一种产L-乳酸的屎肠球菌菌株

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种产L-乳酸的屎肠球菌菌株。该产L-乳酸的屎肠球菌菌株，命名为屎肠球菌EnterococcusfaeciumsHY-U36，本发明所述的屎肠球菌（Enterococcusfaeciums）HY-U36可发酵转化葡萄糖直接生成并获得目的产物L-乳酸，葡萄糖转化生成L-乳酸的平均转化率为84%-91%，转化率高，纯度高达98.4%，乙醇、苹果酸和富马酸等常见副产物较少，是一株极具研究开发价值的L-乳酸生产菌株。

说明书

（一）        技术领域

    本发明属于生物技术领域，涉及一种产L-乳酸的屎肠球菌菌株。

（二）        背景技术

L-乳酸（L-lactic acid)，学名L-2-羟基丙酸，分子式为C₃H₆O₃，最早由瑞典科学家C.W.Scheele在牛奶中发现，是世界上公认的三大有机酸之一。乳酸具有旋光异构现象，L-乳酸为其左旋型，是人体唯一可以分解利用的乳酸类型^[1]。

国际上L-乳酸按其纯度大致可分为技术级、食品级、塑料级和美国药典级四类，是重要的生物化工产品，在食品、医药、农业、化妆品及印染等众多领域有广泛应用。L-乳酸酸性柔和且性质稳定，在人体内可以直接分解代谢且无毒害作用，被美国FDA确认为安全(GRAS)，是一种优良的防腐剂和腌渍剂，在罐头、酱咸菜、肉制品等食品中，添加L-乳酸作为防腐剂，可以替代对人体有毒害作用的苯甲酸钠。在啤酒生产中，用L-乳酸替代磷酸来调节pH值，还能起到促进糖化及酵母菌发育、抑制杂菌感染、改善啤酒风味、延长啤酒保质期的作用。目前，美国已经禁止使用磷酸等无机酸调节pH，而全部改用L-乳酸^[2]。在烟草行业，添加一定量的L-乳酸，可以消除辛辣味，保持烟草的湿度，提高卷烟的质量。在医药行业，L-乳酸或乳酸盐可以直接配制成药物使用，由于其对人体无害的特点，且具有较强的杀菌能力，L-乳酸酯在制药业中作压制药体的润滑剂，还可以用于制备降压类药物^[3]。由发酵获得的粗乳酸氨溶液可直接作为青贮料添加剂应用于农业饲料中，另外L-乳酸还可作为植物生长活力剂，水产用生菌剂等应用于农渔业上。此外，L-乳酸经过聚合可生成立链的或环状的L-聚乳酸，L-聚乳酸是一种无毒的高分子化合物，具有生物相容性，在人体内及自然界中能被分解成L-乳酸，可制成手术缝合线，骨折内固定物，缓释胶囊制剂等医用材料^[3][4]。L-聚乳酸用于生产生物可降解塑料，可以代替PVC、PP 类塑料用于容器薄膜、纤维等制品的生产^[2]，消除白色污染所带来的环境危机，具有良好的经济和社会效益。

由于化学合成法生产的乳酸主要是DL-乳酸，目前L-乳酸主要通过酶法和微生物发酵法生产。酶法合成L-乳酸只要是1，2-氯丙酸酶法转化和丙酮酸酶法转化法，但是酶法生产L-乳酸由于成本高、工艺复杂等原因，限制了其工业化生产，而微生物发酵法因其具有原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高等特点，已成为目前L-乳酸的最主要的生产方法。微生物发酵法生产L-乳酸是以淀粉、葡萄糖等为原料，经微生物发酵产生L-乳酸的方法，按照发酵微生物的种类可分为根霉发酵和细菌发酵。国内L-乳酸的工业生产主要以米根霉为主，它能够利用淀粉等廉价原料好氧发酵生产L-乳酸，但其糖理论转化率低（只有75%），且发酵具有易染菌、菌丝在发酵液中易结团成球、动力消耗大、副产物多等缺点^[5]，因此限制了其进一步的发展。近些年来，细菌发酵法生产L-乳酸成为研究的热点^[6]，这主要是因为与根霉发酵相比，细菌发酵生产L-乳酸具有转化率高（理论转化率100%，在实际工业生产中可达到90％以上）、发酵副产物较少，下游分离及提纯精制工艺相对简单、动力消耗少、生产成本低等特点。

几十年来，利用细菌发酵法生产L-乳酸的研究十分活跃，内容涉及菌种筛选、发酵培养基优化、发酵条件控制、L-乳酸的分离提纯、L-乳酸的合成代谢途径控制以及菌种基因改造等多个方面。目前世界上L-乳酸的主要生产地区为美国、西欧和日本等，近80％的生产厂家采用发酵法进行生产。美国有2个L-乳酸生产厂，它们是美国最大的发酵生产商ADM公司和荷兰PURAC与美国Cargill公司的合营公司，年生产能力分别为31000吨和34000吨^[7]。我国现有乳酸生产能力大约为25000吨/年，实际产量约为15000吨/年，90％的产品是DL-乳酸，生产规模、酸产率、产品质景等与国际水平相比仍有较大差距，特别是L-乳酸的研究与开发还很不够。国内对于细菌发酵生产L-乳酸的的研究菌属主要以乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptoccoccus)、芽孢杆菌属(Bacillus)为主，尚没有以肠球菌属菌株发酵生产L-乳酸的研究报道，本专利利用筛选得到的一株肠球菌属菌株——屎肠球菌为发酵菌株生产L-乳酸，具有产量高、产物纯度高、副产物较少等特点，是一株极具研究开发价值的L-乳酸工业生产菌株。

（三）        发明内容

    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种产L-乳酸的屎肠球菌菌株，以实现利用糖质原料微生物发酵法获得L-乳酸为主要目的产物的愿望。

本发明是通过如下技术方案实现的： 

一种产L-乳酸的屎肠球菌菌株，其特殊之处在于：命名为屎肠球菌Enterococcus faeciums HY-U36，该菌株16S rDNA全序列如下： 

TCGTACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTT，上述16S rDNA序列全长800个核苷酸。

上述产高纯度L-乳酸的屎肠球菌HY-U36，其生物学特征（9）是：在固体培养（分离培养基）平板上培养观察，菌落可形成灰白色、不透明、表面光滑、直径为0. 5～1mm的圆形或椭圆形菌落，电镜观察菌体为球形，多成对或链状排列，革兰氏染色结果为阳性。

上述用于菌体形态观察的液体培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，K₂HPO₄ 2，乙酸钠5，其pH值为6.5。

上述用于菌体形态观察的固体培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，K₂HPO₄ 2，乙酸钠5，琼脂18，其pH值为6.5。

菌株CGMCC N0.7274生理生化特征（10）是：菌株HY-U36最适生长温度为30～37℃，能在10℃和45℃生长，可在重量分数占6.5%NaCl培养基及pH9.6条件下生长；该菌可利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖产酸，发酵葡萄糖不产气，不利用柠檬酸盐，接触酶阴性，还原硝酸盐。

对本发明的菌株CGMCC N0.7274测定16S rRNA 的部分基因序列的结果显示，该菌属于肠球菌属，测序核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过使用美国生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information , NCBI）BLAST程序比对，发现本发明的CGMCC N0.7274菌株16S rRNA 的基因序列与NCBI注册的屎肠球菌（Enterococcus faeciums）LMG 11423 16S rRNA的基因序列具有高度同源性，并结合生理生化实验，初步鉴定CGMCC N0.7274菌株是一株屎肠球菌（Enterococcus faeciums）。

本发明所述的产高纯度L-乳酸的屎肠球菌（Enterococcus faeciums）菌种选育的基本方法是：

使用溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板筛选得到一株可产生L-乳酸的屎肠球菌菌株H-36，以H-36菌株为出发菌株，通过紫外线、亚硝基胍等物理、化学诱变剂对其进行诱变，诱变可重复多次，诱变方法采用常规方法，诱变后涂布筛选平板，挑取单菌落移接斜面，然后再进行摇瓶发酵，通过测定葡萄糖的消耗速率和L-乳酸的产量筛选目的菌株，选取消耗葡萄糖速率快、L-乳酸产量高的菌株，再经过多次分离纯化，获得CGMCC N0.7274菌株。

本发明所述的产高纯度L-乳酸的屎肠球菌（Enterococcus faeciums）在制备L-乳酸中的应用。

利用屎肠球菌（Enterococcus faeciums）发酵生产L-乳酸的方法如下：

摇瓶发酵：取35-40℃培养1-2天的新鲜斜面接种液体种子培养基37℃培养10-16小时，接种发酵培养基，35-40℃摇瓶发酵62-84小时，发酵结束发酵液中检测不到葡萄糖残留，葡萄糖转化生成L-乳酸的的转化率为84-92%。

50L发酵罐发酵： 37℃培养1-2天的新鲜斜面接种液体种子培养基35-40℃培养10-16小时，按1-5%的接种量接入到预先准备好的发酵培养基中，50L发酵罐装液量33L，进行搅拌培养，通过调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在20-35%的饱和度，发酵液初始pH值为6.5-6.8，发酵过程中通过流加氨水维持发酵液的 pH 在6.2左右。24h后，关闭通气阀转入厌氧发酵，发酵过程中定期取样测定发酵液中的葡萄糖和L-乳酸的浓度，当发酵液中L-乳酸浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为 62- 84 小时。

上述筛选用平板培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，玉米浆5，磷酸氢二钾2，乳酸钙60，溴甲酚紫0.01，碳酸钙10，pH6.5-6.8；

上述斜面培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，磷酸二氢钾2，琼脂20，pH 6.5-6.8；

上述液体种子培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，玉米浆5，磷酸氢二钾2，pH6.5-6.8；

上述发酵培养基的组成（g/L）：葡萄糖80-120，蛋白胨10-20，酵母膏3-8，玉米浆10-20，磷酸氢二钾1-3，柠檬酸氢二铵1-3，硫酸镁0 -1.5，硫酸锰0 -0.2，吐温80 0.5-1.5mL/L， pH6.5-6.8；

上述L-乳酸发酵的培养温度优选为37℃。上述在液体种子培养基上培养时间优选为12-16小时，发酵培养基初始葡萄糖浓度优选为100-120g/L，上述在发酵过程中溶解氧水平优选控制在2-5%的饱和度。上述50L发酵罐发酵周期一般为64-78小时。葡萄糖转化L-乳酸的平均转化率为84%-91%。

上述葡萄糖按下述方法测定：

使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。

上述乳酸按下述方法测定：

高效液相色谱法（HPLC），色谱条件：色谱柱: Prontosil 1202102C18H(10μm,4.6mm i.d.×250 mm)；流速:0.5mL/min；进样体积:20μL；检测波长:210nm；柱温:30℃；流动相:用二次蒸馏水配制0.1mol/L KH2PO4，磷酸调节pH至2.5。

上述L-乳酸按下述方法测定：

使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型膜生物反应器测定。测定原理是固定化酶能特异性地作用于L(+)乳酸：

乳酸+O₂+H₂O->固定化L(+)乳酸氧化酶->丙酮酸+H₂O₂

发酵液稀释50-100倍，要求稀释的发酵液中乳酸的含量在0-50mg/dL范围内。

上述L-乳酸纯度测定按下述方法测定：

L-乳酸纯度（%）=L-乳酸浓度（g/L）/乳酸浓度（g/L）

本发明的有益效果是：本发明所述的屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36可发酵转化葡萄糖直接生成并获得目的产物L-乳酸，葡萄糖转化生成L-乳酸的平均转化率为84%-91%，转化率高，纯度高达98.4%，乙醇、苹果酸和富马酸等常见副产物较少，是一株极具研究开发价值的L-乳酸生产菌株。

（四）        附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明提供的菌株屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36，已于2013年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC N0.7274。

图1屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36的16S rDNA全序列图；

图2屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36 结晶紫染色图片；

图3屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36革兰氏染色图；

图4屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36菌株发酵液高效液相色谱图；

图5屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36构建系统发育树。

（五）        具体实施方式

实施例1：产L-乳酸屎肠球菌菌株的筛选

按常规方法取动物粪便处土壤、牛、羊瘤胃内容物等样品，在无菌操作的条件下取2g样品，放入装有40mL无菌水的250mL三角瓶中，震荡后取1mL接种到装有40mL富集培养基的250mL三角瓶中于37℃、180r/min摇床培养24h，再将富集液稀释涂布到溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板，于37℃厌氧袋中恒温培养，待长出单菌落后挑取变色透明圈大的菌落穿刺保藏。然后将这些保藏菌种再进行摇瓶发酵筛选，40mL摇瓶发酵培养基装于250mL三角瓶中，1支接1瓶接入1～2环斜面菌种，37℃、180r/min振荡培养64小时左右，然后测发酵液中L-乳酸含量极其纯度，最终筛选获得一株高纯L-乳酸的菌株，命名为屎肠球菌（Enterococcus faeciums）H-36。

实施例2：产L-乳酸屎肠球菌的选育

将出发菌株屎肠球菌H-36接种液体种子培养基，37℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×108－109个/ml。取上述菌悬液10ml放入平皿中，置30W紫外灯下照射，照射距离15cm，照射时间为3分钟、5分钟、7分钟、10分钟，间隔取样适当稀释后涂布于含有重量分数6%乳酸钙的溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板，37℃避光培养1-2天，挑取生长状况良好、变色透明圈大的单菌落进行保藏，37℃培养1-2天，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，37℃摇瓶发酵64小时，取发酵液4000r/min离心10分钟，取上清液测定发酵液中残留葡萄糖、乳酸及L-乳酸含量，选取残留葡萄糖浓度低、乳酸产酸量高且L-乳酸纯度高的菌株为目的菌株。

将目的菌株再经摇瓶发酵复筛以进一步分离筛选，选育得到一株耗糖速率稳定和L-乳酸产量及纯度都有提高的突变菌株H-U36。

H-U36菌株接种初始葡萄糖浓度为100g/L的发酵培养基，37℃摇瓶培养78小时结束发酵，发酵液中检测不到葡萄糖，乳酸产量为75.7g/L，L-乳酸纯度为98.2%。

实施例3：高纯L-乳酸菌株屎肠球菌CGMCC N0.7274的选育

将实施例2筛选到的突变菌株H-U36菌株接种液体种子培养基中，37℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×108－109 个/ml，备用。

亚硝基胍处理液配制：称取亚硝基胍20mg，放置于100ml无菌三角瓶中，加丙酮2ml使其溶解，再加入18ml Tris缓冲液（pH6.0,0.5mol/L）混匀，备用。

取上述亚硝基胍处理液10ml，加入10ml菌悬液，30℃保温振荡50-60分钟，每隔10分钟取样一次，取样后首先稀释1000倍终止反应，然后再稀释2-10倍，涂布溴甲酚紫-碳酸钙平板，37℃培养1-2天，挑取单菌落移接斜面，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，37℃摇瓶发酵60小时，发酵液4000r/min离心10分钟，取上清液测定发酵液中葡萄糖、乳酸及L-乳酸含量，选取残留葡萄糖浓度低、L-乳酸产量及纯度高的菌株为目的菌株。

将目的菌株再经摇瓶发酵复筛，经进一步分离筛选得到一株遗传性质稳定、L-乳酸产量最高达81.2g/L，纯度大于99.3%的突变菌株HY-U36。

上述菌株屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36，已于2013年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC N0.7274。

上述富集培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，磷酸氢二钾2L，pH为6.5-6.8；

上述平板分离培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，磷酸氢二钾2，乳酸钙60，溴甲酚紫0.01，碳酸钙10，pH为6.5-6.8；

上述液体种子培养基组成（g/L）：葡萄糖20-30，蛋白胨10，酵母膏5，碳酸钙8，磷酸氢二钾2，pH为6.5-6.8；

上述摇瓶发酵培养基组成（g/L）：葡萄糖80-120，蛋白胨5-15，酵母膏2-8，磷酸氢二钾1-3，碳酸钙0-120，柠檬酸氢二铵1-3，硫酸镁0-1.5，硫酸锰0 -0.2，吐温80 0.5-1.5mL/L，pH为6.5-6.8；

本实施例的产高纯度L-乳酸的屎肠球菌HY-U36，其生物学特征是：在固体培养（分离培养基）平板上28-37℃培养36-24h观察，菌落可形成灰白色、不透明、表面光滑、直径为0. 5～1mm的圆形或椭圆形菌落，电镜观察菌体为球形，多成对或链状排列如图2，革兰氏染色结果为阳性，如图3。

上述用于菌体形态观察的液体培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，K₂HPO₄ 2，乙酸钠5，其pH值为6.5。

上述用于菌体形态观察的固体培养基组成（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，K₂HPO₄ 2，乙酸钠5，琼脂18，其pH值为6.5。

菌株CGMCC N0.7274生理生化特征是：菌株HY-U36最适生长温度为30～37℃，能在10℃和45℃生长，可在重量分数占6.5%NaCl培养基及pH9.6条件下生长；该菌可利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖产酸，发酵葡萄糖不产气，不利用柠檬酸盐，接触酶阴性，还原硝酸盐。

菌株CGMCC N0.7274生理生化实验结果详见表 1。

表1菌株CGMCC N0.7274的部分生理生化特征（8）

实验项目结果碳源利用 葡萄糖+麦芽糖+棉子糖-木糖-甘露醇+乳糖+果糖+纤维二糖+D-山梨糖-蜜二糖+L-阿拉伯糖+柠檬酸盐试验-0.04%亚硒酸盐-丙酮酸发酵-淀粉水解-明胶液化-H₂0₂酶试验-尿素酶-V.P.试验+触酶-抗40%胆汁+吲哚试验-运动性试验-色素产生-4%NaCl试验+6.5%NaCl试验+生长温度（℃） 4-37+45+50+55-

注：“+”生长良好或呈阳性；“-”不生长或呈阴性。

实施例4：屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274菌16S rRNA基因测序

将实施例3选育得到的L-乳酸高产菌株HY-U36即CGMCC N0.7274菌株委托生工生物工程（上海）有限公司（Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd）进行16S rRNA基因测序。

实验方法是：挑取斜面培养物于10μl灭菌水中，99℃变性后离心取上清液作为模板，使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (Code No.D310)，以Forward/Reverse primer2为引物，扩增目的片段。取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No.DV805A) 切胶回收目的片断，以Seq Forward、 Seq Reverse Seq Internal为引物对上述回收产物进行DNA测序。

测序结果：屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274 16S rDNA测序核苷酸序列如SEQ ID NO.1及图1所示。

通过使用美国生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information , NCBI）BLASTN程序比对，发现CGMCC N0.7274菌株 16S rDNA序列与NCBI注册的屎肠球菌（Enterococcus faeciums）LMG 11423 16S rDNA序列具有高度同源性，结合生理生化实验，说明CGMCC N0.7274菌株是一株屎肠球菌（Enterococcus faeciums），如图5。

菌株16S rDNA序列表：

SEQ ID NO.1：

                         SEQUENCE LISTING

<110>  山东省食品发酵工业研究设计院

<120>  一种产L-乳酸的屎肠球菌菌株

<130>  2012-11-15

<160>  1     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  800

<212>  DNA

<213>  屎肠球菌（Enterococcus faeciums）

<400>  1

tcgtacgctt ctttttccac cggagcttgc tccaccggaa aaagaggagt ggcgaacggg     60

tgagtaacac gtgggtaacc tgcccatcag aaggggataa cacttggaaa caggtgctaa    120

taccgtataa caatcgaaac cgcatggttt tgatttgaaa ggcgctttcg ggtgtcgctg    180

atggatggac ccgcggtgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggccacgat    240

gcatagccga cctgagaggg tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct    300

acgggaggca gcagtaggga atcttcggca atggacgaaa gtctgaccga gcaacgccgc    360

gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaaa ctctgttgtt agagaagaac aaggatgaga    420

gtaactgttc atcccttgac ggtatctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca    480

gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca    540

ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac    600

tgggagactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgtag    660

atatatggag gaacaccagt ggcgaaggcg gctctctggt ctgtaactga cgctgaggct    720

cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag    780

tgctaagtgt tggagggttt                                                800

实施例5：屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274菌株的应用

将屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274菌株移接斜面活化；

按上述液体种子培养基的组成配制种子培养基，初始葡萄糖浓度实测为22-31 g/L，250ml三角瓶装液量为40ml，115℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环，置旋转转速为150-200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养12-16小时，得种子液，取种子液稀释5倍置580nm测吸光值为0.92-0.97；

按上述发酵培养基的组成配制发酵培养基，初始葡萄糖浓度实测为73-118g/L，250ml三角瓶装液量为40ml，115℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种种子液1ml，置旋转转速为150-200r/min、旋转半径为40mm摇床上，28-45℃培养78-96小时结束发酵，发酵液以4000r/min离心10分钟，取上清液测定葡萄糖、乳酸及L-乳酸含量分别为0g/L、81.1g/L和79.8g/L（根据葡萄糖初始含量相应增减），葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率为87.9%，L-乳酸光学纯度为98.4%。

或者：

以50L发酵罐按30L装液量配制发酵培养基，调整pH6.8，115℃实罐灭菌20分钟，循环水冷却至37℃后接种培养好的种子液600 ml，接种后立即取样测定葡萄糖浓度为72-117g/L。

初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为200-350r/min，通气比1：0.05-0.1vvm（料液容积与每分钟通气量（以容积计）的比值），罐内压力0.04-0.08MPa。发酵过程中控制发酵温度37±0.2℃,通过调节搅拌转速和通气比控制溶解氧前24h为20-35%，之后关闭通气阀，pH6.2±0.2。

发酵过程中每8小时取样，测定发酵液中葡萄糖、乳酸和L-乳酸的含量及菌体浓度，当葡萄糖含量低于10 g/L时，每2小时取样测定发酵液中葡萄糖、乳酸和L-乳酸含量，至发酵液中L-乳酸含量不再增加时结束发酵，发酵周期为78小时。

发酵结束后取发酵液以4000r/min离心10分钟，取上清液测定葡萄糖、乳酸和L-乳酸的含量分别为0g/L、82.7g/L和81.9g/L（根据葡萄糖初始含量相应增减），葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率为89.8%，L-乳酸光学纯度为99.0%。

上述葡萄糖按下述方法测定：

使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。

上述乳酸按下述方法测定：

高效液相色谱法（HPLC）如图4，色谱条件：

色谱柱: Prontosil 1202102C18H(10μm,4.6mm i.d.×250 mm)；流速:0.5mL/min；进样体积:20μL；检测波长:210 nm ；柱温:30 ℃；流动相:用二次蒸馏水配制0.1mol/L KH2PO4，磷酸调节pH至2.5。

上述L-乳酸按下述方法测定：

使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型膜生物反应器测定。测定原理是固定化酶能特异性地作用于L(+)乳酸：

乳酸+O₂+H₂O->固定化L(+)乳酸氧化酶->丙酮酸+H₂O₂

发酵液稀释50-100倍，要求稀释的发酵液中乳酸的含量在0-50mg/dL范围内。

上述L-乳酸纯度测定按下述方法测定：

L-乳酸纯度（%）=L-乳酸浓度（g/L)/乳酸浓度(g/L）。

 

参考文献：

[1] 刘伟雄.乳酸和聚乳酸的最新进展[J]．食品与发酵工业,2001.27(3)：61～65

[2] DATTA R.Technological and economical potential of polylactic acid and lactic acid derivatives[J].FEMS Microbiology Reviews,1995,16:221-231.

[3] NIJU N, ROYCHOUDHURY P K, SRIVASTAVE A. L-(+)lactic acid fermentation and its  product polymerization[J]. Electronic Journal of Biotechnology,2004,7(2):167-179.

[4] Young-Jung Wee,Jin-Nam Kim and Hwa-Won Ryu. Biotechnological Production of Lactic Acid and Its Recent Applications[J]. Food Technol Biotechnol ,2006,44(2):163–172.

[5] SOCCOL CR,STONOGA VI,REIMBAULT M.Production of L-lactic acid by Rhizopus species[J].Microbiology and Biotechnology,1994,10: 433–435.

[6] J.H. Litchfield.Microbiological production of lactic acid[J], Adv.Appl. Microbiol. 1996,42: 45–95.

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[8]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].科学出版社，2001，第一版：62-63。

[9] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].科学出版社，2001，第一版：353-363。

[10] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].科学出版社，2001，第一版：364-398。

SEQ ID NO.1

SEQUENCE LISTING

 

<110>  山东省食品发酵工业研究设计院

 

<120>  一种产L-乳酸的屎肠球菌菌株

 

<130>  2012-11-15

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  800

<212>  DNA

<213>  屎肠球菌（Enterococcus faeciums）

 

<400>  1

tcgtacgctt ctttttccac cggagcttgc tccaccggaa aaagaggagt ggcgaacggg     60

 

tgagtaacac gtgggtaacc tgcccatcag aaggggataa cacttggaaa caggtgctaa    120

 

taccgtataa caatcgaaac cgcatggttt tgatttgaaa ggcgctttcg ggtgtcgctg    180

 

atggatggac ccgcggtgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggccacgat    240

 

gcatagccga cctgagaggg tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct    300

 

acgggaggca gcagtaggga atcttcggca atggacgaaa gtctgaccga gcaacgccgc    360

 

gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaaa ctctgttgtt agagaagaac aaggatgaga    420

 

gtaactgttc atcccttgac ggtatctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca    480

 

gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca    540

 

ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac    600

 

tgggagactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgtag    660

 

atatatggag gaacaccagt ggcgaaggcg gctctctggt ctgtaactga cgctgaggct    720

 

cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag    780

 

tgctaagtgt tggagggttt                                                800