香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法

摘要

本发明公开了一种香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法，以香樟未成熟果实中子叶胚为建立香樟胚培苗无性系的起始外植体，以胚培苗无性系茎切段作为不定芽诱导外植体，建立高频植株再生体系，其特征在于：建立香樟胚培苗无性系的外植体为香樟未成熟子叶胚，植株再生体系的建立选用香樟胚培苗无性系茎切段为外植体材料。本发明的方法取材方便，材料来源、数量充足，容易获得无菌材料；本发明可在香樟的组织培养、遗传转化和生物技术改良中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明属于林业技术领域，具体而言，涉及一种高频植株再生香樟无性系选育方法。 

背景技术

香樟(CinnamomumcamphoraL.)，樟科樟属植物，是亚热带常绿阔叶林的代表树种。其树形优美，枝繁叶茂，绿荫蔽日，气势雄伟，是优良的城市园林绿化常用树种。在我国的分布大体以长江以北为界，南至两广及西南，以江西，浙江、福建等东南沿海省份为多，因而在栽培范围上受到低温的限制。近年来，随着城市建设发展及园林绿化的新要求，为丰富北方园林的树种组合，改善冬季园林植物景观，不少园林工作者都在尝试引种此树，香樟被广泛引种栽植到黄河流域的一些省分，用以丰富当地绿化树种。 

北方漫长而寒冷冬季往往会导致香樟正常生长受损，严重时树体甚至死亡，从而造成巨大的经济损失。因此，防治冻害就成为这一优良树种在北方城市顺利推广及应用的一个重要问题。解决这一问题的主要方法是加强栽培管理和选育抗冻新品种，而后者是根本途径。采用生物技术方法，通过转基因手段进行分子育种，是一种“定向育种”，可有效缩短育种周期。生物技术改良香樟必须以高效植株再生体系的建立为研究基础，但目前由于采用香樟胚性愈伤组织为转基因外植体材料，存在转基因胚性愈伤组织再生困难，从而难获转基因植株等问题，制约着生物技术改良香樟的进程。 

在采用转基因技术改良香樟育种中，大多采用外植体是香樟胚性愈伤组织，胚性愈伤组织对香樟这个物种而言再生频率较低；加之转化外源基因后，需要在选择配方中添加一定浓度的抗生素来筛选转化材料，而抗生素的添加又增加了诱导转基因胚性愈伤组织再生植株难度。这2种不利因素最终导致通过转基因手段改良香樟很难获得转基因植株。 

因此如何提供一种香樟高频植株再生无性系的建立和筛选方法，对本领域的技术人员来说是亟待解决的技术问题。 

发明内容

本发明的目的是提供一种香樟高频植株再生无性系选育方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案： 

本发明一方面涉及一种植株再生香樟无性系选育方法，其特征在于包括如下反应步骤： 

(1)以无菌处理的香樟未成熟子叶胚为外植体，将其置于子叶胚萌发培养基诱导其萌发；(2)将子叶胚萌发芽苗，进行扩大繁殖处理，筛选增殖系数高(大于3～5)的胚培苗单株，获得单株无性系；(3)以来自单株无性系的香樟胚培苗茎切段为外植体，进行不定芽诱导处理，建立香樟茎切段植株再生体系，并进行高频植株再生单株无性系筛选；(4)香樟无性系茎切段经不定芽诱导处理后，选择诱导所得单芽进行壮苗培养；(5)壮苗处理后无根苗经生根培养，获得完整植株。 

本发明提供一种香樟组织培养方法。该培养方法取材方便，材料来源、数量充足，容易获得无菌材料；香樟胚培苗无性系的获得及其茎切段植株再生无性系的建立和筛选，具方法简单、步骤简化、周期短等特点；筛选获得高频植株再生香樟无性系，可大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因植株获得率，有效缩短香樟遗传转化周期；胚培苗无性系茎切段能替代目前使用的香樟胚性愈伤组织作为遗传转化的外植体。本发明可在香樟的组织培养、遗传转化和生物技术改良中发挥重要作用。 

具体实施方式

下列实施例中所用方法如无特别说明为常规方法。所述百分浓度如无特别说明为质量百分浓度。 

实施例1 

1.1材料 

7月底，采集健壮、成年香樟树上未成熟果实，将无菌处理后的果实切开，取出未成熟子叶胚作为研究材料。 

1.2方法 

1.2.1香樟果实的消毒和子叶胚接种 

处理方式如下：将香樟未成熟果实(直径约1cm)先用洗洁精溶液浸泡30min，再用自来水流水冲洗30min；后将其放置在超净工作台上，75％酒精浸泡30s后，0.1％升汞浸泡8min，最后用无菌水冲洗3次；香樟果实经消毒处理后，切开果实，取出未成熟子叶胚作为研究材料，接种在子叶胚萌发诱导培养基上。 

1.2.2培养方法及条件 

除香樟子叶胚萌发处理为暗培养，胚培苗扩大繁殖处理、茎切段不定芽诱导处理、单芽伸长壮苗处理以及无菌苗生根处理等香樟培养材料均为光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000～3000Lx；培养温度均为24±2℃。 

1.2.3香樟子叶胚萌发处理 

将香樟子叶胚接种于含萌发诱导培养基的培养皿中(S1：MS+BA2.0mg/L+2,4-D0.5mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH6.0)；暗培养处理4w后，切除萌发材料基部褐化子叶和冗余的愈伤组织，收集萌发的香樟胚培芽苗，将其转入同样配方的三角瓶中，光照培养，2w后继代一次，之后进入胚培苗无性系初选。 

1.2.4香樟胚培苗无性系初筛及扩大增殖处理 

选择增殖系数高(单株无菌苗生成丛枝数大于3～5枝)的胚培苗单株，进行扩大增殖处理，并将来自不同单株的胚培苗繁殖所得无性系命名为EL系列；胚培苗扩大增殖方法如下：取香樟胚培苗，用解剖刀先将胚培苗基部冗余愈伤组织增生和褐化变黑的组织剔除干净，然后将胚培苗丛生枝条，2～3枝一组分割开来，之后在每丛枝的中下部下刀，将丛生枝切成留有大约5mm枝条的丛枝基部，转入装有S1培养基的三角瓶中，用于胚培苗扩大增殖处理。此后香樟胚培苗无性系的继代繁殖均采用上述方法，每2w继代一次。 

1.2.5香樟胚培苗茎切段植株再生体系的建立 

将香樟胚培苗无性系EL6茎切段置于不同不定芽诱导培养基中，研究不同诱导配方对香樟胚培苗茎切段不定芽诱导的影响，用以建立香樟茎切段植株再生体系；其中胚培苗茎切段，按以下方法获得：取胚培苗无性系组培苗，用解剖刀先将胚培苗基部多余愈伤组织增生和褐化变黑的组织剔除干净，然后将无性系组培苗丛生枝，按2～3枝一组从基部分割开来，之后在每丛枝的中下部下刀，将丛 生枝条分成2部分，一部分是留有大约5mm枝条的丛枝基部，转入装有S1培养基的三角瓶中，用于胚培苗无性系继代；另一部分是零散的枝条，完全切除枝条上顶芽、侧芽(切下来的芽可做胚培苗继代外植体，也可直接丢弃)和叶片；将余下的枝条，按节切段(即每个茎切段上具有1～2节)，长约5～7mm，作为外植体接入各种诱导培养基中进行不定芽诱导培养；不定芽诱导培养采用光照培养，每一处理接种外植体数30个，2w后统计不定芽诱导率和分化系数。 

1.2.6香樟胚培苗单株无性系再生能力比较(香樟高频植株再生无性系筛选) 

将不同来源单株无性系胚培苗茎切段置于同一不定芽诱导培养基S1中，光照培养，2w后统计不定芽诱导率和分化系数，并进行高频植株再生无性系的筛选。 

1.2.7香樟茎切段所得不定芽壮苗处理 

香樟茎切段诱导所得不定芽，切除多余侧芽，选取具单芽0.5～1cm左右的小枝，置于不同壮苗培养基中，进行壮苗处理，接种2w后进行数据统计。 

1.2.8香樟无根苗生根处理 

壮苗培养后，选取1.5cm以上无根苗，切除基部多余侧芽或不定芽，将其置于不同生根培养基中，进行生根处理，2w后统计生根率。 

以上培养基无特殊说明均采用MS作为基本培养基，添加琼脂粉8g/L，蔗糖30g/L以及不同浓度的植物激素，培养基pH均调至6.0后，保持121℃灭菌20min。 

1.2.9数据计算和处理 

不定芽诱导率＝诱导出芽的外植体数/接种外植体总数×100％(不定芽长度大于3～5mm，记录一个有效芽) 

分化系数＝诱导出芽总数/诱导出芽的外植体总数×100％ 

壮苗率＝长大伸长芽总数/接种外植体总数×100％(叶片舒展，枝条长达1.5cm及以上，记录为壮苗) 

生根率＝诱导出不定根的无菌苗数/接种无菌苗总数×100％ 

2结果与分析 

2.1香樟胚培苗茎切段植株再生体系的建立 

表1不同诱导配方对香樟胚培苗茎切段不定芽诱导的影响 

注：CH是水解酪蛋白。 

由表1可知，香樟胚培苗茎切段接种后，在外植体去除侧芽，叶片的具节部位和节间切口部位，均可观察到不定芽的形成，同时可以观察到部分外植体上有愈伤组织的形成，因此香樟茎切段的植株再生方式属于直接器官发生，并非先形成愈伤组织后由愈伤组织再生成器官的再生方式。外植体接种于不同诱导培养基中，不定芽诱导率和分化系数不同，但诱导率均高于80％，说明香樟胚培苗茎切段具有成为高频植株再生体系外植体的优势。其中配方S1和S3的不定芽诱导率超过90％，不定芽分化系数超过5，可作为香樟胚培苗茎切段不定芽诱导培养基，但S3配方中的外植体愈伤组织诱导率较高，超过50％，因而S1作为茎切段不定芽诱导配方的效果较好。香樟胚培苗茎切段经不定芽诱导，可通过直接器官发生获得香樟植株再生，由此可建立香樟胚培苗茎切段器官发生植株再生体系。 

在茎切段不定芽配方S5，S6中，诱导所得不定芽可观察到叶片舒展，枝条抽生长大的现象，推测可作为不定芽壮苗培养基。 

2.2香樟胚培苗单株无性系再生能力比较 

表2不同香樟胚培苗单株无性系再生能力比较 

将香樟胚培苗单株无性系EL1、2、3、4、6茎切段接种于S1中，2w后统计不定芽诱导率和分化系数。由表2可知，来源不同的无性系胚培苗茎切段皆具有诱导不定芽再生的潜能，虽然在诱导率和分化系数各不相同，但诱导率均大于70％，说明香樟胚培苗作为茎切段植株再生体系的材料供体，具有再生能力强的优势。其中无性系EL4和EL6诱导率达90％，分化系数分别为4.24和5.19，可认为是具高频植株再生的无性系，能够作为转化受体材料用于香樟农杆菌介导的遗传转化。 

2.3香樟茎切段不定芽单芽壮苗培养 

表3不同壮苗配方对不定芽单芽壮苗的影响 

香樟茎切段诱导所得不定芽，单独切下置于不同壮苗培养基中(Z1、Z2、Z3、Z4、S5、S6)，可观察到部分接种材料叶片舒展，枝条抽生，逐渐长大，由表3可知，配方S5壮苗效果最佳，且外植体基部重新形成不定芽的现象较少，认为可作为该植株再生体系的壮苗培养基。 

2.4香樟无根苗生根培养 

表4不同生根配方对香樟无根苗生根诱导影响 

注：1/2MS为MS大量元素添加量减半。 

将壮苗处理后的香樟茎切段再生无根苗转入不同生根配方中，5d后即可在某些生根配方中观察到不定根的形成，其中配方R5无根苗生根率最高，达95％，该配方中，无根苗的不定根形成数量也多为2～3根，因此可以作为无根苗生根诱导配方。此外，香樟无根苗接种在不添加任何激素的MS培养基亦可观察到不定根的形成，说明香樟胚培苗茎切段诱导所得再生植株生根容易，具有较高形成完整植株的潜在能力。 

综上所述，利用香樟未成熟果实中子叶胚建立胚培苗无性系，能够为遗传转化提供充足的茎切段，胚培苗茎切段通过不定芽诱导、壮苗培养及生根培养等步骤，建立高频植株再生体系，可为香樟农杆菌介导的遗传转化提供稳定而高效的转化受体系统。 

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。