快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法

摘要

本发明涉及快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，其主要步骤包括：(1)、血样经植物凝血素处理后置于37℃恒温培养箱内静置45-90分钟；(2)、将植物血凝素处理后的血样中淋巴细胞置于含有秋水仙素、ATP、5％胎牛血清、CalyculinA以及CDK1/CyclinB的混合培养液中37℃培养3-12小时；(3)、细胞混合培养后，使用0.075mol KCl低渗10-20分钟；(4)、向含有低渗处理细胞的低渗液中加入固定液预固定1次，再加入固定液固定2次，每次固定10-15分钟，最后将细胞悬于固定液中。本发明与常规早熟凝集染色体制备方法相比，大大缩短了时间，仅需要3-12小时。

说明书

技术领域

本发明属于细胞遗传学领域，具体涉及人外周血淋巴细胞早熟凝集 染色体的制备方法。

背景技术

早熟凝集染色体(Premature Condensed Chromosome，PCC)最经典 的概念是指将处于分裂期(M期)的细胞与处于细胞周期其他阶段的细胞 融合，其他期细胞的染色质提早包装成染色体。由于G1、S、G2的DNA 复制状态不同，早熟凝集的染色体的形态各异，如与M期细胞融合的G1 期的染色体为单线状，S期为粉末状，G2期染色体为双线。

早熟凝集染色体PCC作为辐射剂量估算的方法，受到了广泛的关注 和认可。早熟凝集染色体比常规染色体法具有很强的优势：①可诱导静 止期细胞的分裂，可大大增加分析细胞的数量，避免了常规染色体畸变 分析中只对分裂期细胞进行选择性分析的不足；②得出的染色体损伤为 原始损伤，有利于观察到局部照射或“旁效应”辐射能量在细胞内的直 接或间接沉积，增加了适用的剂量评估范围，提高了方法的敏感性和结 果的准确性；③PCC操作简便、省时，而常规染色体分析需要丰富的经 验和熟练的技巧，且给出剂量的时间需4-5d，对大批伤员不能及时提供 剂量估算。因此使用PCC用于估算受照人员的辐射剂量，在大剂量的辐 射事故中，可以提供足够的可供分析的染色体。④PCC还有其它优势，比 如与受照剂量有严格的定量关系，以及用离体实验建立的剂量效应刻度 曲线与整体实验所得到的剂量效应曲线无显著性差异(Gotoh E，Tanno Y， Takakura K.Simple biodosimetry method for use in cases of high-dose radiation exposure that scores the chromosome number of Giemsa-stained drug-induced prematurely condensed chromosomes (PCC).Int J Radiat Biol.2005，81(1)：33-40.)。

但是早期的细胞融合方法制备PCC细胞费时、技术要求高、PCC产额 低、不稳定等限制了它作为生物剂量计的应用。最近，一些具有促进细 胞分裂作用物质的发现和应用，取代了过去传统PCC中的细胞融合技术， 使制备PCC对技术的要求大为降低，缩短了分析时间，如冈田酸(okadaic acid)和花萼海绵诱癌素A(calyculin A)。冈田酸可使外周血淋巴细胞 在G1、G2和M期发生PCC，但是，诱导PCC过程中的淋巴细胞培养阶段都需 要至少48小时。calyculin A可诱导任一时相的细胞发生PCC，大大提高 了可用于分析细胞的数目(Prasanna PG，Escalada ND，Blakely WF. Induction of premature chromosome condensation by a phosphatase inhibitor and a protein kinase in unstimulated human peripheral blood lymphocytes：a simple and rapid technique to study chromosome aberrations using specific whole-chromosome DNA hybrid.Mutat Res， 2000，466(2)：131-41.)，但诱导PCC过程中的淋巴细胞培养阶段时间 仍需大约48小时。

发明内容

本发明的目的在于建立快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体 的方法，以解决现有技术制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体耗时长 的问题。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：

快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，包括如下步骤：

(1)、植物凝血素处理(PHA)：采集3-5ml血样，向血样中加入植物 凝血素至终浓度80-120μg/ml，混匀后置于37℃恒温培养箱内静置45-90 分钟；

(2)、混合培养：将植物血凝素处理后的血样离心，取中层分界处 的淋巴细胞，置于含有250μg/ml秋水仙素、10mmol/L ATP、5％胎牛血清、 500nmol/L CalyculinA以及0.2mg/ml CDK1/CyclinB的混合培养液中， 混匀后置于37℃恒温培养箱内静置培养3-12小时；

(3)、细胞低渗处理：细胞混合培养后，离心弃上清，使用0.075mol KC13-5ml低渗10-20分钟；

(4)、细胞固定：向含有低渗处理细胞的低渗液中加入0.5-1ml固 定液预固定，混匀后立即离心弃上清，再加入4-6ml固定液固定2次， 每次固定10-15分钟后离心弃上清，最后将细胞悬于0.5-1ml固定液中； 其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3∶1配制。

其中，步骤(2)所述离心采用300-400rpm离心3-5分钟；步骤(3) 所述离心采用800-1000rpm离心8-10分钟；步骤(4)所述离心采用 800-1000rpm离心8-10分钟。

本发明建立的快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法， 其优点在于制备PCC耗时短，其中人外周血淋巴细胞植物血凝素(PHA) 处理后混合培养过程仅需3-12小时，比现有技术制备PCC过程中的淋巴 细胞培养时间(大约48小时)明显缩短，从而为PCC的制备提供了快速 途径。

附图说明

图1为淋巴细胞经混合培养3小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。

图2为淋巴细胞经混合培养6小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。

图3为淋巴细胞经混合培养12小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。

具体实施方式

以下通过实施例详细描述本发明提供的快速制备人外周血淋巴细胞 早熟凝集染色体的方法。下面实施例中所涉及的生物技术没有特别描述 之处均采用细胞遗传学常规技术，如《分子克隆实验指南》中提供的常 规技术方法。

实施例1：

(1)、采集正常志愿者血样3ml，向血样中加入PHA(广州市医药工 业研究所)至终浓度80μg/ml，混匀后置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱内 静置1小时；

(2)、血样在上述37℃恒温培养箱内静置1小时后，经300rpm离心 3分钟，取0.5ml中层分界处血淋巴细胞，置于含有3ml 250μg/ml秋水 仙素(sigma公司)、10mmol/L ATP(sigma公司)、5％胎牛血清、500nmol CalyculinA(sigma公司)以及0.2mg/ml的CDK1/CyclinB(细胞周期素 依赖性激酶1/细胞周期素B，Invitrogen公司)混合培养液中，混匀后 置于37℃恒温培养箱内静置3小时；

(3)、淋巴细胞经混合培养3小时后1000rpm离心10分钟，加入5ml 的0.075mol KCl低渗液在含5％CO₂的37℃条件下低渗20分钟；

(4)、向含有低渗处理淋巴细胞的低渗液中加入0.5ml固定液预固 定，混匀后立即1000rpm离心10分钟弃上清，再加入5ml固定液固定2 次，每次固定15分钟后1000rpm离心10分钟弃上清，最后将细胞悬于 1ml固定液中；其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3∶1配制。

在95℃温度下于热蒸汽上烘干制片，经空气干燥后用5％姬姆萨染色， 显微镜观察PCC指数和形态，图1为淋巴细胞经混合培养3小时后早熟 凝集染色体M期分裂相图。

实施例2：

(1)、采集正常志愿者血样3ml，向血样中加入PHA(广州市医药工 业研究所)至终浓度100μg/ml，混匀后置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱 内静置1小时；

(2)血样在上述37℃恒温培养箱内静置1小时后，经400rpm离心 3分钟后，取0.8ml中层分界处淋巴细胞，置于含有3ml 250μg/ml秋水 仙素、10mmol/L ATP、5％胎牛血清、500nmol CalyculinA以及0.2mg/ml CDK1/CyclinB混合培养液中，混匀后置于37℃恒温培养箱内静置6小时；

(3)淋巴细胞经混合培养6小时后1000rpm离心10分钟，加入5ml 的0.075mol KCl低渗液在含5％CO₂的37℃条件下低渗20分钟；

(4)、向含有低渗处理淋巴细胞的低渗液中加入0.8ml固定液预固 定，混匀后立即1000rpm离心10分钟弃上清，再加入5ml固定液固定2 次，每次固定10分钟后1000rpm离心10分钟弃上清，最后将细胞悬于 0.5ml固定液中；其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3∶1配制。

在95℃温度下于热蒸汽上烘干制片，经空气干燥后用5％姬姆萨染色， 显微镜观察PCC指数和形态，图2为淋巴细胞经混合培养6小时后早熟 凝集染色体M期分裂相图。

实施例3：

(1)采集正常志愿者血样5ml，向血样中加入PHA(广州市医药工 业研究所)至终浓度100μg/ml，混匀后置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱 内静置90分钟；

(2)血样在上述37℃恒温培养箱内静置90分钟后，300rpm离心3 分钟，取0.5ml中层分界处淋巴细胞，置于含有3ml 250μg/ml秋水仙素、 10mmol/L ATP、5％胎牛血清、500nmol CalyculinA以及0.2mg/ml CDK1/CyclinB混合培养液中，混匀后置于37℃恒温培养箱内静置12小 时；

(3)淋巴细胞经混合培养12小时后800rpm离心10分钟，加入4ml 的0.075mol KCl低渗液在含5％CO₂的37℃条件下低渗20分钟；

(4)、向含有低渗处理淋巴细胞的低渗液中加入1ml固定液预固定， 混匀后立即800rpm离心10分钟弃上清，再加入5ml固定液固定2次，每次 固定10分钟后800rpm离心10分钟弃上清，最后将细胞悬于0.5ml固定液 中；其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3∶1配制。

在95℃温度下于热蒸汽上烘干制片，经空气干燥后用5％姬姆萨染色， 显微镜观察PCC指数和形态，图3为淋巴细胞经混合培养12小时后早熟凝 集染色体M期分裂相图。