一种黄独胚性愈伤组织有机继代保存的方法

摘要

黄独胚性愈伤组织有机继代保存的方法：用六种含不同有机添加物的继代保存培养基依次对黄独胚性愈伤组织进行继代培养，可一直保存5年，5年后，黄独胚性愈伤组织仍可大量增殖。本发明与现有技术比较，继代保存的黄独胚性愈伤组织再生能力不会降低，胚性不会丧失。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种植物愈伤组织保存方法，确切地说是一种黄独胚性愈伤组织有机继代保存的方法。

背景技术：

黄独(Dioscorea bulbifera L.)为薯蓣科薯蓣属植物，一般药用其块茎，主要用于治疗各种甲状腺疾病和多种癌症。诱导黄独胚性愈伤组织可以为黄独变异株选择和转基因研究提供受体。建立遗传性稳定、转化效率高、易于再生的受体系统，是转基因研究的关键技术之一。迄今为止，建立转基因受体系统最为有效的方法是诱导培养胚性愈伤组织。然而，胚性愈伤组织的继代保存存在一定的问题，如胚性愈伤组织的胚性保持时间短，由于植物激素的使用导致部分胚性愈伤组织转为非胚性愈伤组织，长期的激素继代保存使胚性愈伤组织再生能力丧失等，难以为转基因研究提供足够的受体。针对这些问题，本发明开发了一种黄独胚性愈伤组织有机继代长期保存的方法，可为黄独组培苗变异株选择和转基因实验长期提供受体材料。

发明内容：

本发明的目的是提供一种再生能力强胚性活跃的黄独胚性愈伤组织有机继代保存的方法。实现本发明目的的技术方案是，一种黄独胚性愈伤组织有机继代保存的方法，其特征在于有以下步骤：(1)在超净工作台内，将黄独微型块茎胚性愈伤组织先接入培养基一(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L土豆汁+1-2g/L水解酪蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；(2)在培养基一上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基二(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L胡萝卜汁+1-2g/L水解乳蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；(3)在培养基二上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基三(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L西红柿汁+1-2g/L水解酪蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；(4)在培养基三上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基四(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L苹果汁+1-2g/L水解乳蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；(5)在培养基四上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基五(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L梨汁+1-2g/L水解酪蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-25001x；(6)在培养基五上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基六(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L椰子汁+1-2g/L水解乳蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；(7)在培养基六上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织再依次转入上述培养基一、培养基二、培养基三、培养基四、培养基五和培养基六中，培养时间仍各为60d，用这六种培养基依次对黄独胚性愈伤组织进行继代培养5年，黄独胚性愈伤组织的再生能力不会降低，胚性不会丧失。

具体实施方式：

结合下述实施例对本发明作进一步说明：

(1)黄独胚性愈伤组织的第一次继代保存

在超净工作台内，将黄独微型块茎胚性愈伤组织先接入培养基一(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L土豆汁+1-2g/L水解酪蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-25001x；

(2)黄独胚性愈伤组织的第二次继代保存

在培养基一上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基二(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L胡萝卜汁+1-2g/L水解乳蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；

(3)黄独胚性愈伤组织的第三次继代保存

在培养基二上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基三(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L西红柿汁+1-2g/L水解酪蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；

(4)黄独胚性愈伤组织的第四次继代保存

在培养基三上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基四(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L苹果汁+1-2g/L水解乳蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为；温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；

(5)黄独胚性愈伤组织的第五次继代保存

在培养基四上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基五(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L梨汁+1-2g/L水解酪蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为；温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；

(6)黄独胚性愈伤组织的第六次继代保存

在培养基五上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织转入培养基六(MS+10-20g/L香蕉汁+5-10g/L椰子汁+1-2g/L水解乳蛋白+0.5-1g/L蛋白胨+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，不调pH)，接种后将材料放入培养室培养，培养室培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-25001x；

(7)黄独胚性愈伤组织的第二轮继代保存

在培养基六上培养60d后，将黄独胚性愈伤组织再依次转入上述培养基一、培养基二、培养基三、培养基四、培养基五和培养基六中，培养时间仍各为60d，用这六种培养基依次对黄独胚性愈伤组织进行继代培养5年，黄独胚性愈伤组织的再生能力不会降低，胚性不会丧失。