鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用

摘要

本发明公开了一种对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用。该细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：C2013179。该异育银鲫脑组织细胞系生长状态良好，对目前难以用常见鱼类细胞系培养的CyHV-2敏感；CyHV-2在GiCB细胞上连续传代至第6代仍可检测到病毒核酸且细胞病变稳定；将出现病变效应的细胞做超薄电镜切片，可在GiCB细胞中观察到大量CyHV-2成熟病毒粒子及其复制过程。本发明所构建的异育银鲫脑组织细胞系的构建方法重复性强，条件科学合理，适用于体外培养鲤疱疹病毒Ⅱ型，为鲤疱疹病毒Ⅱ型的分离、检测、培养及其完整的生物学特性研究提供了技术平台。

说明书

技术领域

本发明属于水生生物细胞领域和水产养殖病害防控技术领域，具体涉及鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系，还涉及该细胞系的建立方法，还涉及该细胞系的应用。 

背景技术

鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirusⅡ，CyHV-2）又被称为疱疹病毒性造血器官坏死病病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis virus，HVHNV）或金鱼造血器官坏死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV），与鲤科鱼类的其他两种疱疹病毒CyHV-1（Carp pox）和CyHV-3（Koi herpesvirus，KHV）同属Alloherpesviridae科，Cypriniviruse属。CyHV-2于1995年首次被报道，1992～1993年间给日本西部养殖的金鱼造成巨大的经济损失，患病金鱼死亡率高达100%。随后其他国家和地区也相继有了该病暴发的报道，1997年春季在美国西海岸一用循环水养殖的金鱼幼鱼出现大量死亡，死亡率高达80%以上，后经证实是由CyHV-2感染。观赏鱼的国际贸易很大程度上促进了该病的全球传播，随后我国台湾、澳大利亚、英国养殖的金鱼相继暴发该病。2011年匈牙利报道了养殖的银鲫也发现了CyHV-2感染。2009年起，在我国鲫鱼的主要养殖区江苏省暴发了由CyHV-2引起的鲫鱼造血器官坏死病，截至2012年6月中旬，江苏省内射阳、大丰、盐都、宝应、高邮、兴化、洪泽、楚州等地病害发生面积超过10万亩，发病塘口的死亡率高达90%，造成的经济损失已达数亿元。与此同时，在湖北、湖南、江西、黑龙江等省份，也相继在患病鲫鱼体内检测出CyHV-2。该病毒传染性强、致死率高，给鲫鱼、金鱼养殖业造成了重大的经济损失，严重威胁鲫鱼、金鱼养殖业的发展。 

细胞培养分离技术是最准确的病毒病诊断方法，通常是世界动物卫生组织(OIE)推荐的鱼类病毒检测的首选方法。但已有研究发现CyHV-2很难在鱼类病毒分离常用的细胞系中进行增殖。胖头鲤细胞（fathead minnow cells,FHM)、鲤鱼上皮瘤细胞（epithelioma popuasum cuprini,EPC)、鳗鲡肾细胞（eel kidney,EK-1)、鲑鱼胚胎细胞（chinook salmon embryo,CHSE-214)、虹鳟鱼性腺细胞（rainbow trout gonad,RTG-2)和罗非鱼卵巢细胞（tilapia ovary，T0-2)均对CyHV-2不敏感，仅锦鲤鳍细胞（koi fin1，KF-1)能产生细胞病变效应（CPE)，但病毒在KF-1细胞上传至第3代后，CPE消失且检测不到病毒核酸。由于缺乏CyHV-2敏感的细胞系，限制了对CyHV-2的研究，因此建立对CyHV-2敏感的细胞系并研究该细胞系的生物学特性，对CyHV-2进行连续传代扩大培养从而深入研究病毒的特性，具有重要的意义。本发明建立了用于分离培养鲤疱疹病毒Ⅱ型的敏感细胞系GiCB，该细胞系的应用还包 括但不局限于：分子细胞水平上开展鲤疱疹病毒Ⅱ型及其他鱼类病毒理化特性、形态发生、病毒感染途径、感染机理；制备、筛选或评价鱼类抗病毒药物。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系。该细胞系可用于分离，检测，分离培养鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒。该细胞系已于2013年11月29日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：异育银鲫脑组织细胞系（Gibel carp,Carassius auratus gibelio）GiCB，保藏编号：CCTCC NO：C2013179，地址：中国武汉武汉大学。 

本发明的另一个目的在于提供了一种鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的建立方法，方法简单，易行。 

本发明最后一个目的在于提供了一种鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的应用。该细胞系可以用于分离、检测和培养鲤疱疹病毒Ⅱ型；用于对CyHV-2进行体外连续传代、扩大培养从而深入研究该病毒的特性。 

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施： 

一种鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的建立方法，步骤如下： 

（1）脑组织的处理：无菌条件下取出异育银鲫脑组织，无菌处理为50～100mm³的组织块；（2）原代培养：将步骤（1）中的组织块放入组织分离专用胰蛋白酶消化液中消化10～15min，期间震荡3～4次，加入等体积的异育银鲫脑组织细胞专用培养液（以下简称为培养液），吹打均匀，离心收集经消化处理的细胞，吸弃上清，添加培养液，吹打细胞沉淀，将制成的细胞悬液加入细胞培养瓶中培养，每2天半量更换培养液一次； 

（3）传代培养：原代培养异育银鲫脑组织细胞长成单层后，加入0.25%W/V的胰蛋白酶消化液静置消化2分钟，用培养液悬起细胞，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养。待细胞再次形成单层后，按照上述的细胞的传代培养方法进行下一次传代培养，得到来源于异育银鲫脑组织的鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感细胞系GiCB，该细胞系已于2013年11月29日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：异育银鲫脑组织细胞系（Gibel carp,Carassius auratus gibelio）GiCB，保藏编号：CCTCC NO：C2013179，地址：中国武汉武汉大学。 

异育银鲫脑组织细胞系GiCB，为成纤维细胞样细胞，最佳培养基为M199，最适血清体积分数为20%（V/V），最适培养温度为25℃。GiCB细胞经液氮冷冻后复苏，通过染色，约80%的细胞具有细胞活性，并保持原有生长状态，该细胞已经稳定传代65次。 

所述的组织分离专用胰蛋白酶消化液为0.5%～0.7%W/V胰蛋白酶消化液，细胞培养、传代的温度为25～28℃，pH值7.0～7.4。 

所述的异育银鲫脑组织细胞专用培养液为含有10～20%V/V胎牛血清、10～20ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、10～20ng/ml人表皮细胞生长因子、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B，pH值7.0～7.4的M199培养液。 

一种鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的应用，包括该细胞系在鲤疱疹病毒Ⅱ型培养上的应用；该细胞系在鲤疱疹病毒Ⅱ型检测上的应用；该细胞系在鲤疱疹病毒Ⅱ型分离上的应用；该细胞系在制备鲤疱疹病毒Ⅱ型病疫苗上的应用；该细胞系在其他鱼类病毒分离检测上的应用；该细胞系在作为抗鲤疱疹病毒Ⅱ型药物筛选生物模型上的应用；该细胞系在鱼类细胞的基因转染和研究基因功能上的应用。 

所述的鲤疱疹病毒Ⅱ型为鲤疱疹病毒Ⅱ型野生毒株或已报道的鲤疱疹病毒Ⅱ型分离株。 

利用巢式PCR检测方法，对在GiCB细胞上进行连续传代的鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA检测验证，结果证实在GiCB细胞连续传代第6代仍可检测到病毒核酸；细胞病变效应（CPE）稳定且明显；将出现病变效应的细胞做超薄电镜切片观察，透射电镜结果显示，在GiCB细胞中存在CyHV-2成熟病毒粒子及其复制过程，证明CyHV-2在GiCB细胞中具有良好的生物学活性。 

对送检的CyHV-2疑似临床病料，在巢式PCR检测为阳性的基础上，利用本发明所建立的GiCB细胞系接种疑似病料后，12d即可观察到细胞空泡化、细胞相互融合、细胞单层脱落等细胞病变；对送检的CyHV-2疑似临床病料进行连续传代超过5次，巢式PCR仍可检测到该病毒的存在。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

（1）已有研究发现CyHV-2很难在鱼类病毒分离常用的细胞系中进行增殖。胖头鲤细胞（fathead minnow cells,FHM)、鲤鱼上皮瘤细胞（epithelioma popuasum cuprini,EPC)、鳗鲡肾细胞（eel kidney,EK-1)、鲑鱼胚胎细胞（chinook salmon embryo,CHSE-214)、虹鳟鱼性腺细胞（rainbow trout gonad,RTG-2)和罗非鱼卵巢细胞（tilapia ovary，T0-2)均对CyHV-2不敏感，仅锦鲤鳍细胞（koi fin1，KF-1)能产生细胞病变效应（CPE)，但病毒在KF-1细胞上传至第3代后，CPE消失且检测不到病毒核酸。而本发明采用分离培养对CyHV-2易感的异育银鲫的脑组织细胞，建立了对CyHV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系； 

（2）本发明对在GiCB细胞上进行连续传代的鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA检测验证，结果证实在GiCB细胞连续传代第6代仍可检测到病毒核酸；细胞病变效应（CPE）稳定且明显；将出 现病变效应的细胞做超薄电镜切片观察，透射电镜结果显示，在GiCB细胞中存在CyHV-2成熟病毒粒子及其复制过程，证明CyHV-2在GiCB细胞中具有良好的生物学活性。 

本发明立足于鲤疱疹病毒Ⅱ型的分离、检测及培养，建立CyHV-2敏感细胞系GiCB，为CyHV-2的分离鉴定及其完整的生物学特性的研究提供了必要的技术平台，为鲫鱼、金鱼造血器官坏死症的防控奠定了重要的基础。 

附图说明

图1为不同代次异育银鲫脑组织细胞GiCB示意图。 

图1中A为原代异育银鲫脑组织细胞；图1中B为第32代异育银鲫脑组织细胞系。 

图2为第6代异育银鲫脑组织细胞系的染色体及其数目分布示意图。 

图3为异育银鲫脑组织细胞系感染CyHV-2后示意图。 

图3中A为GiCB正常对照细胞；图3中B为GiCB细胞感染CyHV-2第1代12d；图3中C为GiCB细胞感染CyHV-2第3代12d；图3中D为GiCB细胞感染CyHV-2第6代12d。 

图4为不同培养代次CyHV-2的巢式PCR检测结果示意图。 

M：DL2000Marker；Line1：CyHV-2组织毒对照；Line2：第1代GiCB细胞培养CyHV-2细胞毒；Line3：第2代GiCB细胞培养CyHV-2细胞毒；Line4：第3代GiCB细胞培养CyHV-2细胞毒；Line5：第4代GiCB细胞培养CyHV-2细胞毒；Line6：第5代GiCB细胞培养CyHV-2细胞毒；Line7：第6代GiCB细胞培养CyHV-2细胞毒；Line8：阴性对照 

图5为第5代CyHV-2细胞毒感染GiCB的细胞电镜超薄切片示意图。 

具体实施方式

以下为结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均应涵盖在本发明的保护范围之内，本发明实施例所用试剂，如未特别说明，均购自生化商店；所用实验技术，如未特别说明，均为常规技术。 

本发明具体实施例中涉及的材料及试剂： 

1）实验鱼与毒株 

异育银鲫，体重约50g，体长约12cm，来源于中国水产科学研究院长江水产研究所窑湾实验基地。实验前于室内暂养1周。鲤疱疹病毒Ⅱ型由本实验室分离保存。 

2）主要试剂与耗材 

M199细胞培养基、两性霉素B、青霉素/链霉素、磷酸缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA、二甲基亚砜（DMSO）、秋水仙素均购自Sigma公司；人碱性成纤维细胞生长因子、人表皮细胞生长因子为Peprotech公司产品；胎牛血清购自GIBICO公司；DNAzol核酸提取试剂为Invitrogen产品;PCR用rTaq酶、dNTPs为TaKaRa公司产品。细胞培养瓶、移液管、细胞冻存管均购自Corning公司；制备透射电镜超薄切片所需试剂及耗材均购自北京中兴百瑞公司。 

3）主要仪器设备 

II级生物安全柜(ESCO);倒置显微镜(Nikon);CCD相机(Nikon NIS Elements F530);低速冷冻离心机(3K15,Sigma);恒温培养箱(Sanyo,MIR-153);液氮罐(MVE)；超薄切片机（UC7,Leica）；透射电子显微镜（H-7650，Hitachi） 

实施例1： 

异育银鲫脑组织细胞系的建立，其步骤如下： 

（1）脑组织的处理：无菌条件下取出异育银鲫脑组织置于培养皿中，PBS漂洗3次，用灭菌的眼科剪子剪成50～100mm³的组织块； 

（2）原代培养：将剪碎的组织块放入0.5W/V%胰蛋白酶消化液中28℃消化15min，期间震荡3次，消化结束后加入等体积的异育银鲫脑组织细胞专用培养液（以下简称为培养液，培养液配方为含有20V/V%胎牛血清、10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml人表皮细胞生长因子、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B的M199培养基），吹打均匀后用100目尼龙纱网过滤一次，收集过滤液至离心管中，1500rpm离心5min收集经消化过滤处理的细胞，吸弃上清，再加入培养液吹打均匀后用300目尼龙纱网过滤一次，收集过滤液，1000rpm离心5min得到细胞沉淀；添加培养液，吹打细胞沉淀，将制成的细胞悬液加入25cm²细胞培养瓶中,25℃培养，每2天半量更换培养液一次； 

（3）传代培养：原代培养异育银鲫脑组织细胞长成单层后，吸弃原培养液，加入2ml0.25W/V%的胰蛋白酶消化液室温静置消化2分钟，吸弃胰蛋白酶消化液，加入10ml异育银鲫脑组织细胞专用培养液，吹打瓶底细胞制成细胞悬液，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养。待细胞再次形成单层后，按照上述的细胞的传代培养方法进行下一次传代培养，至细胞系建立。当传代培养至第6代后，异育银鲫脑组织细胞专用培养液中不再添加人碱性成纤维细胞生长因 子、人表皮细胞生长因子、青霉素、链霉素、两性霉素B。传代GiCB细胞约2天或3天即可铺满细胞培养瓶底部80%左右形成汇合细胞单层，5天可形成致密细胞单层，即可进行下次传代培养。如图1所示，A为原代异育银鲫脑组织细胞；B为第32代异育银鲫脑组织细胞系。 

该细胞系已于2013年11月29日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号：CCTCC NO.C2013179，分类命名：异育银鲫脑组织细胞系GiCB，地址：中国武汉武汉大学。 

实施例2： 

异育银鲫脑组织细胞系GiCB的生物学特性： 

（1）形态学：细胞类型为成纤维样细胞。 

（2）生长特性：传代的GiCB细胞30min后开始贴壁，8h后贴壁完全；群体倍增时间为50.5h。 

（3）稳定性：异育银鲫脑组织细胞系GiCB至申请日前已传至65代，增殖稳定。 

（4）冻存与复苏： 

GiCB细胞复苏后贴壁快速,生长形态、状况与没有冻存的细胞基本相似,未出现明显差别。复苏细胞用台盼蓝染色,经细胞统计计数,约(80.38±5.10)%的细胞不着色,具有细胞活性。 

（5）染色体分析 

第6代异育银鲫脑组织细胞系GiCB处于对数生长期，加入终浓度为20μg/ml的秋水仙素，25℃孵育4h后消化收集细胞，用0.075mol/L的KCl溶液低渗处理25min后加入预冷的卡诺固定液，1000rpm离心5min去上清后再用预冷的卡诺固定液固定3次，每次15min。冷滴片法滴片，干燥后用5%Giemsa染色25min，干燥后显微镜观察。在观察的100个分裂相细胞中，第6代异育银鲫脑组织来源细胞的染色体众数为212条（图2），与人工培育四倍体异育银鲫（桂建芳等，异育银鲫人工繁育群体中复合四倍体的发现及其育种潜力，科学通报，1992,07：646-648；桂建芳等，人工复合四倍体异育银鲫雌核发育生殖方式的初步证明，科学通报，1992,09：836-838）体染色体特征吻合，即银鲫的全部染色体162条加鲤鱼的一个染色体组（50条染色体）。 

实施例3： 

鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系的应用，其过程如下： 

（1）感染鲤疱疹病毒Ⅱ型病料的采集及处理 

采集刚死亡的感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的病鱼肾脏和脾脏，剪碎并加等体积PBS匀浆，6000rpm4℃离心30min后经0.22μm滤膜过滤制备成无菌组织匀浆液，分装后保存与-80℃备用； 

（2）鲤疱疹病毒Ⅱ型在GiCB的增殖 

GiCB培养至细胞单层80%后，弃去培养基经PBS清洗2遍后，将上述处理过的病料组织匀浆液上清1ml接种于GiCB细胞单层，加入终浓度为10μg/μl聚凝胺（Polybrene），25℃吸附2h,期间每隔15～20min轻微晃动培养瓶一次以便均匀吸附。待吸附结束后，换血清浓度为2%的M199维持液继续25℃培养，逐日观察细胞病变（CPE），至病变达80%后收获病毒。 

（3）鲤疱疹病毒Ⅱ型细胞毒核酸的提取及巢式PCR检测 

将出现明显病变的GiCB细胞反复冻融2次后经DNAzol提取病毒DNA。利用巢式PCR检测CyHV-2的方法检测该病毒。外引物P1的PCR扩增，引物 

CyHV-2P1F为：TGAAATGTCAAAAGTGGATGG； 

CyHV-2P1R为：TATTCCCAGACAGCCTTCAAA 

取扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30个循环后72℃5分钟；内引物P2的PCR扩增，引物 

CyHV-2P2F为：GAACACCGCTGCTCATCATC 

CyHV-2P2R为：ACTCTTCGCAAGTCCTCACC 

取1μL外引物Pl的扩增产物作为模板，以内引物Ρ2为引物进行PCR扩增，反应条件与第一次扩增相同。同时取阳性对照DNA模板做阳性对照，取纯水做阴性对照。扩增产物经2%(W/V)琼脂糖凝胶电泳鉴定。 

（4）鲤疱疹病毒Ⅱ型感染GiCB的电镜观察 

将感染第5代CyHV-2细胞毒的GiCB细胞经2%戊二醛固定后，四氧化锇再固定，再经脱水包埋后进行超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，透射电镜观察。 

（5）结果 

鲤疱疹病毒Ⅱ型病鱼组织匀浆接种与GiCB细胞单层10d后出现细胞变圆或空泡化、回缩、形成合胞体、细胞间隙变大；12d后GiCB细胞融合并形成多核巨细胞、细胞单层脱落产生拉网现象，出现典型的细胞病变效应（CPE），并且传代至第6代CPE稳定（图3），而正常的GiCB细胞未见任何变化。 

提取不同培养代数的CyHV-2细胞培养物DNA，进行巢式PCR检测，经过两轮PCR扩增得到357bp的片段，与阳性对照的扩增条带大小一致（图4），结果均判定为阳性。 

通过透射电镜观察感染第5代CyHV-2细胞毒的GiCB细胞，可观察到大量成熟的CyHV-2病毒粒子及其复制过程，说明CyHV-2在GiCB细胞中具有良好的生物学活性（图5），进一步证明了本发明所建立的异育银鲫脑组织细胞系对病毒的敏感性，可用于病毒的分离，培养及检测。同时，可作为研究鲤疱疹病毒Ⅱ型生物学特性的细胞模型，制备鲤疱疹病毒Ⅱ型的疫苗及抗病毒药物筛选。