生物标记的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶

摘要

本发明公开了一种生物标记的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶，是在碱性磷酸酶的氨基端、羧基端分别以生物方式各连接一个生物素分子构建而成，该重组生物素标记酶一经产生即为双分子生物素定点标记的重组碱性磷酸酶，其酶学活性不受标记因素影响。构建方法为：首先，构建具有两个可生物素化序列及蛋白质连接柔性Linker的中间载体，然后利用PCR技术将碱性磷酸酶基因克隆至两个可生物素化序列的中间，细菌表达体系表达获得重组碱性磷酸酶。本发明的重组碱性磷酸酶，在BAS体系的酶免疫分析中可与链霉亲和素或亲和素形成网状的放大结构，可有效提高BAS酶免疫分析的灵敏度与特异性，以及可减少标记酶的用量，降低检测成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物标记的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶，及其构建方法与应用， 属于基因工程和免疫学领域。

背景技术

生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）是以生物素和亲和素具有的独特结 合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、 稳定，并具有多级放大效应。目前，BAS技术已在整个生物学领域中得到广泛应用，成为当 今生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的技术之一。

碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AP）是酶免疫测定中较为常用的免疫标记用酶。 在ELISA中应用，尽管AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP 较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原 因，因此国内在ELISA中一般均采用HRP。

生物素化酶（生物素-酶偶联物）BAS体系应用与酶免疫分析的关键构件，当前生物素化 酶的主要制备方式是以化学共价偶联标记为主，该技术是利用酶分子内-NH₂、-CHO或-SH等 活性位点通过化学法与活化生物素共价偶联得到生物素化酶，文献报到多种化学标记方式， 但实际上不同之处仅在于标记物被转换为反应性衍生物的方式不同。尽管一个酶分子可被多 个生物素标记是BAS体系应用与酶免疫分析的应用基础，但是生物素与酶分子内的活性基团 是一种随机结合方式，当反应基团的氨基酸残基位于酶活性位点或附近时势必影响酶活性， 导致生物素化酶的酶学活性不均一，从而影响免疫分析的特异性、稳定性与灵敏度。

有研究报道化学标记方式获得的生物素化碱性磷酸酶，标记后其酶学活性降低30～60% （Porstmann T,Kiessig ST.Enzyme immunoassay techniques.An overview.J Immunol  Methods.1992，150(1-2):5-21.），尽管残余活性仍能发挥其酶学催化作用，但需要增加反 应体系中的酶分子数以弥补标记后酶学活性降低所带来的后果。因此，构建一种标记后酶学 活性不降低的生物素化碱性磷酸酶是亟需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种菌体内生物标记的双分子定点生物素化重组碱性 磷酸酶，该生物素化重组碱性磷酸酶是由大肠杆菌系统集表达与生物素化一体化、大肠杆菌 体内完成的两分子生物素定点定量连接的重组碱性磷酸酶，该生物素化重组碱性磷酸酶一经 产生，无需体外与生物素化学根据偶联即可用于生物素-亲和素系统的酶免疫分析。本发明利 用基因工程技术生产免疫测定标记用酶，可改变从生物体分离提纯的生产方式，也是得到符 合标记要求高纯度酶的一条新途径，而将标记酶直接与抗体融合表达的方式制备，可克服化 学交联剂偶联方法的弊端。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种生物标记的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶，是在碱性磷酸酶的氨基端、羧基 端分别以生物方式各连接一个生物素分子构建而成，该重组生物素标记酶一经产生即为双分 子生物素定点标记的重组碱性磷酸酶，其酶学活性不受标记因素影响。

所述生物标记的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶的构建方法如下：首先，构建具有 两个可生物素化序列及蛋白质连接柔性Linker的中间载体pUCAvi-linker-Avi，然后利用PCR 技术将碱性磷酸酶（AP）基因克隆至两个可生物素化序列的中间，大肠杆菌表达并依菌体内 BirA酶同步催化获得N端、C端分别生物素化的重组碱性磷酸酶：Biotin-AP-Biotin。通过 该方法得到的重组酶无需体外再次生物素标记即可用于BAS体系的酶免疫分析，可有效提高 BAS酶免疫分析的灵敏度与特异性，因没有经过化学标记，该重组酶充分保持了碱性磷酸酶 的酶学活性，可减少标记酶的用量，降低检测成本。

所述生物标记的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶的制备方法如下：

（1）根据(Gly₄-Ser)₃及Avi基因序列，化学合成Avi—(Gly₄-Ser)₃—克隆位点 —(Gly₄-Ser)₃—Avi的基因片段，重组至pUC18载体，获得中间质粒载体（这个过程是常规 技术手段就可以实现的，所提及的pUC18载体以及基因序列都是公知的）；

（2）设计引物以PCR方式获得大肠杆菌碱性磷酸酶基因，重组至步骤（1）的中间载体， 获得原核表达载体；

（3）原核表达载体转化感受态大肠杆菌BL21，获得基因工程菌；

（4）培养基因工程菌，培养基中加入50μM生物素，依菌体内BirA酶同步催化，在所 表达目的蛋白的Avi序列赖氨酸位点结合生物素；

（5）纯化目的蛋白，获得两分子生物素定量连接的重组碱性磷酸酶。

进一步地，具体制备方法如下：

（1）根据(Gly₄-Ser)₃及Avi基因序列，化学合成Avi—(Gly₄-Ser)₃—克隆位点 —(Gly₄-Ser)₃—Avi的基因片段，重组至pUC18载体的EcoR I、Hind III位点，获得中间质 粒载体；

（2）表达载体及基因工程菌的构建：

①设计引物以PCR方式获得大肠杆菌碱性磷酸酶基因（以pDAP2质粒为模板，通过引物 进行PCR扩增获得，Genbank登陆号：U35316），然后将大肠杆菌碱性磷酸酶基因重组至步骤 （1）的中间载体的Sac I、PstI位点，获得原核表达载体；所述引物的序列为：

primer1：5′-GCTAGAGCTCACCAGAAATGCCTGTTCT-3′；

primer2：5′-GCTACTGCAGTTAATGGTGATGGTGATGGT-3′；如SEQ ID NO.1、2所示；

②表达载体CaCl₂转化感受态大肠杆菌BL21，氨苄LB抗性平板（即培养基中除常规LB 培养基的成分外，还含氨苄100μg/mL）筛选阳性克隆，获得基因工程菌；

（3）基因工程菌的培养及体内生物素化：

①挑取单克隆菌落接种于5mL液体LB培养基（培养基中除常规LB培养基的成分外，还 含氨苄100μg/mL），37℃过夜（10～14h）培养、活化；

②活化菌液按照2%（v/v）的接种量转接于新鲜的50mL液体LB培养基（培养基中除常 规LB培养基的成分外，还含氨苄100μg/mL），37℃培养至OD600为0.3时，向培养基中加 入终浓度为50μM的生物素，继续培养16h，依大肠杆菌菌体内BirA酶同步催化所表达的目 的蛋白在Avi序列赖氨酸位点结合生物素；

（4）融合蛋白的提取：

①经上述培养的基因工程菌4℃，1000rpm离心10min，收集菌体；

②菌体以5mL0.1M的Tris缓冲液重悬，置入-80℃液氮中10min，再迅速置入37℃的 恒温水浴中15min，如此反复冻融3次；

③上述反复冻融的菌液4℃，1200rpm离心10min，上清转入一新离心管中；

（5）目的融合蛋白的纯化：

①清洗柱子：用2柱体积的Buffer W清洗Strep-Tactin柱；

②样品上柱：取步骤（4）冻融的菌液上清5mL流通上柱结合目的蛋白；

③冲洗柱子：用5柱体积的Buffer W洗柱，并收集每部分的洗脱液；

④目的蛋白的洗脱：以Buffer E洗脱目的蛋白，收集每一部分并各取20μl SDS-PAGE 鉴定；

⑤目的蛋白的脱盐与浓缩：使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓缩， 将浓缩液以0.01M TBS稀释至合适体积，既得生物素化重组碱性磷酸酶。

所述Buffer W(washing buffer)的配方组成为：100mM Tris·Cl，150mM NaCl，1 mM EDTA，余量为水，pH8。

所述Buffer E(elution buffer)的配方组成为：100mM Tris·Cl，150mM NaCl，1 mM EDTA，2.5mM desthiobiotin，余量为水，pH8。

由背景技术可知，目前现有技术中，生物素化碱性磷酸酶的主要制备方式是以化学共价 偶联标记为主，该技术是利用酶分子内-NH₂、-CHO或-SH等活性位点通过化学法与活化生物 素共价偶联得到生物素化碱性磷酸酶（如图2所示），化学共价偶联标记中一个酶分子可被3～ 5个生物素标记，这也是BAS体系应用与酶免疫分析的应用基础，但是生物素与酶分子内的 活性基团是一种随机结合方式，所得产物从化学结构上讲是一种混合物，而且当反应基团的 氨基酸残基位于酶活性位点或附近时势必影响酶活性。而本发明的生物素化碱性磷酸酶是以 基因工程方式实现的生物方式标记，所提供的菌体内生物方式标记的生物素化重组碱性磷酸 酶，是一种位点专一性、双分子定量生物素化重组碱性磷酸酶，是在碱性磷酸酶的氨基端、 羧基端分别以生物方式各连接一个生物素分子（如图1所示）；该重组生物素标记酶一经产生 即为双分子生物素定点标记重组碱性磷酸酶，其酶学活性不受标记因素影响；并且是一个酶 分子被两分子生物素定点标记，在BAS体系的酶免疫分析中可与链霉亲和素或亲和素形成网 状的放大结构，因没有经过化学标记该重组酶充分保持了碱性磷酸酶的酶学活性，可有效提 高BAS酶免疫分析的灵敏度与特异性，以及可减少标记酶的用量，降低检测成本。

附图说明

图1：本发明的双分子生物素定点标记重组碱性磷酸酶结构示意图。

图2：化学共价偶联的生物素化碱性磷酸酶结构示意图。

图3：双分子生物素定点标记碱性磷酸酶的表达与纯化电泳图，其中，1为对照菌，2为 表达菌株，M为蛋白质分子量标准，3，4，5，6，7为洗脱的目的蛋白。

图4：双分子生物素定点标记碱性磷酸酶的BAS系统应用示意图。

图5：化学共价偶联的生物素化碱性磷酸酶的BAS系统应用示意图。

图6：双分子生物素定点标记碱性磷酸酶与化学共价偶联的生物素化碱性磷酸酶的应用 效果，其中，a为双分子生物素定点标记碱性磷酸酶检测，b为化学共价偶联的生物素化碱性 磷酸酶检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

若无特别说明，所涉及的试剂、试验方法均为常规法试剂、常规方法。

实施例1双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶表达载体的构建

步骤如下：

（1）根据(Gly₄-Ser)₃及Avi基因序列，化学合成Avi—(Gly₄-Ser)₃—克隆位点 —(Gly₄-Ser)₃—Avi的基因片段，其基因序列为：

GAATTCGATGGGCGGAGGTGGATCTGGCGGAGGTGGATCGGGCGGAGGTGGATCAGGTCTGAACGATATCTTCGAA GCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCGGCGGAGGTGG ATCTGGCGGAGGTGGATCGGGCGGAGGTGGATCAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAT AAAAGCTT；如SEQ ID NO.3所示；

上述合成的DNA片段双酶切重组至pUC18载体的EcoR I、Hind III位点，获得中间质粒 载体；

（2）设计引物：

primer1：5′-GCTAGAGCTCACCAGAAATGCCTGTTCT-3′；

及primer2：5′-GCTACTGCAGTTAATGGTGATGGTGATGGT-3′；如SEQ ID NO.1、2所示；

以pDAP2质粒为模板PCR方式获得大肠杆菌碱性磷酸酶基因，双酶切重组至上述中间载体 的Sac I、PstI位点（这两个酶切位点，pUC18载体带有，步骤1合成的序列中也带有），获得 原核表达载体。

实施例2双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶基因表达与纯化

步骤如下：

（1）原核表达载体（实施例1制备）CaCl₂转化感受态大肠杆菌BL21，氨苄LB抗性平板 筛选阳性克隆，获得基因工程菌；

（2）挑取单克隆菌落接种于5mL液体LB培养基（含氨苄100μg/mL），37℃过夜（12h） 培养、活化；

（3）活化菌液按照2%的接种量转接于新鲜的50mL液体LB培养基（含氨苄100μg/mL）， 37℃培养至OD600为0.3时，加入终浓度为50μM的生物素，继续培养16h，依大肠杆菌菌 体内BirA酶同步催化在所表达的目的蛋白Avi序列的赖氨酸位点结合生物素；

（4）经上述培养的基因工程菌4℃，1000rpm离心10min，收集菌体；菌体以5mL0.1M 的Tris缓冲液重悬，置入-80℃液氮中10min，再迅速置入37℃的恒温水浴中15min，如此 反复冻融3次；

（5）上述反复冻融的菌液4℃，1200rpm离心10min，上清转入一新离心管中；

（6）Buffer W清洗Strep-Tactin柱（：用2柱体积的Buffer W清洗Strep-Tactin柱）； 冻融的菌液上清5mL流通上柱结合目的蛋白；用5柱体积的Buffer W洗柱，以Buffer E洗 脱目的蛋白，收集每部分的洗脱液洗脱目的蛋白，并SDS-PAGE鉴定，鉴定结果如图3所示， 通过图3可以看到，得到了分子量为48kD的蛋白，与目的蛋白的理论分子量一致，可以确定， 该条带即为目的蛋白条带；

（7）目的蛋白的脱盐与浓缩：使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓 缩，得生物素化重组碱性磷酸酶；冷冻干燥，称重，收集1L发酵液菌体得到60mg目的蛋白。

所述Buffer W(washing buffer)的配方组成为：100mM Tris·Cl，150mM NaCl，1 mM EDTA，余量为水，pH8。

所述Buffer E(elution buffer)的配方组成为：：100mM Tris·Cl，150mM NaCl，1 mM EDTA，2.5mM desthiobiotin，余量为水，pH8。

实施例3化学偶联生物素化碱性磷酸酶的制备

本实施例中先大肠杆菌表达制备碱性磷酸酶，然后采用化学标记法获得生物素化的碱性 磷酸酶。

（1）原核表达载体pDAP2以CaCl₂转化感受态大肠杆菌BL21，氨苄LB抗性平板筛选阳 性克隆，获得含pDAP2质粒的工程菌；

（2）挑取单克隆菌落接种于5mL液体LB培养基（含氨苄100μg/mL），37℃过夜（12h） 培养、活化；

（3）活化菌液按照2%的接种量转接于新鲜的50mL液体LB培养基（含氨苄100μg/mL）， 37℃培养至OD600为0.3时，加入终浓度为50μM的生物素，继续培养16h；

（4）经上述培养的基因工程菌4℃，1000rpm离心10min，收集菌体；菌体以5mL0.1M 的Tris缓冲液重悬，置入-80℃液氮中10min，再迅速置入37℃的恒温水浴中15min，如此 反复冻融3次；

（5）收集上清，并用0.22μm滤膜过滤，使用Millipore超滤器（截留分子量为10kDa）， 4℃，4000rpm，离心30min浓缩；

（6）将10mL Ni-NTA倒入2.5×10cm柱中，用3个柱床体积的缓冲液A（50mM Tris， pH8.0；0.3M氯化钠；10mM咪唑）在4℃进行柱平衡；

（7）将浓缩发酵液上样，用6个柱床体积的缓冲液（50mM Tris，pH8.0；20mM咪唑； 0.3M氯化钠）清洗；

（8）用6个柱床体积的缓冲液（50mM Tris，pH8.0；250mM咪唑；0.3M氯化钠）洗脱 目的蛋白；

（9）使用Millipore超滤器（截留分子量为10kD），4℃，4000rpm，离心30min 浓缩、脱盐，既得碱性磷酸酶；

（10）以Thermo Scientific EZ-Link生物素标记试剂盒（Sulfo-NHS-Biotin）按照说 明书对步骤（9）所得的碱性磷酸酶进行化学标记，得生物素化碱性磷酸酶。

实施例4碱性磷酸酶酶学活性的测定

碱性磷酸酶活性检测原理：

360μL pNPP溶液（50mM的Tris-HCl中含2mM乙酸镁，pNPP浓度0.25～10mM，pH10.0）， 加入IgG Ab-AP溶液40μL（BCA法定量，武汉博士德生物公司），37℃反应10min，3.6mL1M  NaOH终止反应，测定405nm的吸光度值。

酶活力单位：在上述条件下，每分钟催化产生1μmol/LpNP所需的酶量定义为1个活性单 位（U）。1mg酶所含有酶的单位数称为比活力。

根据下式计算计算活力单位：

U=M×A^-1×ε×b

其中，M=IgGAb-AP融合蛋白质量；A=405nm吸光度；ε=18700[L×mol^-1×cm^-1]；b=1cm

经测定，实施例3步骤（9）所制备的碱性磷酸酶比活力为286±42U/mg蛋白，实施例3 步骤（10）化学发制备的生物素化碱性磷酸酶比活力176±38U/mg蛋白，而实施例2步骤（7） 所制备的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶比活力281±50U/mg蛋白；实施例2、实施例3 的碱性磷酸酶基因及其表达体系一致的情况下，本发明的双分子定点生物素化重组碱性磷酸 酶与未标记的碱性磷酸酶的酶学活性基本一致，说明采用本发明生物学方法实现的双分子定 点生物素化技术未影响碱性磷酸酶的酶学活性，而化学法制备的生物素化碱性磷酸酶活性降 低40%左右。

实施例5双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶在BAS酶免疫分析中的应用

应用方式如下：

（1）2μg/mL的IgY抗体（溶液为碳酸盐缓冲液，pH9.0）以100μL/孔4℃过夜（12h）包 被96孔聚苯乙烯微孔板；

（2）移去孔内液体，甩干，以PBST溶液（0.01M，含0.05%Tween20）洗涤3次，每次5min；

（3）加入系列浓度的生物素化兔抗IgY-IgG抗体100μL（PBS溶液），37℃温育2h；甩干； 以PBST溶液（0.01M，含0.05%Tween20）洗涤3次，每次5min；

（4）加入1μg/mL的链霉亲和素（PBS溶液），及1:2000的双分子定点生物素化重组碱性 磷酸酶（实施例2制备），37℃温育30min，甩干；37℃温育30min，甩干；以PBST溶液（0.01M， 含0.05%Tween20）洗涤3次，每次5min；pNPP底物溶液显色10-15min，测定A405值。测定模式 如图4所示，测定结果如图6所示。

（5）在步骤（3）加入1μg/mL的链霉亲和素（PBS溶液），及1:1000的化学方式标记 的生物素化碱性磷酸酶（实施例3制备），37℃温育30min，甩干；37℃温育30min，甩干； 以PBST溶液（0.01M，含0.05%Tween20）洗涤3次，每次5min；pNPP底物溶液显色10-15min， 测定A405值，以作对照实验，测定模式如图5所示，测定结果如图6所示。图6结果显示双 分子定点生物素化重组碱性磷酸酶在0.5-800ng/mL范围内呈线性关系，最低检测限为0.1ng， 化学方式标记的生物素化碱性磷酸酶在1-600ng/mL范围内呈线性关系，最低检测限为1ng， 前者的最低检测限及线性范围明显高于后者。