一种强效降压磷酸肽及其制备方法

摘要

本发明涉及一种强效降压磷酸肽及其制备方法，属多肽的序列改造及其化学合成制备技术领域。麝香蛸素是已知肽类中最有效的降压物质，但存在作用持续时间极短的致命缺点，限制了其有效应用。本发明利用磷酸化修饰技术和氨基酸序列改造技术，对麝香蛸素的多肽序列进行改造，设计了两个新的磷酸肽序列：磷酸肽1和磷酸肽2，并公开了磷酸肽1和磷酸肽2的制备方法，主要包括磷酸肽的化学合成和二氧化钛纯化方法。通过活性测定表明本发明公开的磷酸肽1和磷酸肽2比麝香蛸素的活性更高、作用持续时间更长，有望在医药等领域发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种强效降压磷酸肽及其制备方法，属多肽的序列改造及其化学合成制备技术领域，在医药等领域具有重要的应用价值。

背景技术

多肽类生化物质具有“剂量低、活性高、起效快、安全比高、副作用小”等小分子物质无可比拟的优点，其中麝香蛸素(Eledoisin)是从麝香蛸(Eledone)中提取得到的含11个氨基酸的多肽，具有强烈的外周血管舒张及增加冠脉血流量的作用，是已知肽类中最有效的降压物质，其效应比硝酸甘油强数千倍。因此麝香蛸素类多肽在医药等领域具有重要的应用价值。但麝香蛸素存在一个致命缺点是，很容易被体内活性酶酶解失效，作用持续时间极短，限制了其有效应用。

麝香蛸素的多肽序列为Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂，对其序列进行结构改造有望进一步提高其活性和作用持续时间，但该方面的研究目前尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的在于对麝香蛸素多肽序列进行改造，设计新的多肽序列，提高其降压活性、延长其作用持续时间。并提供改造后多肽序列的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

由于磷酸肽通常具有很高活性，在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置通常在带有羟基的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)上。观察到麝香蛸素多肽序列中从羧基端开始第9位氨基酸为Ser，所以本发明的序列改造设计如下：

将9位Ser进行磷酸化修饰，得到磷酸肽1的序列：

Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂

将9位Ser进行磷酸化修饰，并将4位Ile替换为Tyr，进行磷酸化修饰，得到磷酸肽2的序列：

Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂

对其进行化学合成和纯化的具体步骤如下：

(1)带有保护基的多肽片段的合成：先后用N，N-二甲基甲酰胺DMF、N，N-二甲基甲酰胺DCM∶氯甲烷＝1∶2的混合液浸泡RINK AMIDE-MBHA树脂，然后用20％哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，接着在树脂中加入羧基端的第一个氨基酸Fmoc-Met-OH，4倍Fmoc-Met-OH摩尔数的TBTU/HoBt/DIEA/DMF溶液，将第一个氨基酸耦合到树脂上，用DMF、DCM、DMF各洗涤三遍，用kaiser’s试剂检测反应完全，再用20％哌啶/DMF脱除羧基端的第一个氨基酸Fmoc-Met-OH氨基的Fmoc保护，用DMF、DCM、DMF各洗涤三遍，用kaiser’s试剂检测已脱除，之后依次加入Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH或Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Pyr-OH，按上述的耦合、洗涤、检测、脱保护条件进行，从而使多肽链延长，直到最后一个氨基酸Boc-Pyr-OH连接上为止，形成连有树脂的带有保护基的多肽Pyr-Pro-Ser-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2或Pyr-Pro-Ser-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2；

(2)磷酸化修饰：先用亚磷酰胺试剂二苯基N，N′-二异丙基亚磷酰胺在四氮唑催化下，将含有丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、苏氨酸Thr中的一种或以上的多肽生成亚磷酸三酯，然后用氧化剂过氧化叔丁醇，将其氧化成相应的磷酸三酯：连有树脂的带有保护基的多肽Pyr-Pro-Ser(PO3H)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-lle-Gly-Leu-Met-NH2或Pyr-Pro-Ser(PO3H)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2；

(3)切除与沉淀：采用三氟乙酸切除溶液切除树脂并选择性地脱去保护基后，得到磷酸化的目标产物：磷酸肽1Pyr-Pro-Ser(PO3H)-LysAsp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2或磷酸肽2Pyr-Pro-Ser(PO3H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2，将上述切除液吹去溶剂后，用乙醚沉淀，得到磷酸肽粗品；

(4)磷酸肽纯化：使用填装有的二氧化钛纳米粒子的磷酸化多肽纯化装置，对磷酸肽1和磷酸肽2粗品进行分离纯化；

(5)鉴定：用色谱、质谱分析技术分析鉴定磷酸肽1和磷酸肽2。

本发明的有益效果是：

1、本发明公开了两个具有强效降压活性的磷酸肽序列及其制备方法。

2、本发明改造设计的磷酸肽1和磷酸肽2，比已知肽类中降压活性最强的麝香蛸素的活性更高、作用持续时间更长，改善了麝香蛸素的缺点，因此磷酸肽1和磷酸肽2有望在医药等领域发挥重要作用。

3、磷酸化修饰后的磷酸肽1和磷酸肽2，可以巧妙地借助修饰上的磷酸集团采用使用填装有的二氧化钛纳米粒子的磷酸化多肽纯化装置进行大量纯化，与传统HPLC比较，操作简便、快捷、经济。

附图说明

图1为本发明改造设计的磷酸肽1和磷酸肽2的制备方法路线图。

图2为本发明改造设计的磷酸肽1的HPLC色谱图。

图3为本发明改造设计的磷酸肽1的ESI-MS图。

图4为本发明改造设计的磷酸肽2的HPLC色谱图。

图5为本发明改造设计的磷酸肽2的ESI-MS图。

图6为麝香蛸素给药前后对大鼠的血压一时间变化关系图。

图7为磷酸肽1给药前后对大鼠的血压一时间变化关系图。

图8为磷酸肽2给药前后对大鼠的血压一时间变化关系图。

具体实施方式

实施例1

磷酸肽1：Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂的合成。

序列中的氨基酸需要用保护氨基酸，分别为Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser-OH，Fmoc-Pro-OH，Boc-Pyr-OH。

多肽合成：称取1gRINKAMIDE-MBHA树脂，加入于20mL二氯甲烷(DCM)浸泡5h，滤除溶液，再加入二氯甲烷(DCM)10mL和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)10mL浸泡12h，滤除溶液；然后分两次分别加入10mL的20％哌啶/DMF溶液，在摇床上分别震荡5min，15min；用10mLDMF、10mLDCM、10mLDMF各洗三遍，用kaiser’s试剂检测，显示阳性，则加入668.6mg第一个氨基酸Fmoc-Met-OH，577.9mgTBTU，243.234mgHoBt，465.3mgDIEA，并加入20mLDMF溶液，置于摇床上震荡2h；用10mLDMF、10mLDCM、10mLDMF各洗三遍，用kaiser’s试剂检测，显示阴性，则分两次分别加入10mL的20％哌啶/DMF溶液，在摇床上分别震荡5min，15min；然后用10mLDMF、10mLDCM、10mLDMF各洗三遍，用kaiser’s试剂检测，显示阳性，接着加入第二个氨基酸Fmoc-Leu-OH，重复第一个氨基酸的耦合、检测、洗涤、脱除保护的步骤，直至接到第11个氨基酸Boc-Pyr-OH。得到连接树脂的带有保护基的多肽粗品。

磷酸化修饰：将上述连接树脂的带有保护基的多肽粗品，真空干燥后，在氮气保护作用下，加入1.554g二苯基N，N′-二异丙基亚磷酰胺，794.3mg四氮唑，9mLDMF，反应1h，用20mLDCM冲洗三遍，之后加入70％aqueous过氧化叔丁醇811mg，3mLDMF，搅拌反应30min。得到连接树脂的带有保护基的磷酸肽1粗品。

磷酸肽1连接树脂的切除：加入三氟乙酸∶苯酚∶水∶EDT∶苯硫醚(V∶V＝82.5∶5∶5∶2.5∶5)溶液，搅拌反应12h，磷酸肽1被从RINK AMIDE-MBHA树脂上切除，得到带有保护基的磷酸肽粗品。

磷酸肽1的沉淀：将上述带有保护基的磷酸肽1粗品溶液用氮气吹去溶剂后，滴入乙醚，然后离心，去除上清液，重复2次。得到磷酸肽1粗品。

实施例2

磷酸肽1：Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂的纯化制备：

称取5g的二氧化钛到带有筛板的玻璃管中，加入70％乙腈/3％TFA的溶液100mL，上下震荡混匀1分钟，将溶液在0.05～0.09mbar条件下减压滤除，等待上样；称取0.5g磷酸肽1粗品，将其溶解在70％乙腈/3％TFA的溶液200mL中，上下震荡混匀10分钟，将溶液在0.05～0.09mbar条件下减压滤除；加60％乙腈/0.1％TFA的溶液200mL，上下震荡混匀5分钟，将溶液在0.05～0.09mbar条件下减压滤除；加50％乙腈/0.1％TFA的溶液200mL，上下震荡混匀5分钟，将溶液在0.05～0.09mbar条件下减压滤除；加50％乙腈的溶液200mL，上下震荡混匀1分钟，将溶液减压滤除；最后加入0.1mol/L的氨水溶液洗三遍，体积分别为200mL、100mL、100mL，上下震荡混匀5分钟，将溶液在0.05～0.09mbar条件下减压滤除到干净的容器中。取样进行LC-ESI-MS分析。图2和图3分别为纯化后的磷酸肽1的HPLC色谱图和ESI-MS图。从图2中可以看出得到的磷酸肽1的纯度很高(98.2762％)。

实施例3

磷酸肽2：Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂的合成。

序列中的氨基酸需要用保护氨基酸，分别为Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Tyr-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser-OH，Fmoc-Pro-OH，Boc-Pyr-OH。

多肽合成、磷酸化修饰、磷酸肽2连接树脂的切除、磷酸肽2的沉淀实施方式同实施例1。

实施例4

磷酸肽2：Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂的纯化制备。

实施方式同实施例2。图4和图5分别为纯化后的磷酸肽2的HPLC色谱图和ESI-MS图。从图4中可以看出得到的磷酸肽2的纯度很高(98.5426)。

实施例5

磷酸肽1和磷酸肽2对大鼠尾动脉血压的影响测试

(1)实验动物：SD大鼠，清洁级，体重180-250g，购于斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2011-0004。

试剂：0.1％三氟乙酸(TFA)，二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，天津市化学试剂六厂，批号：20100503106。氯化钠注射液(生理盐水)，批号：111014119，石家庄四药有限公司。

(2)实验仪器：AD Instruments多功能生理测量仪及PowerLab数据采集分析系统，澳大利亚AD Instruments公司产品；大鼠加热罩：安徽淮北正华生物仪器公司产品；分析天平：CP225D，德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；电子天平：T-500，常熟双杰测试仪器厂；移液器：eppendorf，200μl，德国eppendorf公司；VITLAB移液器，500ml，德国VITLAB公司；注射器：0.25ml，1.0ml，国营上海注射器厂。麝香蛸素、磷酸肽1和磷酸肽2，配制成浓度为50mg/mL母液，然后用生理盐水稀释成10ug/mL、20ug/mL、50ug/mL等使用浓度，设等容量溶剂对照组，保证溶液对正常动物血压和行为没有影响。

(3)大鼠血压测量方法：大鼠血压测量采用尾部无创血压测量法测量，将大鼠置于37℃恒温加热罩中，在尾部套上加压套，将脉搏传感器固定在大鼠尾部加压套后部，调整脉搏传感器位置，使得显示界面血压波明显，待其大鼠平静后，测量给药前大鼠在清醒状态下的尾动脉血压(收缩压，下同)，尾静脉注射给药，给药后分别测量5、10、15、20、25、30、40、50min等不同时间的大鼠的血压，5min内测得的大鼠血压以5min计，每个测量点重复测量1次，计算平均值，直至大鼠血压值基本恢复到正常值水平为止。

每个受试物一般选择2-3个剂量组，每个剂量组4只大鼠，雌雄各半，根据受试物预先试验得到的降压强度选择合适剂量范围，一般选择剂量在有无降压作用之间，个别受试物降压作用不明显的，可以适当提高剂量选择范围。

由于无创血压测量系统在大鼠血压(收缩压)40mmHg以下时，无法测量到实际血压值，所以低于40mmHg的大鼠血压按未测出血压对待，未在血压值统计之列。

(4)实验结果统计方法：实验组与对照组之间的差异显著性检验用两个独立样本t检验方法检验；剂量组间的方差齐性检验用L evene’s检验，其它统计按常规方法进行。

(5)实验环境：本实验在恒温恒湿实验室的环境条件下进行，实验温度：22.0±0.5℃，相对湿度：35±5％。

(6)对大鼠血压影响的测量结果：

将正常状态下的大鼠置于37℃恒温装置中，一段时间安静后，测定其正常血压2次，然后以尾静脉注射方法，给予适量的受试物溶液，给药后5min内连续测量血压2次，以后每5-10min测量血压2次，直至大鼠血压基本恢复到正常值为止。

麝香蛸素：对大鼠血压测量结果见表1.。

表1.麝香蛸素不同时间对大鼠血压的测量结果

10μg/kg：大鼠血压较给药前平均下降18.7％，降压最大峰值在给药5min内，雄性大鼠的血压从正常值110mmHg下降到约70mmHg上下，其最大降压幅度为44.4％，其中2只雌性大鼠的降压效果不明显，约下降10mmHg，而血压下降较多的两只雄性大鼠，在给药10min后血压逐渐恢复到正常值水平。

50μg/kg：大鼠血压较给药前平均下降25.4％，最大降压时间在5min内，最大降压幅度为44.0％，其中1只雌性大鼠的血压未有明显下降，在此剂量下的降压作用可持续25min，25min后大鼠血压逐渐恢复到正常值水平。

给药前后不同测量时间的大鼠血压变化关系如图6所示。从图6可以看出：麝香蛸素对大鼠的最大降压作用在给药后5min内，随着给药剂量的增加，降压效果增强。大鼠降压作用维持时间在10min内，一般在给药10min后大鼠血压逐渐恢复到正常值水平，其降压持续时间较短。

磷酸肽1：对大鼠血压影响研究的给药剂量选择为10、20、50μg/kg等3个剂量组，测量结果见表2.。

表2.磷酸肽1不同时间对大鼠血压的测量结果

10μg/kg：大鼠血压平均下降12.3％，最大降压时间在5-10min，最大降压幅度为19.0％，在15min后血压基本恢复到正常水平。

20μg/kg：大鼠血压平均下降29.3％，最大降压峰值时间在5-10min，最大降压幅度为55.6％，其中1只雌性大鼠的血压未有明显下降，持续降压作用时间为20min，20min后大鼠血压基本恢复到正常值水平。

50μg/kg：大鼠血压平均下降30.1％，最大降压时间在10min内，最大降压幅度为55.6％，其中1只雌性大鼠的血压未有明显下降，持续降压作用时间在25min内，25min后大鼠血压基本恢复到正常值水平。

给药后不同测量时间的大鼠血压变化关系如图7。从图7可以看出：磷酸肽1对大鼠的最大降压作用在给药后5-10min之间，随着给药剂量的增加，降压效果增强。大鼠降压作用维持时间在20min内，一般在给药20min后大鼠血压逐渐恢复到正常值水平。从测试结果可知磷酸肽1的降压活性比麝香蛸素有所提高，其降压持续时间延长了1倍左右。

磷酸肽2对大鼠血压测量结果见3.。

磷酸肽2对大鼠血压影响研究的剂量选择为10、20、50μg/kg等3个剂量组，测量结果见3。

表3.磷酸肽1不同时间对大鼠血压的测量结果

10μg/kg：大鼠血压无下降，与给药前自身的止常血压比较，无显者性差异。

20μg/kg：大鼠血压平均下降18.1％，有1只雄性大鼠在给药5min内的最大降压幅度为48.1％，降压作用持续15min以上。

50μg/kg：大鼠血压平均下降35.8％，其中有1只大鼠在给药5min内未能测出血压(低于40mmHg)，在测出的血压中，最大降压幅度为52.8％，降压作用持续30min以上。

给药后不同测量时间的血压变化关系如图8示。从图8可以看出：磷酸肽2在10μg/kg对大鼠血压几乎无明显降压作用，但随着给药剂量增加到20、50μg/kg，对大鼠降压效果明显，降压作用时间延长25in以后，剂量与效应呈良好的线性关系。从测试结果可知磷酸肽2在50μg/kg的剂量时，降压活性比麝香蛸素和磷酸肽2都高，其降压持续时间延长了3倍左右。