香樟体胚发生途径的植株再生体系的建立以及农杆菌介导遗传转化的初步研究

摘要

香樟(CinnamomumcamphoraL.)，是一种树形优美的高大乔木，分布于世界上气候温暖湿润的地区，被广泛应用为行道树，庭荫树。该树不但具有许多优良特性如：适应性强，能够吸收有害气体，净化空气，而且木材致密优美，供建筑、造船、家具、箱柜、雕刻、乐器等用途，叶片和木材又可用来提取樟油，是一种极具有经济价值的树种；近年来，香樟在园林绿化中的应用越来越多，随着经济水平、人们物质文化生活水平的提高以及适应山水园林城市建设的需要，香樟仍有一些方面有待改良，如结实量大，紫黑色果实成熟后，掉落在人行道上，或者被鸟类食用后随粪便污染路面和行人衣物，香樟在园林中的推广应用也因此而受限制；另外，香樟被害虫严重危害，其中比较常见的有两种：白蚁和窃达刺蛾。在一些栽培地区，随着害虫出现的增多，为害也日益严重，尤其是一些生长百年的古樟被白蚁蛀害，造成的经济损失不可估量，如何控制害虫、保护香樟逐渐被提到议事日程上来。要解决上述问题的根本出路在于培育出新的抗病、抗虫、不结实的樟树。但是，由于木本植物的生长周期长，遗传背景复杂使得通过传统有性杂交进行树种改良进程缓慢，效率不高。近年来，逐步发展起来的遗传转化技术为不育、抗虫香樟的育成提供了新的思路。 本研究的主要目标是通过农杆菌介导的遗传转化方法将人工雄性不育基因导入香樟，以期创造不育的香樟新种质，为今后的香樟不育育种提供新的思路和材料。围绕这一目标，本研究以华中农业大学校园中性状优良、植株健壮的香樟为试材，首先建立了香樟的离体微繁体系以及体胚发生途径的植株再生体系；其次，诱导获得并长期保存了香樟的胚性愈伤组织，以胚性愈伤组织为材料建立了悬浮培养体系；并将悬浮培养物进行一系列的酶解、收集、培养，诱导获得了香樟原生质体的再生植株，建立了香樟胚性悬浮培养物的原生质体的再生体系；利用转化GUS报告基因对影响农杆菌介导香樟遗传转化的条件进行了详细的研究，优化了转化条件，建立了香樟胚性愈伤组织遗传转化体系；最后在此基础上进行了GFP基因和pTA29-Barnase的转化，并由PCR检测结果证明获得了转化的香樟胚性愈伤组织。 本研究主要研究结果如下：1.以樟树的成熟种子中的胚芽为材料建立香樟的离体微繁体系，并以无菌苗的叶片为外植体进行愈伤组织诱导影响因素的研究，诱导获得愈伤组织。结果显示：诱导香樟叶片愈伤组织比较好的生长素是0.1mg/LCPA、1.0mg/LNAA和1.0mg/L2,4-D；诱导叶片愈伤组织较好的细胞分裂素是3.0mg/LBA和0.5mg/LTDZ；诱导丛生芽增殖的最佳配方是MS+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA。从愈伤组织诱导不定芽有待进一步研究。在继代培养约6周后，枝条转入MS+1.0mg/LIBA生根培养基中，15-20d后产生不定根，该生根配方生根率可达50％以上。 2.香樟体胚发生途径的植株再生体系的建立。以香樟的未成熟合子胚为外植体，探讨了体胚发生诱导影响因素，体胚的增殖与保存以及体胚植株再生的方法；成功地从体胚上诱导获得胚性愈伤组织，至今已经增殖保存了3年。结果表明：从香樟幼胚中诱导体胚发生，MS是较为适合的基本培养基，蔗糖是最佳的碳源，2,4-D对于诱导樟树的体胚发生具有显著的作用，最高的体胚诱导率(68.4％)和平均体胚数(3.6)是在0.1mg/L2,4-D和1.0mg/LBA的组合中得到的；子叶状体胚经培养基MS+3.0mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+0.5mg/LGA3处理后，再生植株转化率总计约21.7％，切割下来的再生芽在培养基MS+0.1mg/LNAA+0.5mg/LBA+0.5mg/LGA3进一步生长，4周后，在生根培养基MS+1.0mg/LIBA中生根，完整的再生植株转入土壤中，生长和外观一切正常。胚性愈伤组织经体胚诱导、体胚成熟、体胚萌发等三个过程的诱导后能够获得再生植株。由胚性愈伤组织形成的体胚植株再生率与子叶状次生胚再生率差别不大。 3.通过对报告基因GUS转化的研究，对遗传转化过程中各种因素进行了全面探讨。首先测试了选择抗生素潮霉素和卡那霉素对胚性愈伤组织增殖的影响，结果表明：香樟胚性愈伤组织对潮霉素非常敏感，浓度为50mg/L可以迅速抑制胚性愈伤组织的生长；香樟胚性愈伤组织对于卡那霉素的忍耐性要比潮霉素高的多，抑制80％以上的胚性愈伤组织增殖需要卡那霉素的浓度达100mg/L。通过评价GUS基因瞬间表达的结果，详细探讨了浸染时间、浸染菌液浓度和共培养时间对T-DNA转化的影响，优化了转化条件。结果表明：40min是最适合胚性愈伤组织浸染的时间；对胚性愈伤组织最适宜的农杆菌浓度为OD600=0.6；3天的共培养对于胚性愈伤组织转化比较合理。按照这一条件进行浸染，共培养3d后，转入选择培养基进行选择培养，其中培养基中添加潮霉素50mg/L，抑菌剂为头孢霉素，添加浓度为300mg/L。选择培养6周后，获得抗性愈伤组织，经多次继代选择得到的抗性愈伤经PCR检测证明：获得含GUS基因的稳定转化的胚性愈伤组织。 4.获得了GFP基因和人工雄性不育基因稳定转化的胚性愈伤组织。按照优化的遗传转化系统，利用含有卡那霉素选择基因和GFP基因的EHA105菌株和含有卡那霉素选择基因和pTA29-Barnase的LBA4404菌株对香樟的胚性愈伤组织进行了遗传转化实验，结果表明：利用转化GUS基因建立的转化体系对于含有不同的选择基因，不同菌株的农杆菌转化同样适用。PCR结果证明：获得了稳定转化的胚性愈伤组织。 5.建立了以香樟胚性愈伤组织的悬浮培养细胞为材料的原生质体分离、培养及植株再生体系。首先建立了胚性愈伤组织的悬浮培养体系，及时继代、筛选新生的愈伤组织是获得分散性良好的悬浮培养体系的关键。详细探讨了酶解时间，起始材料和酶浓度的配比对原生质体分离的影响，完善了原生质体分离体系。结果表明：悬浮培养细胞是最佳的原生质体分离材料；12h的酶解可以得到原生质体的最高产量；含有3％纤维素酶和3％离析酶的酶溶解混和液对香樟悬浮培养细胞进行12小时的酶解，可获得较高的原生质体产量，且原生质体活力较高。在使用优化了的原生质体酶解体系，分离获得到的原生质体进行培养时，探讨了不同培养基和培养密度对原生质体培养的影响。结果表明：最优的原生质体培养基为MS+3％蔗糖+0.7mol/L葡萄糖+0.1mg/LNAA+1.0mg/LBA+1.0mg/LGA3，最佳的原生质体培养密度为1×106个/ml。原生质体的第一次分裂出现在培养后的7-10d，逐渐降低培养基的渗透压有助于原生质体的持续分裂。最终将培养基固化后，诱导获得的愈伤组织，能够通过体胚发生途径再生植株，类似于香樟胚性愈伤组织的再生过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

1文献综述

1.1植物组培技术的发展概况

1.1.1木本植物器官发生途径研究进展

1.1.2木本植物体胚发生途径研究进展

1.2木本植物原生质体再生研究进展

1.3木本植物基因工程研究进展

1.3.1木本植物雄性不育基因工程研究进展

1.3.2木本植物抗虫基因工程研究进展

1.4本研究课题的目的和意义

2材料与方法

2.1香樟微繁体系的建立

2.1.1植物材料

2.1.2培养基（如无特殊说明，下同）

2.1.3培养条件

2.1.4胚芽萌发

2.1.5幼芽增殖

2.1.6试管苗的生根和移栽

2.2香樟叶片愈伤组织的诱导

2.2.1植物材料

2.2.2生长素种类及浓度对叶片愈伤组织的诱导

2.2.3细胞分裂素种类及浓度对叶片愈伤组织的诱导

2.3香樟体胚再生体系的建立

2.3.1植物材料

2.3.2诱导未成熟合子胚体胚发生的因素

2.3.3体胚的保持与增殖

2.3.4体胚的植株再生

2.3.5胚性愈伤组织的获得和保持

2.3.6胚性愈伤组织诱导植株再生

2.3.7石蜡切片的制作

2.3.8数据统计与分析

2.4香樟根癌农杆菌遗传转化体系的建立

2.4.1植物材料

2.4.2胚性愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验

2.4.3胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性试验

2.4.4根癌农杆菌菌株及质粒

2.4.5根癌农杆菌的活化和工程菌液的制备

2.4.6浸染和共培养

2.4.7转化条件的优化

2.4.8脱菌和选择培养

2.4.9 GFP基因转化香樟胚性愈伤

2.4.10人工雄性不育基因的转化香樟胚性愈伤

2.4.11 GUS基因瞬间表达的检测

2.4.12 GFP基因绿色荧光蛋白表达的检测

2.4.13试验培养基及各种试剂的配制

2.5抗性愈伤组织的PCR检测

2.5.1抗性愈伤组织基因组DNA和质粒DNA的提取

2.5.2抗性愈伤组织的PCR检测

2.6抗性愈伤组织的植株再生的诱导

2.7香樟原生质体分离，培养及植株再生

2.7.1细胞悬浮体系的建立

2.7.2植物材料

2.7.3混合酶液的制备

2.7.4原生质体的制备，洗涤和纯化

2.7.5原生质体产量的测定

2.7.6原生质体活力的测力

2.7.7影响原生质体分离的因素

2.7.8影响原生质体培养的因素

2.7.9原生质体再生

3结果与分析

3.1香樟微繁体系的建立

3.1.1胚芽萌发

3.1.2不同浓度BA对胚芽增殖诱导的影响

3.1.3试管苗的生根和移栽

3.2香樟叶片愈伤组织的诱导

3.2.1细胞分裂素种类及浓度对叶片愈伤组织诱导的影响

3.2.2细胞分裂素种类及浓度对叶片愈伤诱导组织的影响

3.3香樟体胚再生体系的建立

3.3.1基本培养基种类对香樟幼胚体胚发生的影响

3.3.2碳源种类对香樟幼胚体胚发生的影响

3.3.3腺嘌呤浓度对香樟幼胚体胚发生的影响

3.3.4植物生长调节剂对体胚发生的影响

3.3.5体胚的保持与增殖以及体胚的植株再生

3.3.6体胚的保持与增殖以及胚性愈伤组织的获得

3.3.7从胚性愈伤组织诱导植株再生

3.4香樟根癌农杆菌遗传转化体系的建立

3.4.1胚性愈伤组织对卡那霉素的敏感性分析

3.4.2胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性分析

3.4.3外植体对遗传转化的影响

3.4.4浸染时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响

3.4.5菌液浓度对胚性愈伤组织遗传转化的影响

3.4.6共培养时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响

3.4.7抗性愈伤组织的获得及继代增殖

3.4.8胚性愈伤组织的GUS基因表达的检测

3.4.9胚性愈伤组织的GFP基因表达的检测

3.4.10含有GUS基因的抗性愈伤组织的PCR检测

3.4.11含有GFP基因的抗性愈伤组织的PCR检测

3.4.12含有人工雄性不育基因的抗性愈伤组织的PCR检测

3.5抗性愈伤组织的植株再生的诱导

3.6香樟原生质体植株再生

3.6.1悬浮培养体系的建立

3.6.2酶解时间对原生质体分离的影响

3.6.3起始材料对原生质体分离的影响

3.6.4酶浓度对原生质体分离的影响

3.6.5原生质体的培养

3.6.6原生质体再生

4问题与讨论

4.1香樟体胚发生途径获得的植株的遗传稳定性

4.2体胚的形成过程

4.3影响体胚发生途径再生频率的因素

4.4影响香樟胚性愈伤组织遗传转化的因素

4.5应用遗传转化技术改良香樟的应用前景

4.6本研究的下一步工作

参考文献

附录

致谢