地锦体胚发生和遗传转化体系的建立及离体筛选耐盐植株的初步研究

摘要

地锦(Parthenocissus tricuspidata Planch.)是城市垂直绿化中重要的攀缘木本植物之一,因其生长迅速、攀缘力强、夏叶浓绿、秋叶紫红、适应性广,在世界上应用极为普遍,主要用于楼房墙体,道路坡面等的垂直绿化。目前,国内外最常栽培该属植物还有五叶地锦(Parthenocissus quinquefolia Planch.),它与地锦相比抗性强、生长快,但吸盘不发达,附着力较差。为了创造地锦属新的种质资源,丰富垂直绿化的植物材料,需对地锦特有性状如耐盐碱和抗干旱性能、生长速度等进行遗传改良,但是由于五叶地锦和地锦的种间不亲和使得通过传统有性杂交进行地锦遗传改良未能成功,现代植物生物技术的应用为地锦的遗传改良提供了新方法。
　　 围绕利用生物技术提高地锦耐盐碱性能这一目标,本研究在前人研究的基础上,首先以地锦叶柄为外植体,建立了有效的地锦叶柄体胚发生途径的植株再生体系,并获得了胚性愈伤组织。其次,长期保存了地锦的胚性愈伤组织,并从胚性愈伤组织诱导大量体胚发生和植株再生,提高了地锦体胚再生频率；在此基础上,以胚性愈伤为转化受体,通过衡量抗性愈伤组织率的高低,对根癌农杆菌介导GUS报告基因转化地锦遗传转化的影响因素进行了研究,建立了地锦胚性愈伤组织遗传转化体系,为耐盐目的基因转化奠定了一定的基础。另外,以胚性愈伤组织为外植体,利用组织培养过程中发生的体细胞变异来筛选耐盐的愈伤组织和体胚,并在含NaCl的培养基上获得地锦耐盐再生植株。本研究的主要研究结果如下:
　　 1.以地锦无菌苗40d龄的叶柄为外植体,建立了地锦叶柄体胚发生途径的植株再生体系,并成功地获得了胚性愈伤组织。研究结果表明:将叶柄接种在B5+0.5-2.0mg/L2,4-D+500mg/LCH+0.1g/LAC的培养基,不同的基因型均可以诱导胚性组织,然后将胚性组织接种在B5+1.0-2.0mg/LBA+0.1-0.3mg/LNAA+500mg/LCH的培养基上可诱导体胚产生。90％的正常体胚在不加激素的MS培养基上均可一次性长成根茎叶完整的植株,畸形胚在MS+1.0mg/LBA+0.01mg/LNAA+500mg/LCH的培养基中可先诱导芽后在1/2MS+0.5mg/LIBA上诱导根的形成,不同基因型形成体胚和再生植株的能力存在显著性差异。通过组织切片技术,观察了地锦体胚发生过程中的不同形态的胚性培养物和体胚,证实了地锦植株再生过程是经过体胚发生途径进行再生。将根系发育完好的再生植株移栽后,植株生长和外观形态表现正常。
　　 2.探讨了胚性愈伤组织长期保存的方法,并从长期继代的胚性愈伤组织中诱导了大量的体胚,提高了体胚再生频率。此外,利用ISSR标记分析了再生植株的变异情况。结果表明,在MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LNAA+500mg/LCH培养基上,在弱光照培养条件下,胚性愈伤组织能快速增殖并保持较好的胚胎发生能力。培养基中添加适量的BA与生长素(NAA或2,4-D)可促使长期继代的胚性愈伤组织形成体胚,形成体胚的数目最高可达61/gFW(鲜重FreshWeight),ISSR分析结果表明再生过程中存在体细胞变异。
　　 3.通过对农杆菌介导地锦胚性愈伤组织遗传转化的诸多影响因素如农杆菌菌株、共培养时间、农杆菌侵染液浓度、侵染时间和AS的浓度等进行比较研究,建立了根癌农杆菌介导地锦胚性愈伤组织遗传转化体系。研究结果表明:菌株EHA105与菌株C58相比具有较强的侵染力,胚性愈伤组织侵染最适宜的农杆菌菌液浓度为OD600=0.7,侵染时间为40min,4d共培养时间和在共培养培养基中添加100μMAS有利于提高转化效率,利用这些参数能使抗性愈伤组织率达到42.6％左右。GUS组织化学染色、PCR分析和Southern杂交证实外源GUS报告基因已整合到转化植物基因组中。
　　 4.利用组织培养技术筛选耐盐愈伤组织并获得了耐盐植株。首先探讨了不同NaCl浓度对地锦胚性愈伤组织增殖的影响,发现NaCl对胚性愈伤组织的增殖、存活率和愈伤的状态都有极大的影响,确定了盐半致死浓度和致死浓度分别为10g/L和20g/L,随后通过筛选耐盐愈伤得到了耐盐的体胚,并诱导其再生植株,所得植株与对照相比,表现出一定的抗盐性状,初步判断为耐盐植株。
　　 5.对体胚发生过程发生的畸形胚和次生胚现象、体胚再生体系遗传稳定性的影响因素、胚性愈伤组织遗传转化的影响因素及假转化体的问题和细胞工程技术提高地锦耐盐性能的可行性进行了讨论,并对应用基因工程提高地锦耐盐性的应用前景和下一步工作重点进行了分析。

目录

文摘

英文文摘

缩写词表

1 前言

1.1 文献综述

1.1.1 木本植物组织培养的发展概况

1.1.2 木本植物体胚发生途径研究进展

1.1.3 木本植物遗传转化的方法

1.1.4 根癌农杆菌介导木本植物遗传转化研究进展

1.1.5 耐盐植物育种研究进展

1.1.6 地锦属植物生物技术及育种研究进展

1.2 本研究的主要内容

2 材料和方法

2.1 地锦叶柄间接体胚再生体系的建立

2.1.1 植物材料

2.1.2 培养基配制及培养条件

2.1.3 地锦叶柄胚性组织诱导

2.1.4 体胚诱导

2.1.5 体胚成苗和植株再生

2.1.6 石蜡切片制作

2.1.7 数据统计与分析

2.2 地锦胚性愈伤组织增殖、体胚发生和植株再生

2.2.1 植物材料

2.1.2 试验所用的培养基及培养条件

2.1.3 地锦胚性愈伤组织的获得

2.2.4 胚性愈伤组织的增殖

2.2.5 体胚的诱导与成熟

2.2.6 体胚的成苗与植株再生

2.2.7 再生植株的ISSR分析

2.3 根癌农杆菌介导地锦遗传转化体系的建立

2.3.1 实验材料

2.3.2 抗生素、试验培养基及各种试剂的配制

2.3.3 根癌农杆菌介导地锦胚性愈伤遗传转化的过程

2.3.4 胚性愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验

2.3.5 卡那霉素对体胚诱导和成苗的影响

2.3.6 卡那霉素对再生苗生根的影响

2.3.7 胚性愈伤组织对潮霉素(Hyg)的敏感性试验

2.3.8 农杆菌菌株对转化的影响

2.3.9 共培养时间对转化的影响

2.3.10农杆菌处理茵液的浓度对转化的影响

2.3.11农杆菌菌液侵染时间对转化的影响

2.3.12 AS对转化的影响

2.3.13转化体的GUS基因检测(组织化学染色法)

2.4 转基因植株的分子生物学检测

2.4.1 大肠杆菌中质粒DNA的提取

2.4.2 地锦叶片基因组总DNA提取

2.4.3 PCR分析

2.4.4 Southern杂交分析

2.5 离体筛选地锦耐盐植株的研究

2.5.1 植物材料

2.5.2 不同浓度NaCl对胚性愈伤组织增殖的影响

2.5.3 耐盐愈伤组织变异细胞系的筛选

2.5.4 耐盐愈伤组织诱导体胚形成和植株再生

3 结果与分析

3.1 地锦叶柄诱导体胚发生和植株再生体系的建立

3.1.1 胚性组织的诱导

3.1.2 体胚的诱导

3.1.3 体胚的成苗和植株再生

3.2 地锦胚性愈伤增殖、体胚发生和植株再生

3.2.1 胚性愈伤组织的获得

3.2.2 胚性愈伤组织的增殖和保持

3.2.3 体胚的诱导与成熟

3.2.4 体胚成苗与植株再生

3.2.5 地锦体胚再生系统的遗传稳定性分析

3.3 地锦遗传转化体系的建立

3.3.1 胚性愈伤组织对卡那霉素的敏感性分析

3.3.2 卡那霉素对体胚诱导和成苗的影响

3.3.3 卡那霉素标记生根选择压力的确定

3.3.4 地锦胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性分析

3.3.5 农杆菌菌株对转化的影响

3.3.6 共培养时间对转化的影响

3.3.7 菌液浓度对胚性愈伤组织遗传转化的影响

3.3.8 侵染时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响

3.3.9 乙酰丁香酮对转化效率的影响

3.3.10卡那霉素标记的GUS基因的转化及转基因植株再生

3.3.11潮霉素标记的GUS基因的转化

3.3.12转化体的GUS基因检测

3.4 转基因植株的分子生物学检测

3.4.1 PCR分析

3.4.2 植物总DNA酶切

3.4.3 Southern杂交分析

3.5 离体筛选地锦耐盐植株的研究

3.5.1 不同NaCl浓度对愈伤生长和增殖的影响

3.5.2 耐盐愈伤组织变异细胞系的筛选

3.5.3 耐盐体胚成苗和植株再生

4 讨论

4.1 地锦体细胞胚胎发生和植株再生

4.2 地锦体胚再生体系的遗传稳定性问题

4.3 影响地锦胚性愈伤组织遗传转化的因素

4.3.1 愈伤组织的生长状态

4.3.2 共培养时间的影响

4.3.3 乙酰丁香酮(AS)的影响

4.3.4 抗生素选择标记的影响

4.4 假转化体的问题

4.5 利用细胞工程技术提高地锦耐盐性能的可行性

4.6 应用植物基因工程改良地锦耐盐性的应用前景

4.7 本研究的下一步工作

参考文献

附录

致谢