MC1R基因突变检测特异性引物和液相芯片

摘要

本发明公开了一种MC1R基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对C451T位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8，针对C478T位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10，和/或针对G565T位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种MC1R基因突变 检测特异性引物和液相芯片。

背景技术

黑素皮质素1型受体（melanocortin 1receptor，MC1R）位于16号染色体16q24.3长臂上， 具体位于16号染色体89984286到89987384碱基对之间。MC1R是黑素皮质素受体 （melanocortin receptor，MCR）家族中最小的一个(297～317个氨基酸)，该家族都是G蛋白耦 合受体，有7个跨膜功能域，其天然配体为黑素皮质素激素肽。现已明确黑素皮质素系统（MC） 广泛参与了多种生理通路的调控，包括色素沉着、摄食行为、体重和能量代谢平衡、抗感染、 性功能和疼痛等功能。MC1R主要在黑色素细胞中表达，MC1R基因变异能增加黑肤色个体 罹患肿瘤的风险，另外MC1R基因还是一个主要的雀斑基因。

目前，MC1R基因突变检测方法主要有：Illumina光纤微珠芯片技术、基质辅助激光解析 电离时间飞行质谱技术（MALDI-TOF-MS）和荧光定量PCR技术，虽然Illumina光纤微珠芯 片技术是高灵敏度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以 满足实际应用的需要。基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白 质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身 的特殊性，检测受到一定的限制。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度 高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型。

发明内容

本发明的目的之一是提供MC1R基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行 检测MC1R基因三种常见基因型C451T、C478T和G565T的野生型和突变型。

实现上述目的的技术方案如下。

一种MC1R基因突变检测液相芯片，包括有：

（A）.针对MC1R基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条 ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异 性引物序列为：针对C451T位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8，针对C478T位点的SEQ ID NO.9 及SEQ ID NO.10，和/或针对G565T位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；所述tag序列选自 SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；

（B）.有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微 球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18，且所 述anti-tag序列能相应地与（A）中所选的tag序列互补配对；

（C）.用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。

在其中一个实施例中，所述扩增引物为：针对C451T、C478T位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，和/或针对G565T位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22。

在其中一个实施例中，所述ASPE引物为：针对C451T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7 组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8组成的序列，针对C478T位点的由SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10组成的序列，和/或针对G565T位点 的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.12组成的序列。

本发明的另一目的是提供用于MC1R基因突变检测的特异性引物。

实现上述目的技术方案如下。

用于MC1R基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为：针对C451T位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8，针对C478T位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10，和/或针对G565T 位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12。

本发明的主要优点在于：

1.本发明所提供的MC1R基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。 且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的MC1R基 因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本 上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物 的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取 了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位 点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引 物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低 于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检 测效果一致。

3.本发明的检测方法步骤简单，3种突变位点检测可通过一步PCR即可完成2条含有突变位点 的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可 大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。

4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有 的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。 检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结 果更加准确可靠。

具体实施方式

实施例1MC1R基因突变检测液相芯片，主要包括有：

一、ASPE引物

针对MC1R基因三种常见基因型C451T、C478T和G565T的野生型和突变型，分别设计 特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：

表1MC1R基因的ASPE引物序列（tag序列+特异性引物序列）

每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’ 端为突变型或野生型特异的引物片段（如上述表1所示）。所有ASPE引物由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL 的贮存液。

二、anti-tag序列包被的微球

根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序 列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的6种微球编号与微球上相 应的anti-tag序列如表2所示：

表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列

选择的6种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球 之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序 列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌 ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将 anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序 列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括 多聚dT，即poly（dT），寡聚四聚乙二醇以及（CH2）n间隔臂（n≥3），如（CH2）12、（CH2） 18等。另外，如果存在poly（dA）干扰，还可以用poly（TTG）作为间隔臂。本发明间隔臂 优选为5-10个T，微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球（购自Luminex公司）悬浮于50ul0.1mol/L的 MES溶液中（pH4.5），加入10ul合成的anti-tag分子（100nmol/ml）。配制10ng/ml的EDC（N- （3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide）（购自Pierce Chemical公司）工作液。往微球 悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30 分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后 的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris（pH8.0）]，1mmol/L EDTA中，2-8℃避光保存。

三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物

针对MC1R基因三种常见基因型C451T、C478T和G565T，设计扩增引物对（见表3）， 扩增出2条含有3个突变位点的目标序列。

表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物

所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用 10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

实施例2运用实施例1所述的MC1R基因突变检测液相芯片对样本的检测

所述各种溶液的配方如下：

50mM的MES缓冲液（pH5.0）配方（250ml）：

2×Tm杂交缓冲液

过滤后贮存于4℃。

ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。

生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

一、样本的DNA提取：

参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。

二、待测样品的PCR扩增

设计2对引物，多重PCR一步扩增出2条分别含MC1R基因三种常见基因型C451T和 C478T、G565T的目标序列，产物大小分别为363bp、228bp，引物序列（SEQ IDNO.19-22） 见上述表3所示。

首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.19-22的引物贮存液100ul于1.5ml微 量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：

PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃ 保存备用。

三、PCR产物的酶切处理

1.取7.5ulPCR反应后的产物，加入1ul10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；

2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的 ASPE引物延伸反应。

四、位点特异的引物延伸反应（ASPE）

利用实施例1中设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的 dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE引物 贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE 混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：

反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。

五、杂交反应

1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的6种包被的微球（如实施例1所述），每种微球浓 度均为2.5×10⁵个/ml；

2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

3.微球于≥10000g离心1-2min；

4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；

5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH₂O；

6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH₂O补足至50ul；

7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；

8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；

9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；

10.微球于≥3000g离心2-5min；

11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红 蛋白（SA-PE）；

12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。

六、结果检测与数据分析

反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。

对荧光值（MFI）和数据处理有以下要求：

1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；

2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI（NET MFI小于0的以0表示）；

3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：

突变比值＝突变型NETMFI÷（突变型NETMFI＋野生型NETMFI）

4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值（cut-off值），以划分野生型纯合子、杂合 子和突变型纯合子。

使用本方法检测20份样本的MC1R基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可计算 得它们的突变比值。阈值（cut-off值）的设置如下：突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合 子；30%-70%视为杂合子；80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作 对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的MC1R基因 型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的MC1R基因SNP检测液相芯 片能够准确地检测出MC1R的SNP类型，且结果稳定可靠。

表4样本检测结果（MFI）之一

表5样本MC1R基因突变比值（%）

样品号 C451T C478T G565T 1 1% 2% 2% 2 2% 2% 2% 3 2% 2% 2% 4 1% 2% 2% 5 3% 1% 1% 6 2% 1% 2% 7 2% 1% 2% 8 2% 2% 2% 9 48% 3% 2% 10 1% 1% 2% 11 2% 3% 2% 12 2% 2% 1% 13 1% 2% 2% 14 1% 1% 97% 15 1% 2% 2% 16 2% 2% 1% 17 1% 99% 2% 18 3% 2% 1% 19 2% 2% 1% 20 1% 1% 2%

表6样本MC1R基因突变类型分析结果

实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对MC1R基因SNP位点的检测

一、液相芯片制备的设计（Tag序列及Anti-Tag序列的选择）

以MC1R基因C451T、C478T和G565T位点突变检测液相芯片为例，分别针对C451T、C478T 和G565T的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则 选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选 自SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18。具体设计如下表（表7）所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包 被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表7液相芯片制备的设计

一、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测 结果如下：

表8样本MC1R基因C451T检测结果与基因多态性分析

表9样本MC1R基因C478T检测结果与基因多态性分析

表10样本MC1R基因G565T检测结果与基因多态性分析

从上述实施例可见，其它针对不同突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的tag序列， 其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列 搭配时，效果更佳（信噪比更好），参见本实施例试验组1、试验组5和试验组9。其它不同tag 序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。

实施例4MC1R基因突变检测特异性引物序列的选择

一、液相芯片制备的设计（野生型和突变型特异性引物序列的选择）

以MC1R基因C451T和G565T的多态性位点检测液相芯片为例，以该突变位点所在 目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对C451T和G565T的野生型和突变型设计 ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备 选的特异性引物序列，如表11所示。其中，内碱基为多态性位点。

表11特异性引物序列

以MC1R基因C451T和G565T的多态性位点检测液相芯片为例，针对C451T和 G565T选用不同的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列则固定为实施例1中的最 佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表（表12）所示。ASPE引物 的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表12液相芯片制备的设计之二

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检 测结果如下：

表13样本MC1R基因C451T检测结果与基因多态性分析

表14样本MC1R基因G565T检测结果与基因多态性分析

由本实施例可见，ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时，效果更 佳（信噪比更好），参见本实施例试验组10和试验组13。其它来源于目标检测位点所在序 列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的 结果相同，即依然是实施例2中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳，具 体数据省略。

其它针对不同的SNP位点的多种特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施 例的结果相同，即实施例1所选择的特异性引物，具有更好的信噪比，检测效果也更好，具 体数据省略。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此 而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。