定点生物素修饰双价抗PTH纳米抗体及吸附剂的制备

摘要

甲状旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）是终末期慢性肾脏病患者体内大量蓄积的中分子毒素之一，体内过多的PTH导致继发性甲状旁腺功能亢进，造成多系统病变，严重影响患者的生存质量与生存率。而目前的血液透析方法，无法去除体内过多的PTH，因此急需能够特异性吸附 PTH的血液净化材料。纳米抗体具有易于改造、亲和力高、血液相容性好等优点，是制作血液净化吸附剂的理想配基。此外，通过对纳米抗体进行串联改造，能够显著提高其生物学性能。而链霉亲和素与生物素系统是蛋白固载中常用的定向固载方法，能够更好的保持蛋白活性。本论文将二者相结合，利用链霉亲和素与生物素系统，以双价抗PTH纳米抗体为配基，制备PTH血液净化吸附剂，并对其应用于PTH的血液净化进行了可行性研究。具体内容如下：
　　（1）双价定点生物素修饰抗PTH纳米抗体的制备。通过对实验室筛选的5种抗PTH纳米抗体进行综合评价，选取只有一对Cys的2种序列构建带有生物素修饰标签(avi-tag)的双价抗PTH纳米抗体Nb1-Nb2，并以单价抗PTH纳米抗体Nb1为对照进行相同的基因工程改造；改造后的纳米抗体载体转化入3种大肠杆菌中，经筛选，最终选取可溶表达效果最好的E.coli S huffle T7进行表达；固定化金属离子亲和层析纯化后，获得了纯度85%以上、终产量100 mg/L左右的两种抗体。Biaco re测定两种纳米抗体亲和力，发现Nb1-Nb2较Nb1亲和力提高了6.2倍，Kd达到了3.757×10-7 M。在生物素连接酶的作用下，带有avi-tag的2种纳米抗体在体外可以实现80%的生物素修饰。
　　（2）链霉亲和素的制备。链霉亲和素质粒转入E.coli S huffle T7中，可进行可溶表达，通过镍离子亲和层析纯化，得到纯度高达95%的链霉亲和素。利用233 nm紫外光谱法测定链霉亲和素活性为12.5 U/mg，具备很高的生物素结合活性。
　　（3）血液净化吸附剂的制备及吸附性能评价。通过链霉亲和素-生物素技术成功在琼脂糖凝胶上定向偶联了2种抗 PTH纳米抗体，并比较了定向固载与非定向固载在吸附性能上的差异。静态吸附结果显示，定向偶联Nb1-Nb2的吸附剂，达到2.05 mg/mL。动态吸附结果显示Nb1-Nb2吸附材料的吸附质量摩尔比是Nb1吸附材料的3倍，且定向固载纳米抗体吸附剂性能远高于非定向固载。吸附选择性实验发现在血浆环境中，吸附剂仍对 PTH有吸附能力，但由于与血浆蛋白存在非特异性相互作用，影响了吸附剂的特异性吸附。

目录

声明

引言

1 文献综述

1. 1慢性肾脏病与甲状旁腺激素

1. 2纳米抗体

1. 3蛋白质固载技术

1. 4本论文研究目的、内容和意义

2 定点生物素修饰双价抗PTH纳米抗体的制备

2. 1 引言

2. 2 实验材料和仪器

2. 3 实验方法

2. 4 实验结果与讨论

2. 5 小结

3 链霉亲和素的制备

3. 1 引言

3. 2 实验材料与仪器

3. 3 实验方法

3. 4 实验结果与讨论

3. 5 小结

4 免疫吸附剂的制备及吸附性能评价

4. 1 引言

4. 2 实验仪器与材料

4. 3 实验方法

4. 4 实验结果与讨论

4. 5 小结

结论

参考文献

附录A Nb1-Nb2基因序列及蛋白序列

附录B Nb1基因序列及蛋白序列

附录C 链霉亲和素基因序列及蛋白序列

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢