中国家猪品种种质资源分子鉴定位点及其位点扩增引物

摘要

本发明提供一种中国家猪品种种质资源分子鉴定位点及其位点扩增引物，属于生物技术领域。本发明的12个鉴定位点的坐标为：chr4_90338649、chr6_46031147、chr3_40173091、chr1_304503930、chr8_55949794、chr4_51135766、chr14_51320355、chr14_71621254、chr6_261199、chr1_82559795、chr15_101338073、chr4_81507260，12个鉴定位点中国家猪的优势等位基因分别是G、T、A、T、A、C、A、C、C、A、T、G。用于中国家猪品种种质资源分子鉴定位点扩增的引物如表1所示。本发明的有益效果在于：筛选中国家猪遗传组分中特有的单核苷酸标记位点，通过现代分子生物学技术检测分子标记位点的基因型，用于有效地鉴定并区分中国家猪品种与中国野猪血缘。为中国家猪的育种及种质资源保护过程中种质的鉴定提供准确指导。

说明书

技术领域：

本发明提供一种中国家猪品种种质资源分子鉴定位点及其位点扩增引物，属 于生物技术领域。

背景技术：

本发明基于全基因组重测序数据，与传统的单一基因，如MC1R基因以及 AFLP等鉴别技术相比，本发明所给出的分子标记位点更加全面地代表了中国家 猪品种中受到选择的经济性状连锁区域。解决了现如今中国多个家猪品种种质资 源混乱，难以排除野猪血缘的尴尬局面。12个分子标记位点位于7条不同的染 色体上，较单一基因的检测效力更可信。与传统鉴定技术微卫星相比较，微卫星 标记技术虽然得到了较广泛的应用，但其随机分布在遗传图谱上，不能直接与中 国家猪品种所特有分子遗传组分相关联。

发明内容：

本发明的目的是提供一种中国家猪品种种质资源分子鉴定位点及其位点扩 增引物，为中国家猪的育种及种质资源保护过程中种质的鉴定提供准确指导。

本发明筛选中国家猪遗传组分中特有的单核苷酸标记位点，通过现代分子生 物学技术检测这12个分子标记位点的基因型，用于有效地鉴定并区分中国家猪 品种与中国野猪血缘。

本发明的技术方案主要包括：猪DNA的提取，Illumina二代测序技术进行全 基因组重测序，在全基因组分析的基础上筛选分子标记并进行扩大群体验证。使 用本方法对所要鉴定的个体进行基因分型，在本发明的12个单核苷酸标记位点 上，不同的基因型被认为是家猪、野猪两个群体分别特有的，依此来判断该个体 属于哪一群体。12个分子标记位点的坐标如下（基因组版本：NCBI Build Sscrofa 10.2）。chr4_90338649、chr6_46031147、chr3_40173091、chr1_304503930、 chr8_55949794、chr4_51135766、chr14_51320355、chr14_71621254、 chr6_261199、chr1_82559795、chr15_101338073、chr4_81507260，12个位点 中国家猪的优势等位基因分别是G、T、A、T、A、C、A、C、C、A、T、G。

用于中国家猪品种种质资源分子鉴定位点扩增的引物如表1所示。

表1 引物序列表

本发明实现的方法如下：

1、全基因组测序

本发明首先对来自中国7个省的10个野猪个体，5个中国家猪品种（51个 个体）进行了全基因组重测序。利用群体遗传学统计方法分析全基因组数据，最 终在全基因组水平上筛选到12个单核苷酸分子标记位点。

2、扩大群体验证

选择了来自中国9个省的36个野猪个体，12个中国家猪品种（34个个体）对12 个分子标记进行基因分型。在猪的样品中扩增含有12个分子标记位点的核苷酸多 态位点的片段,并对扩增到的DNA片段中的12个核苷酸多态位点进行测序。基因 分型结果，12个分子标记在中国家猪与中国野猪群体间基因型频率分化极显著 （卡方检验），见表2。充分证明利用这12个单核苷酸分子标记位点能高效、准 确的区分中国家猪与中国野猪的种质资源。

3、分型技术  SNaPshot

本发明顺应现代生物技术的发展，利用群体遗传学统计量对全基因组重测序 数据进行了分析。在全基因组的水平上，提出一种新的种质资源鉴定与保护的新 方法。

本发明的有益效果在于：筛选中国家猪遗传组分中特有的单核苷酸标记位 点，通过现代分子生物学技术检测分子标记位点的基因型，用于有效地鉴定并区 分中国家猪品种与中国野猪血缘。为中国家猪的育种及种质资源保护过程中种质 的鉴定提供准确指导。

具体实施方案：

A、根据Ensembl数据库猪基因组序列，使用Primer premier 5 软件，设计引物对。 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列及扩增产物片段大小见表1。

B、样本采集

采集了来自中国9个省的36个野猪个体，12个中国家猪品种（34个个体） 的肌肉组织或者血液。

C、样品基因组提取

1)取150μl或200μl全血(或约30mg的组织，用剪刀剪成糊状)。

2)加入450μl或550μlSTE缓冲液(30mM Tris-HCL,200mM EDTA,50mM  NaCl,pH8.0)和终浓度分别为10％的SDS75μl和200mg/ml的蛋白酶K50μl。

3)充分混匀后置57℃温箱中消化8－12小时至澄清,其间摇匀数次。

4)加入等体积的水饱和酚600ul，缓慢混匀一个晚上，或手动匀速摇30min,9000 转/分离心10分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中。

5)加入等体积的苯酚(300ul):氯仿:异戊醇(300ul)(25:24:1)混合液缓慢混匀抽提 30分钟，9000转/分离心10分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中。

6)再加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提15分钟，9000转/分离心10分钟，上 清液转至另一干净的Eppendorf管中,重复两次。

7)加入等体积600ul的异丙醇（异丙醇使用前放置于-20度预冷）沉淀DNA， -20℃过夜放置,12000转/分离心10分钟后，弃上清。

8)加入1000μl70%乙醇洗涤,13000转/分离心10分钟后,弃上清.重复一次。

去除70%乙醇，于室温将DNA置于敞开的离心管中，或于60度直至见痕量 乙醇挥发殆尽。

9）加入PH=8.0的TE缓冲液50ul，置37度充分溶解，待DNA完全溶解后置 于＋4℃冰箱待用或保存于－20℃。

D、SnaPshot反应体系及反应优化：

①扩增

反应体系

超纯水 460ul Mgcl₂234ul 10×PCR buffer 116ul Fast taq(5U/ul) 24ul dNTP(10mM each) 8ul 扩增引物 8ul

注：扩增引物池分别加入引物表格内PCRL与PCRU引物的量依此为0.8，1.5，1.2，1.5， 1.1，1.6，1.4，1.5，1.6，1.4,1.4,1.4ul。96孔板每个孔加入8.5ul mix以及1.5ul模板DNA。

扩增反应：

②扩增产物纯化

反应体系

ExoⅠ(50U/ul) 60ul SAP(1U/ul) 130ul 10×SAP buffer 35ul 超纯水 125ul

纯化反应：

37℃ 40min 96℃ 10min

注：纯化的mix加入扩增后体系中,每孔加入3.5ul。

③单碱基延伸

反应体系

SnaPshot multiplex yeady reaction mix 100ul 延伸引物 8ul 5×sequencing buffer 200ul 超纯水 300ul

延伸反应：

注：延伸引物池中加入引物表内SNPU引物的量为1ul，单碱基延伸加入以上mix每孔 6ul，再加入4ul PCR产物。

④延伸后纯化

反应体系

SAP（1U/ul） 120ul 10×SAP buffer 70ul 超纯水 140ul

纯化反应：

37℃ 40min 75℃ 20min

注：mix加入延伸后反应体系中，每孔3.3ul。

E、将处理后的样品分别上样到ABI PRISM3730或者其他型号全自动测序仪 （Applied Biosystems）进行扫描检测。

F、使用Genemarker V2.20（SoftGenetics LLC,State.College,PA）或者是 Genemapper（Applied Biosystems）软件判读基因型。

G、运用R语言对12个分子标记位点扩增的92个个体的基因型进行了显著性检 验见表2。

表2-a12个分子标记位点卡方检验结果

表2-b12个分子标记位点卡方检验结果

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国科学院昆明动物研究所

 

<120>  中国家猪品种种质资源分子鉴定位点及其位点扩增引物

 

<130>  1                                                                               

 

<160>  36    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

 

<400>  1

tgggctcctg tttaactatc                                                                              20      

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  2

agtggcctcg catccctt                                                                                18      

 

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  3

agtgaggagg gagaatggcg cccac                                                                        25      

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  4

agtgggatga acatggatcc                                                                              20      

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  5

cgagatggaa aaccttcacc                                                                              20      

 

 

<210>  6

<211>  30

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  6

tgactccatg tccatagtca tgttttccag                                                                   30      

 

 

<210> 7

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  7

gctgcaccac cagggaac                                                                                18      

 

 

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  8

aaaaagctac aagaagcaag gc                                                                           22

 

 

<210>  9

<211>  35

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  9

ctgactgact ccattttgtt attcttaaag ctatc                                                             35

 

 

<210>  10

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  10

aggtgtacat cctcggcc                                                                                18

 

 

<210>  11

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  11

atatttgttg agaagaccag tcaga                                                                        25

 

 

<210>  12

<211>  40

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  12

actgactgac tgacttacaa cgaggagctg gtgaggtagg                                                        40

 

 

<210>  13

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  13

tgtgcaaaga aaactatgca aa                                                                           22

 

 

<210>  14

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  14

tgcagacttt gatccacgt                                                                               19

 

 

<210>  15

<211>  45

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  15

gactgactga ctgactgact catgaccctg ccacctgaag catcc                                                  45

 

 

<210>  16

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  16

atttcccgtt aactaccaga atc                                                                          23

 

 

<210>  17

<211>  27

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  17

ataaaatctt atcttacaaa gaagggg                                                                      27

 

 

<210>  18

<211>  50

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  18

tgactgactg actgactgac tgactttaaa tgtttgtttt ttaaggaaaa                                             50

 

 

<210>  19

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  19

accaatttag acgactacat cata                                                                         24

 

 

<210>  20

<211>  26

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  20

aataaattct gttccagtaa ggtgtt                                                                       26

 

 

<210>  21

<211>  55

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  21

ctgactgact gactgactga ctgactgact agaccatcgt ttagccttat gaaca                                       55

 

 

 

<210>  22

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  22

tgttcaaagc cacagaaaca                                                                              20

 

 

<210>  23

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  23

aagcatttgg aaacccttta taa                                                                          23

 

 

<210>  24

<211>  60

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  24

actgactgac tgactgactg actgactgac tgactatggg ataaggatgg tgatcagagt                                  60

 

 

<210>  25

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  25

aaattgtttc ctgcttctca gt                                                                           22

 

 

<210>  26

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  26

ttggcattgt taaaaaggat aaa                                                                          23

 

 

<210>  27

<211>  65

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  27

gactgactga ctgactgact gactgactga ctgactgact ggcccttgag tttgctcatg acttt                            65

 

 

<210>  28

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  28

ttatttgtat acttggtgcc tagc                                                                         24

 

 

<210>  29

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  29

taacttcatg ggtgttctat tttct                                                                        25

 

 

<210>  30

<211>  70

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  30

tgactgactg actgactgac tgactgactg actgactgac tgactcttgg caattgggaa atggtgagtg                       70

 

 

<210>  31

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  31

tgtgacaatg ttttcacttt atg                                                                          23

 

 

<210>  32

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  32

agcatcaaaa tgcctgaaat                                                                              20

 

 

<210>  33

<211>  74

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  33

tgactgactg actgactgac tgactgactg actgactgac tgactgactt tctctcacaa gtcctttcat ataa                  74

 

 

<210>  34

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  34

atcctctggt ggaaagaaga t                                                                            21

 

 

<210>  35

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  35

ttggctttgg agtcagactt                                                                              20

 

 

<210>  36

<211>  78

<212>  DNA

<213>  Sus domesticus

 

<400>  36

tgactgactg actgactgac tgactgactg actgactgac tgactgactg acttgcatct gacatttatt gaaactca              78