染色法确认(Huang B,Liu LT,Li CQ,et al. Study to determine the presence of progenitor cells in the degenerated human cartilage endplates. Eur SpineJ,2012,21:613-622)。机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞，并以台盼蓝测定细 胞活力。将获取到的原代细胞置于37℃、5%CO2、95%湿度条件下孵箱培养，倒置相差显 微镜每天观察细胞生长情况，每3天换液1次。

机械-胶原酶法具体操作如下：将手术中获取的椎间盘标本，无菌状态下在超净台紫外 灯照射30分钟，以含1%庆大霉素的磷酸盐缓冲液漂洗标本组织直到无血迹，在解剖显微 镜下对椎间盘标本组织进行分离，去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织，用 尖刀仔细刮除粘附于软骨终板上的髓核组织，剩下透明状的软骨终板。眼科剪将剩下的软 骨终板剪至1mm×1mm×1mm大小，将剪碎的组织用0.25%Ⅱ型胶原酶于37℃消化6小 时或先于摇床1小时，再于37℃消化4小时。将软骨终板组织消化液经孔径为100μm 或200目的滤网过滤，滤液在1000转/分钟条件下离心5分钟，所得沉淀用含10%胎牛血清 的Dulbecco改良Eagle培养基洗涤遍，再以该培养基悬浮细胞，吹打使其成为单细胞悬液， 然后铺板于细胞培养瓶或培养皿上。

将长满近90%培养瓶的软骨终板干细胞用胰蛋白酶消化传代时，以琼脂糖筛选系统筛 选干细胞，如图1所示，A图为接种于琼脂糖中的单个细胞。B图为培养六周后的单细胞 克隆（黑色箭头）和单个细胞（红色箭头），C图为单细胞克隆的龙胆紫染色。挑选细胞克 隆，置于培养瓶于37℃、5%CO₂孵箱培养扩增、传代，如图1D所示为经扩增培养的CESCs。

实施例2构建编码SV40T抗原的慢病毒载体以及病毒颗粒包装

构建编码SV40T抗原慢病毒载体：将慢病毒载体质粒pWPT-GFP（上海吉凯基因化学 技术有限公司）用NEB公司的BamHⅠ和SalⅠ酶进行双酶切释放出GFP，酶切条件为50μl 反应体系中BamHⅠ和SalⅠ的量分别加入1μl，37℃孵育30min。最后将酶切产物进行1% 低熔点琼脂糖凝胶电泳，用德国Qiagen公司凝胶回收试剂盒回收载体pWPT片段。将质粒 Plox-Ttag-iresTK（上海吉凯基因化学技术有限公司）和质粒Plox-SV40-iresTK（上海吉凯 基因化学技术有限公司）用SalⅠ和EcoRI进行双酶切，酶切条件为37℃30min，65℃20min 使酶灭活；然后将两端抹平，方法是在上述反应结束后向反应体系加入1μl Klenow酶和2mM dNTP,室温放置15min，75℃,25min，最后再加入0.25μl cip酶于37℃孵育30min。最后将 酶切产物进行1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，用德国Qiagen公司凝胶回收试剂盒回收SV40T 抗原片段。将该片段测序后进行基因序列比对证实：SV40T抗原片段与Genebank No.J02400 的nt2691-5163序列相同。随后将得到的目的基因片段（SV40T抗原片段）与回收的载体 片段连接，连接反应条件为：使用T4连接酶，16℃过夜。如此得到编码SV40T抗原基因 的pWPT-SV40Tag载体。

慢病毒颗粒的包装：将293T细胞培养在含10%FCS、100μg/ml青/链霉素的DMEM中， 转染前24h将其以3×10⁶细胞/皿接种在100mm的培养皿中。转染前2h更新新鲜培养基。 每个培养皿转染20μg质粒DNA，其中包括：10μg转染质粒（pWPT-SV40Tag），3.5μg衣 壳编码质粒和6.5μg包装质粒。将此20μg质粒载体用0.1×TE溶液（1mM Tris-HCl和0.1mM EDTA)重悬至体积450μl，再加入50μl的2.5M CaCl₂溶液，轻轻混匀。然后一边漩涡混匀 一边逐滴加入500μl的2×HEPES缓冲盐溶液(0.1M HEPES,0.281 M NaCl，和1.5mM Na₂HPO₄室温放置30min,然后将混合物加到人胚肾293细胞系(HEK293)上， 慢慢加入悬液，边加边轻轻震动皿中的培养基。然后将培养皿放入37℃培养箱培养。16h 后更新10ml新鲜培养基。以后每隔24h收集并更换一次培养基，收集的上清通过900g离 心10min以去除细胞碎片，用0.2μm孔径的针头滤器过滤。通过上述方法包装具有感染能 力但复制缺陷的带SV40 T抗原基因的慢病毒颗粒，然后直接使用或冻存在-80℃备用。如 图2可见包装的SV40T抗原慢病毒孔内也可见病毒空斑。

实施例3慢病毒颗粒感染人软骨终板干细胞

将传至第3代的CESCs细胞种植于T25细胞培养瓶并加入2ml含4μg/ml聚凝胺的慢 病毒颗粒，转染后的软骨终板干细胞如图3所示。感染2天后，应用0.4mg/ml的潮霉素B 筛选14天，形成筛选后的细胞集落，如图4所示。将筛选后的干细胞集落扩增并进行连续 传至30代以上，即得到永生化的人退变软骨终板干细胞系iCESCs，冻存备用。

实施例4永生化终板干细胞的安全性评价

取对数生长期的实施例3中获得的永生化终板干细胞(immortalized CESCs，iCESCs)， 用Hank’s液(1 37.93mM NaCl，5.33mM KCl，4.1 7mM NaHCO₃,1.26mM CaCl₂，0.493mM MgCl₂,0.441mM KH₂PO₄,0.338m Na₂HPO₄,5.56Mm D-葡萄糖)洗涤2次后重悬于DMEM/F12 基础培养基中，将细胞接种于5只BALB/c裸鼠(第三军医大学动物实验中心)皮下，每 个点接种5×10⁶个细胞。另一组裸鼠同时于皮下相同部位接种肝癌细胞株BEL-7402(ATCC， 美国)作为阳性对照，每个点接种5×10⁶个细胞作为阳性对照。接种后连续观察6个月，结 果在接种iCESCs的裸鼠的皮下无肿瘤形成，而在相同部位接种同样数量的肝癌细胞 BEL-7402裸鼠皮下在移植1个月后均有肿瘤形成。

实施例5永生化终板干细胞表面标志物检测

iCESCs经体外培养扩增后，运用流式分析检测iCESCs的表面抗原，结果如图5所示， CD105,CD73,CD90,CD44,CD166和STRO1为阳性，单个核细胞标志CD14，造血干细胞标 志CD34，B细胞标志CD19，血细胞标志CD105，2型HLA抗原HLA-DR均为阴性。流 式检测结果提示iCESCs符合间充质干细胞表面标志物标准。

实施例6 iCESCs体外成骨、成脂及成软骨诱导实验

iCESCs体外成骨组织学及PCR：

在24孔板中，每孔铺上1.5×10⁴细胞的iCESCs。分别在正常生长培养基中和成骨诱导 培养基中培养3周后，正常培养组茜素红染色为阴性，如图6(A)。诱导培养基组茜素红 染色为阳性，如图6（B），可见大量钙结节形成。PCR检测成骨相关基因表达情况如图6 （C），OC，ALP，RUNX2在正常培养基组（G）表达为阴性，在成骨诱导组（O）表达为 阳性，GAPDH为内参。证实iCESCs在成骨诱导培养基中具有成骨能力。

所用到的引物序列如下：

OC：

上游引物：AGGGCAGCGAGGTAGTGAAGA（SEQ ID No.1）

下游引物：CTAGACCGGGCCGTAGAAGC（SEQ ID No.2）

ALP：

上游引物：CTTGACCTCCTCGGAAGACACT（SEQ ID No.3）

下游引物：ACCTTGTAGCCAGGCCCATT（SEQ ID No.4）

RUNX2：

上游引物：CTTCCAGACCAGCAGCACTCC（SEQ ID No.5）

下游引物：GCTTCCATCAGCGTCAACACC（SEQ ID No.6）

GAPDH:

上游引物:TGGGGTGATGCTGGTGCTGAGT（SEQ ID No.7）

下游引物:AGGTTTCTCCAGGCGGCATGT（SEQ ID No.8）

iCESCs体外成脂组织学及PCR：

在24孔板中，每孔铺上5×10³细胞的iCESCs。分别在正常生长培养基中和成脂诱导培 养基中培养3周后，正常培养组油红O为阴性，如图6（D）。诱导培养基组茜素红染色为 阳性，如图6（E），可见大量脂肪空泡形成。PCR检测成脂相关基因表达情况如图6（F）， LPL,APP,PPAR2在正常培养基组（G）表达为阴性，在成骨诱导组（A）表达为阳性，GAPDH 为内参。证实iCESCs在成脂诱导培养基中具有成脂能力。

所用到的引物序列如下：

LPL:

上游引物:TTGAGAAAGGGCTCTGCTTGA（SEQ ID No.9）

下游引物:TTGTAGGGCATCTGAGAACGA（SEQ ID No.10）

APP:

上游引物:CAAGCAGTGCAAGACCCATC（SEQ ID No.11）

下游引物:AGAAGGGCATCACTTACAAACTC（SEQ ID No.12）

PPAR2:

上游引物:GAGTTCGCCAAGAGCATCCC（SEQ ID No.13）

下游引物:CCCGTCCTTGTTGACGATAGAG（SEQ ID No.14）

iCESCs体外成软骨组织学及PCR：

在24孔板中，每孔铺上3×10⁵细胞的iCESCs，如图6（G）。消化悬浮离心成球后分 别在正常生长培养基中和成软骨诱导培养基中行微球培养（Micropallets Culture）3周后， 显示正常培养组阿尔新蓝染色为阴性，如图6（G）。诱导培养基阿尔新蓝染色为阳性，如 图6（K），可见细胞外基质形成（蓝色）。将诱导组行石蜡包埋切片染色，如图6（K），证 实阿尔新蓝染色阳性。PCR检测成软骨相关基因表达情况如图6（I），COL-2，AGG,SOX-9 在正常培养基组（G）表达为阴性，在成软骨诱导组（C）表达为阳性，GAPDH为内参。 证实iCESCs在成软骨诱导培养基中具有成软骨能力。

所用到的引物序列如下：

COL-2:

上游引物:CCTTCCTACGCCTGCTGTCC（SEQ ID No.15）

下游引物:GAACCTGCTATTGCCCTCTGC（SEQ ID No.16）

AGG:

上游引物:GTGCGGGTCAACAGTGCCTAT（SEQ ID No.17）

下游引物:GCCTTTCACCACGACTTCCAG（SEQ ID No.18）

SOX-9:

上游引物:TGAAGATGACCGACGAGCAGG（SEQ ID No.19）

下游引物:GCGTCCAGTCGTAGCCTTTGAG（SEQ ID No.20）

实施例7iCESCs体外连续传代扩增

在T25细胞培养瓶中加入DMEM/F12，10%FCS行连续体外扩增培养（培养条件是37 ℃，5%CO2细胞培养箱。传代操作为：将长满近90%的细胞培养瓶或培养皿吸弃培养基， 加入磷酸盐缓冲液漂洗2遍，加入胰蛋白酶消化细胞约1-2分钟，显微镜下观察见少量细胞 脱落时加入1ml含10%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离瓶底，将 细胞吸取移入离心管以1000转/分钟，离心5分钟，弃上清，磷酸缓冲液漂洗2遍，用含 10%胎牛血清培养基轻轻吹打使细胞变成单细胞悬液，取10μl悬液进行细胞计数，用培养 基调整为3×104/ml，并铺细胞于新的培养瓶或培养皿上。如图8（A）为永生化后第1代。 图8（B）为永生化后第10代。图8（C）为永生化后第30代。图8（D）为永生化后第50 代。观察可发现连续体外传代扩增后，细胞外形变化不明显，细胞增殖速度固定。

实施例8iCESCs与骨髓间充质干细胞复合生物材料后横突间植骨实验

将iCESCs与骨髓间充质干细胞分别在体外复合羟基灰石支架（包含其他相关生物复合 材料），于新西兰大白兔L2-L3横突间植骨,如图8。3个月后观察成骨差异，以BM-MSCs （骨髓间充质干细胞）为对照组，该细胞是目前最常用的骨组织工程的种子细胞。行MicroCT （microcomputedtomography，微计算机断层扫描技术），如图9所示，经MicroCT中软件 测定BMD（骨矿物质密度，Bonemineraldensity），TMD（组织矿物质密度，Tissuemineral density）值（见表1），经统计后得到TMD值差异具有统计学意义，见图10，提示永生化 终板干细胞具有明显强于骨髓间充质干细胞的体内成骨能力。

表1MicroCT结果