罗丹明6G酰肼衍生物、其制备方法、应用及作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法

摘要

本发明公开了一种罗丹明6G酰肼衍生物、其制备方法、应用及作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法，该罗丹明6G酰肼衍生物可选择性地与次氯酸发生反应，快速产生明显的荧光增强效应。本发明可以在水中和细胞内实现对微量次氯酸的高灵敏性和高选择性的定量检测，在环境和生物等领域有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测次氯酸的衍生物、其制备方法、应用及检测方 法，具体涉及一种罗丹明6G酰肼衍生物、其制备方法、应用及作为荧光 探针对次氯酸进行荧光分析的方法。

背景技术

次氯酸(HOCl)是一种强氧化剂，能够在环境水处理过程中和活性 生物体内起到抗菌作用。在日常生活中，次氯酸因为杀菌效果好、价格 低廉和使用方便，已被广泛地用作自来水消毒剂。但是高浓度的次氯酸 溶液刺激性强，伤害呼吸系统，易与水中有机物反应生成氯仿、四氯化 碳等严重致癌物质，对人类的健康存在着潜在的危害。在生物体内，次 氯酸是一类重要的活性氧物种(ROS)，在许多具有重要生理学和生物学 意义的过程中起着关键性的作用。但是过量次氯酸的形成会诱发组织损 伤，引起动脉硬化、关节炎甚至癌症等系列疾病的产生。因此，发展具 有高灵敏性和高选择性的分析试剂和检测方法，用于环境和生物体内次 氯酸的检测，具有十分重要的应用价值。

目前，检测次氯酸的方法主要有硫代硫酸钠滴定法(HG/T 2498-93)、邻联甲苯胺比色法(GB5750-85)和四甲基联苯胺(TMB) 比色法等。这些试剂选择性差，易受干扰，在应用方面有很大限制。另 外，近年来发展的若干有机荧光探针对次氯酸检测显示出较好的灵敏性、 选择性和生物相容性(Org.Lett.2013，15：878-881；J.Am.Chem. Soc.2012，134：1200-1211；Chem.Eur.J.2012，18：2700-2706； J.Am.Chem.Soc.2011，133：5680-5682；Chem.Commun.2011，47： 12691-12693)。但是，这些试剂的合成过程工序繁琐、技术复杂，制约 了它们在环境分析和生物分析中的实际应用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供了一种罗丹明6G 酰肼衍生物、其制备方法、应用及作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析 的方法，该罗丹明6G酰肼衍生物可以有效对次氯酸进行检测。

为达到上述目的，本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的化学结构为

相应的，本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步 骤：

1)称取一定量的罗丹明6G、乙醇以及质量浓度为80％的肼一水化合 物，并将罗丹明6G溶解于乙醇中，再逐滴加入肼一水化合物，然后经回 流及过滤后得沉淀，洗涤及干燥后，得粉红色固体的罗丹明6G酰肼，其 中罗丹明6G、乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g∶20-30mL∶2-4mL；

2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈，然后将1-萘甲酰氯溶解到 乙腈中，得1-萘甲酰氯的乙腈溶液，其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1- 萘甲酰氯与乙腈的比例为76-115μL∶10-15mL；

3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈，然后将罗丹明6G酰肼溶解 到乙腈中，得罗丹明6G酰肼的乙腈溶液，其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶 液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为0.21g∶15-25mL；

4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3) 得到的罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中，其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰 氯的物质的量的比为1∶1-1.5，并在温度为40-60℃的条件下搅拌反应， 然后冷却至室温，并去除溶剂，再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗丹 明6G酰肼衍生物。

步骤1)回流时间为2-4h；

步骤4)搅拌时间为4-8h；

步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90℃的石油醚及乙酸 乙酯的混合物为洗脱剂进行洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为 5∶1-3∶2。

所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为对次氯酸进行荧光分析的荧光探 针的应用。

相应的，本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸 进行荧光分析的方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇，然后将罗丹明6G 酰肼衍生物溶解到乙醇中，得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液，其中罗 丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的溶度为 0.1-1.0mM；

2)将相同体积的N份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇 溶液分别放置于N个离心管中，然后给N个离心管中分别加入N组不同 体积的次氯酸钠标准溶液，再通过磷酸盐缓冲溶液定容，得N组混合溶 液，其中，N组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度均为10-50μM， N组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比均为1∶ 0.05-3.5，N为正整数，然后再将得到的N组混合溶液放置到室温环境 中，待其反应完成后，将N组反应完成后的混合溶液分别放置到石英比 色皿中，设置激发和发射狭缝宽度为2.5-5.0nm，光电倍增管电压为 700V，用480-510nm范围的波长激发，测得N组荧光发射光谱，然后再 根据测得的N组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光分析。

步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10-100mM，pH值为7.0-7.4；

步骤2)室温反应时间为2-10min。

本发明具有以下有益效果：

本发明制备的罗丹明6G酰肼衍生物可以选择性的与次氯酸发生反 应，产生明显的荧光增强效应；反应速度快，短时间内即可显示出强烈 的荧光，并且荧光检测信号十分稳定；灵敏度高，当次氯酸浓度为0.05 μM时也能产生明显的荧光响应；具有很高的选择性，仅在次氯酸存在 的条件下，该罗丹明6G酰肼衍生物显示明显的荧光信号，其他常见的金 属离子和活性物种均不产生干扰。本发明提供的荧光探针合成方法简单 便捷，适用于水中和细胞内微量次氯酸的高灵敏性和高选择性的荧光检 测，在环境和生物等领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明中实施例六得到的荧光发射光谱；

图2为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的反应体系的荧光强 度对次氯酸浓度的工作曲线；

图3为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的反应体系的荧光强 度对反应时间的工作曲线；

图4为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物对次氯酸和各种常见金属离子 的荧光响应强度；

图5为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物对次氯酸和各种常见活性物种 的荧光响应强度；

图6为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物对A549细胞中次氯酸的共聚 焦荧光成像。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的化学结构为

以下将结合实施例来说明罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法。

实施例一

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G、乙醇以及质量浓度为80％的肼一水化合 物，并将罗丹明6G溶解于乙醇中，再逐滴加入肼一水化合物，然后经回 流及过滤后得沉淀，洗涤及干燥后，得粉红色固体的罗丹明6G酰肼，其 中罗丹明6G、乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g∶20mL∶3mL；

2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈，然后将1-萘甲酰氯溶解到 乙腈中，得1-萘甲酰氯的乙腈溶液，其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1- 萘甲酰氯与乙腈的比例为100μL∶15mL；

3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈，然后将罗丹明6G酰肼溶解 到乙腈中，得罗丹明6G酰肼的乙腈溶液，其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶 液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为0.21g∶15mL；

4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3) 得到的罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中，其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰 氯的物质的量的比为1∶1.3，并在温度为40℃的条件下搅拌反应，然后 冷却至室温，并去除溶剂，再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗丹明6G 酰肼衍生物。

步骤1)回流时间为2.5h；

步骤4)搅拌时间为8h；

步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90℃的石油醚及乙酸 乙酯的混合物为洗脱剂进行洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为 5∶1。

实施例二

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G、乙醇以及质量浓度为80％的肼一水化合 物，并将罗丹明6G溶解于乙醇中，再逐滴加入肼一水化合物，然后经回 流及过滤后得沉淀，洗涤及干燥后，得粉红色固体的罗丹明6G酰肼，其 中罗丹明6G、乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g∶30mL∶2mL；

2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈，然后将1-萘甲酰氯溶解到 乙腈中，得1-萘甲酰氯的乙腈溶液，其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1- 萘甲酰氯与乙腈的比例为90μL∶13mL；

3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈，然后将罗丹明6G酰肼溶解 到乙腈中，得罗丹明6G酰肼的乙腈溶液，其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶 液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为0.21g∶20mL；

4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3) 得到的罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中，其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰 氯的物质的量的比为1∶1.5，并在温度为50℃的条件下搅拌反应，然后 冷却至室温，并去除溶剂，再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗丹明6G 酰肼衍生物。

步骤1)回流时间为4h；

步骤4)搅拌时间为6h；

步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90℃的石油醚及乙酸 乙酯的混合物为洗脱剂进行洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为 2∶1。

实施例三

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G、乙醇以及质量浓度为80％的肼一水化合 物，并将罗丹明6G溶解于乙醇中，再逐滴加入肼一水化合物，然后经回 流及过滤后得沉淀，洗涤及干燥后，得粉红色固体的罗丹明6G酰肼，其 中罗丹明6G、乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g∶25mL∶4mL；

2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈，然后将1-萘甲酰氯溶解到 乙腈中，得1-萘甲酰氯的乙腈溶液，其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1- 萘甲酰氯与乙腈的比例为115μL∶11mL；

3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈，然后将罗丹明6G酰肼溶解 到乙腈中，得罗丹明6G酰肼的乙腈溶液，其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶 液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为0.21g∶25mL；

4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3) 得到的罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中，其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰 氯的物质的量的比为1∶1.2，并在温度为55℃的条件下搅拌反应，然后 冷却至室温，并去除溶剂，再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗丹明6G 酰肼衍生物。

步骤1)回流时间为2h；

步骤4)搅拌时间为5h；

步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90℃的石油醚及乙酸 乙酯的混合物为洗脱剂进行洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为 3∶2。

实施例四

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G、乙醇以及质量浓度为80％的肼一水化合 物，并将罗丹明6G溶解于乙醇中，再逐滴加入肼一水化合物，然后经回 流及过滤后得沉淀，洗涤及干燥后，得粉红色固体的罗丹明6G酰肼，其 中罗丹明6G、乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g∶28mL∶2.5mL；

2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈，然后将1-萘甲酰氯溶解到 乙腈中，得1-萘甲酰氯的乙腈溶液，其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1- 萘甲酰氯与乙腈的比例为76μL∶10mL；

3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈，然后将罗丹明6G酰肼溶解 到乙腈中，得罗丹明6G酰肼的乙腈溶液，其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶 液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为0.21g∶22mL；

4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3) 得到的罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中，其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰 氯的物质的量的比为1∶1，并在温度为60℃的条件下搅拌反应，然后冷 却至室温，并去除溶剂，再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗丹明6G 酰肼衍生物。

步骤1)回流时间为3h；

步骤4)搅拌时间为4h；

步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90℃的石油醚及乙酸 乙酯的混合物为洗脱剂进行洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为 5∶2。

对本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物分别进行核磁共振氢谱测定、 核磁共振碳谱测定及高分辨质谱测定，测定结果如下：

核磁共振氢谱测定：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，6(ppm)：8.04(m， 1H)，7.80-7.67(m，3H)，7.54-7.49(m，2H)，7.43(m，2H)，7.34-7.32 (m，1H)，7.12-7.07(m，2H)，6.54(s，2H)，6.36(s，2H)，3.56(br， 2H)，3.18(q，J＝6.3Hz，4H)，3.0(br，1H)，1.91(s，6H)，1.28 (t，J＝7.0Hz，6H)。

核磁共振碳谱测定：¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)，6(ppm)：167.0， 164.8，152.3，151.4，147.6，133.2，132.0，130.5，130.2，129.2， 128.4，127.8，127.0，126.3，125.5，125.1，124.4，124.2，123.5， 117.8，104.7，96.3，66.3，38.2，29.6，16.6，14.7。

高分辨质谱测定：HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺calcd for C₃₇H₃₅N₄O₃： 583.2709，Found：583.2689。

所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为对次氯酸进行荧光分析的荧光探 针的应用。

以下将通过实施例来具体说明：

实施例一

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧 光分析的方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇，然后将罗丹明6G 酰肼衍生物溶解到乙醇中，得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液，其中罗 丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的溶度为0.1mM；

2)将相同体积的五份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇 溶液分别放置于五个离心管中，然后给五个离心管中中分别加入五组不 同体积的次氯酸钠标准溶液，再通过磷酸盐缓冲溶液定容，得五组混合 溶液，其中，五组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度均为10μM， 五组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比分别为 1∶0.05、1∶0.3、1∶0.8、1∶2.0及1∶3.5，然后再将得到的五组混 合溶液放置到室温环境中，待其反应完成后，将五组反应完成后的混合 溶液分别放置到石英比色皿中，设置激发和发射狭缝宽度为5.0nm，光 电倍增管电压为700V，用480nm的波长激发，测得五组荧光发射光谱， 然后再根据测得的五组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光分析。

步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为100mM，pH值为7.4；

步骤3)室温反应时间为2min。

实施例二

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧 光分析的方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇，然后将罗丹明6G 酰肼衍生物溶解到乙醇中，得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液，其中罗 丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的溶度为0.4mM；

2)将相同体积的八份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇 溶液分别放置于八个离心管中，然后给八个离心管中分别加入八组不同 体积的次氯酸钠标准溶液，再通过磷酸盐缓冲溶液定容，得八组混合溶 液，其中，八组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度均为30μM，八 组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比分别为1∶ 0.05、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.4、1∶2.0及1∶3.5， 然后再将得到的八组混合溶液放置到室温环境中，待其反应完成后，将 八组反应完成后的混合溶液分别放置到石英比色皿中，设置激发和发射 狭缝宽度为3nm，光电倍增管电压为700V，用490nm的波长激发，测得 八组荧光发射光谱，然后再根据测得的八组荧光发射光谱对次氯酸进行 荧光分析。

步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为80mM，pH值为7.3；

步骤3)室温反应时间为3min。

实施例三

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧 光分析的方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇，然后将罗丹明6G 酰肼衍生物溶解到乙醇中，得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液，其中罗 丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的溶度为0.5mM；

2)将相同体积的十份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇 溶液分别放置于十个离心管中，然后给十个离心管中分别加入十组不同 体积的次氯酸钠标准溶液，再通过磷酸盐缓冲溶液定容，得十组混合溶 液，其中，十组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度均为40μM，十 组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比均为1∶ 0.05、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.4、1∶2.0、1∶3.0、1∶ 3.2及1∶3.5，然后再将得到的十组混合溶液放置到室温环境中，待其 反应完成后，将十组反应完成后的混合溶液分别放置到石英比色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为3nm，光电倍增管电压为700V，用500nm的 波长激发，测得十组荧光发射光谱，然后再根据测得的十组荧光发射光 谱对次氯酸进行荧光分析。

步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为50mM，pH值为7.2；

步骤3)室温反应时间为5min。

实施例四

本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧 光分析的方法包括以下步骤：

1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇，然后将罗丹明6G 酰肼衍生物溶解到乙醇中，得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液，其中罗 丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的溶度为1.0mM；

2)将相同体积的十二份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙 醇溶液分别放置于十二个离心管中，然后给十二个离心管中分别加入十 二组不同体积的次氯酸钠标准溶液，再通过磷酸盐缓冲溶液定容，得十 二组混合溶液，其中，十二组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度均 为50μM，十二组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量 的比分别为1∶0.05、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶ 1.4、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.2及1∶3.5，然后再将得到的十 二组混合溶液放置到室温环境中，待其反应完成后，将十二组反应完成 后的混合溶液分别放置到石英比色皿中，设置激发和发射狭缝宽度为 2.5nm，光电倍增管电压为700V，用510nm的波长激发，测得十二组荧 光发射光谱，然后再根据测得的十二组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光 分析。

步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM，pH值为7.0；

步骤3)室温反应时间为10min。

实施例五

1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇，然后将罗丹明6G 酰肼衍生物溶解到乙醇中，得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液，其中罗 丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的溶度为1.0mM；

2)将相同体积的十六份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙 醇溶液分别放置于十六个离心管中，然后给十六个离心管中分别加入十 六组不同体积的次氯酸钠标准溶液，再通过磷酸盐缓冲溶液定容，得十 六组混合溶液，其中，十六组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度均 为50μM，十六组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量 的比均为1∶0.05、1∶0.1、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、 1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶2.0、1∶2.2、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.2 及1∶3.5，然后再将得到的十六组混合溶液放置到室温环境中，待其反 应完成后，将十六组反应完成后的混合溶液分别放置到石英比色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为5.0nm，光电倍增管电压为700V，用500nm 的波长激发，测得十六组荧光发射光谱，然后再根据测得的十六组荧光 发射光谱对次氯酸进行荧光分析。

步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM，pH值为7.4；

步骤2)室温反应时间为2min。

实施例六

1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇，然后将罗丹明6G 酰肼衍生物溶解到乙醇中，得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液，其中罗 丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的溶度为1.0mM；

2)将相同体积的二十份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙 醇溶液分别放置于二十个离心管中，然后给二十个离心管中分别加入二 十组不同体积的次氯酸钠标准溶液，再通过磷酸盐缓冲溶液定容，得二 十组混合溶液，其中，二十组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度均 为10μM，二十组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量 的比分别为1∶0.05、1∶0.1、1∶0.15、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶ 0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0、1∶ 2.2、1∶2.5、1∶2.8、1∶3.0、1∶3.2及1∶3.5，然后再将得到的二 十组混合溶液放置到室温环境中，待其反应完成后，将二十组反应完成 后的混合溶液分别放置到石英比色皿中，设置激发和发射狭缝宽度为 5.0hm，光电倍增管电压为700V，用500nm的波长激发，测得二十组荧 光发射光谱，然后再根据测得的二十组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光 分析。

步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM，pH值为7.4；

步骤2)室温反应时间为10min。

经检测，图1为实施例六中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的反应体系 的荧光发射光谱。图2为次氯酸浓度在0.5-35μM范围内，10μM罗丹明 6G酰肼衍生物与次氯酸的反应体系在550nm荧光发射波长处的荧光强度 对次氯酸浓度的工作曲线。图1和图2所示结果表明，罗丹明6G酰肼衍生 物本身没有荧光，但可以与次氯酸发生反应，产生明显的荧光增强效应， 而且具有长的荧光激发波长(500nm)和长的最大发射波长(550nm)；当 次氯酸浓度为0.5μM时也能产生明显的荧光响应，并且随着次氯酸浓度 的提高，反应体系的荧光强度逐渐增强。使用10μM罗丹明6G酰肼衍生物 时，550nm的荧光发射强度在0-25μM次氯酸浓度范围内呈线性关系。 次氯酸浓度达到约30μM时，550nm的荧光发射强度增加了1800倍并达到 最大。因此，该罗丹明6G酰肼衍生物对次氯酸具有很高的检测灵敏性。

图3所示结果表明，罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸反应速度快，2 min内即可显示出强烈的荧光，继而荧光信号在1h内基本保持不变。因 此，罗丹明6G酰肼衍生物不仅本身具有优良的光学稳定性，而且该荧光 探针能够迅速捕获次氯酸，反应后也具有高的光稳定性。荧光探针背景 信号和检测信号的稳定性确保了实验方法的准确性。

罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸和各种常见金属离子 的选择性研究：

将10μL浓度为1.0mM的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液加入到离心 管中，再分别加入适量的次氯酸钠标准溶液或各种金属离子的标准溶液， 使体系中次氯酸的浓度为2μM，或者其他各种金属离子的浓度分别为 [Ca²⁺]＝[Cu²⁺]＝400μM，[Mg²⁺]＝[K⁺]＝[Na⁺]＝[Ni²⁺]＝[Cr²⁺]＝[Hg²⁺] ＝500μM，[Zn²⁺]＝[Mn²⁺]＝[Co²⁺]＝[Cd²⁺]＝300μM，[Fe³⁺]＝200μM， [Pb²⁺]＝100μM，然后用浓度为10mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液定容到 1mL，在室温下含有次氯酸的溶液反应2min，其他含有金属离子的溶液反 应10min，再分别将样品放置于光径为1.0em、体积为1.0mL的石英比色皿 中，设置激发和发射狭缝宽度为5.0nm，光电倍增管电压为700V，用500nm 的波长激发，测量其荧光发射光谱。

图4为10μM罗丹明6G酰肼衍生物分别对浓度为2μM的次氯酸和各种 不同浓度的常见金属离子的荧光响应强度。

罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸和各种常见活性物种的 选择性研究：

各种活性物种按照下面的方法制备：

H₂O₂：H₂O₂标准溶液在室温下加入。

ROO·：由2，2’-偶氮(2-甲基丙基脒)二盐酸盐生成。

NO·：由氰铁(III)硝酸钠二水化合物生成。

·O₂^-：超氧化物从黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系产生。黄嘌呤氧化酶先 加入检测体系，待其溶解后，溶解于1.6M NaOH溶液中的黄嘌呤储备液 再加入。

·OH：氯化亚铁加入10倍浓度的H₂O₂中。

ONOO^-：含有0.01mol/L的羟胺、0.8mol/L的氢氧化钠和0.001mol/L 的EDTA在需氧条件下剧烈搅拌4-5h，之后加入少量的MnO₂粉末以除去 反应溶液中产生的H₂O₂。溶液过滤后保存在-18℃。过氧亚硝酸盐的浓 度通过在302nm的紫外吸收测量(ε＝1670L·mol^-1·cm^-1)(Talanta2002， 57：883-890)。

¹O₂：由ONOO^-和10倍浓度的H₂O₂制备(FEBS Lett.1994，355： 287-289)。

HOCl：NaOCl标准溶液在室温下加入。

将10μL浓度为1.0mM的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液加入到离心 管中，再分别加入适量的活性物种的标准溶液，使体系中次氯酸的浓度 为2μM，或者其他各种活性物种的浓度依次为10μM、50μM和100μM， 然后用10mM磷酸盐(pH为7.4)缓冲溶液定容到1mL。室温下含有次氯酸 的溶液反应2min，含有·OH、ONOO^-、¹O₂的溶液反应10min，含有NO·的溶液 反应30min，含有H₂O₂、ROO·和·O₂^-的溶液反应60min。分别将样品放置于 光径为1.0cm、体积为1.0mL的石英比色皿中，设置激发和发射狭缝宽度 为5.0nm，光电倍增管电压为700V，用500nm的波长激发，测量其550nm 的荧光发射强度。

图5为10μM罗丹明6G酰肼衍生物分别对2μM次氯酸和10μM、 50μM、100μM各种常见活性物种的荧光响应强度。

图4及图5所示，罗丹明6G酰肼衍生物对各种常见的金属离子和活 性物种几乎没有任何响应，仅在次氯酸存在的条件下显示明显的荧光信 号。因此，该罗丹明6G酰肼衍生物对次氯酸具有很高的选择性。

罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对A549细胞中的次氯酸荧光成像 分析：

浓度为1×10⁶个/mL的A549细胞培养在DMEM培养基中，培养基内加 入10％的牛胎血清，50unit/mL青霉素和50μg/mL链霉素，置于37℃的通 入5％CO₂/95％空气的细胞培养箱中，培养基每2天更换一次。进行实验24h 前，细胞直接接种到6孔培养皿中的无菌玻璃盖玻片上，用培养基稀释至 浓度为1×10⁴个/mL。A549细胞分别用含有不同浓度的次氯酸钠培养基 在37℃下孵育30min。用0.10M磷酸盐缓冲液(pH为7.4)洗涤三次后，所 有的细胞都与10μM罗丹明6G衍生物在培养基中37℃下孵育30min。荧光 成像前，所有的细胞都用0.10M磷酸盐缓冲液(pH为7.4)再洗涤三次。 活细胞荧光成像用激光扫描共聚焦显微镜检测，物镜放大倍数为100×， 激发波长为488nm。

图6为10μM罗丹明6G酰肼衍生物对A549细胞中含有(a)0，(b) 0.5μM，(c)5μM，(d)10μM次氯酸的共聚焦荧光成像。

图6所示结果表明，罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针穿透细胞膜 进入到细胞质中，含有探针的A549细胞不经过次氯酸处理，显示了可忽 略不计的细胞背景荧光信号。含有探针的细胞经过次氯酸处理后却显示 了强的绿色荧光，并且细胞的荧光强度随着加入的次氯酸浓度的增加而 显著增强。