CA诱导早熟凝集染色体作为生物剂量计的研究

摘要

目的：
　　 1、探索用calyculinA诱导外周血淋巴细胞发生早熟染色体凝集的最优化方案。
　　 2、探讨CalyculinA诱导早熟染色体凝集技术作为低剂量电离辐射生物剂量计的可行性。
　　 3、为了解决低传能线密度辐射诱发的染色体畸变存在剂量率效应的问题，分别观察不同剂量率条件下的剂量效应关系，并建立相应的剂量效应曲线和数学模型，以便较为准确地估算不同剂量率受照人员的生物剂量。
　　 4、通过运用CalyculinA诱导PCC技术，探索QPCC法估算6MV X射线局部受照份额与剂量的可行性。
　　 方法：
　　 1、抽取健康成年献血员外周血6ml，分别接种于12瓶预先配置好的RPMI-1640培养基（20％的小牛血清、1％的PHA，1％的HEPES）中，然后随机分成3组并编号。培养48h后收获制片，培养至24h时加入秋水仙素，继续培养至46h时加入CalyculinA。采用析因实验设计对影响早熟凝集染色体形态和数量的两个主要因素秋水仙素和CalyculinA分别进行两个水平上的探讨，并应用相关统计学方法对分裂指数(MI)进行分析，以此判断最优方案。
　　 2、抽取健康成年人的抗凝外周静脉血，用X射线分别照射0、0.1Gy、0.25 Gy、0.5 Gy、0.75 Gy和1 Gy。剂量率为400 MU/min。照射后将血样接种于RPMI1640培养基中于37℃、5％CO2恒温培养箱内培养48 h，当培养24 h时加入秋水仙素，终止培养前2h加入CalyculinA诱导早熟凝集染色体，收获制片并用Giemsa染液染色，观察G1、G2/M-PCC细胞中总畸变率、断片率、双着丝粒体加着丝粒环率与辐射剂量的效应关系。采用盲法阅片，每个剂量点分析1000个G1、G2/M-PCC细胞，计数各剂量组染色体畸变数，应用SPSS16.0统计软件包进行统计分析。采用WHO提供的3种数学模式对实验数据做曲线拟合，通过检验回归系数的显著性和曲线的拟合度确定拟合曲线。
　　 3、抽取健康成年人的抗凝外周静脉血6 ml，肝素抗凝后分装于12个0.5 ml的EP管中密封，分成2组，每组6个，将EP管放入固体水的插孔中，剂量率分别采用100 Mu/min和200 Mu/min。用X射线分别照射0、0.1 Gy、0.25 Gy、0.5 Gy、0.75 Gy和l Gy。然后接种于RPMI1640培养基中，放置于37℃恒温箱内培养48h，当培养24h时加入秋水仙素，终止培养前2h加入CalyculinA诱导早熟凝集染色体，收获制片并用Giemsa染液染色，采用盲法阅片，计数各标本的染色体双着丝粒+环畸变率。应用SPSS16.0统计软件包分析染色体畸变率与照射剂量之间的关系，分别拟合不同剂量率的剂量效应曲线和数学模型。
　　 4、抽取健康成年人的抗凝外周静脉血，用X射线分别照射0、5 Gy、10 Gy、15 Gy、20 Gy和25 Gy。培养52h并用CalyculinA诱导PCC。记录各剂量点PCC指数、PCC环以及断片数，判断观察到的PCC环是否符合泊松分布，分别建立相应的PCC环率和断片率的剂量效应关系曲线。同时用8 Gy6MV X射线照射离体健康人外周血，受照份额为20％、50％、80％模拟局部照射。
　　 结果：
　　 1、不同水平的秋水仙素和CalyculinA培养的标本:淋巴细胞活化佳，CalyculinA终浓度高的的实验组获得的分裂指数明显高于CalyculinA终浓度低的实验组，CalyculinA终浓度的不同水平影响的差异具有统计学意义(P＜0.01)，秋水仙素终浓度的不同水平影响的差异同样具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2、用CalyculinA可成功诱导人外周血淋巴细胞产生PCC，且总畸变率、断片率、双着丝粒体加着丝粒环率随照射剂量的增加而增加，呈现出明显的剂量效应关系。根据不同剂量X射线照射后诱发的PCC畸变率统计结果，用SPSS16.0统计软件拟合其剂量效应的回归方程，计算方程拟合度(R2)，检验回归系数的显著性。结果表明，在0～1.0Gy剂量范围内，断片率、双着丝粒体+着丝粒环率、总畸变率拟合的最佳数学模式，均为二次多项式:y=a+bD+cD2
　　 3、在剂量率一定的情况下，各剂量点的(dic+r)率随吸收剂量增加而增加。同一剂量点不同剂量率射线诱发的(dic+r)畸变率随剂量率的增加而增加，剂量率效应明显。
　　 4、统计结果发现PCC指数随着剂量水平的增高而降低，各剂量点样品中PCC环分布符合泊松分布。PCC环率与断片率都随着受照剂量增加而增加。每个受损细胞所含多余PCC断片数与照射剂量之间符合线性模式，其数值可被用于模拟局部照射的剂量估算。
　　 结论：
　　 1、淋巴细胞培养24h之后加秋水仙素使其终浓度达0.04μg/ml，继续培养至48h收获，与收获前2h加calyculinA使其终末浓度达60 nM，可以获得较高比例的分裂指数，容易计数，可对原始损伤作出较准确的估计。
　　 2、早熟染色体凝集技术可以用于估算低剂量受照者辐射剂量。
　　 3、在估算低传能线密度辐射的吸收剂量时，必须考虑剂量率效应，应根据辐照情况尽量选择剂量率相近的剂量-效应关系曲线进行估算，从而使结果更为准确。
　　 4、采用Q眦的方法可以较准确地估算活体局部受照剂量与份额，可用于局部大剂量电离损伤程度测定。

目录

声明

摘要

主要符号表

前言

材料与方法

1 实验材料(血样)

2 主要试剂

2．1 外周血淋巴细胞培养所用试剂

2．2 外周血淋巴细胞收获和制片所用试剂

3 试剂的配制

4 主要仪器设备

5 其他配置

6 实验原理

7 实验步骤

7．1 外周血淋巴细胞的照射方案

7．2 细胞培养、收获和制片

8 镜检

9 统计分析方法

结果

1 各试验号淋巴细胞收获情况

2 不同水平的秋水仙素和CalyculinA培养的标本统计结果

3 低剂量X射线诱发外周血淋巴细胞染色体畸变与剂量效应关系

4．不同剂量率的X射线诱发染色体畸变率的剂量-效应关系

5．局部照射剂量估算的模拟

讨论

结语

参考文献

附图

综述 早熟染色体凝集(PCC)在辐射生物剂量估算中的研究进展

攻读学位期间发表的论文

致谢