一种基于J亚群禽白血病病毒env基因保守序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种基于J亚群禽白血病病毒env基因保守序列的siRNA重组干扰载体，该载体利用env基因对于ALV的重要意义，利用该基因设计合成siRNA，构建形成siRNA的发卡结构，进一步获得退火双链DNA后，将其与载体连接构建重组干扰载体，将该干扰载体与病毒共转染细胞，最终发现本发明提供的这种干扰载体可有效地干扰体外细胞及活鸡体内J亚群禽白血病病毒的转录与复制，为J亚群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种基于J亚群禽白血病病毒env基因保守序列 的siRNA重组干扰载体及其制备方法和其在干扰J亚群禽白血病病毒在体外细胞及活鸡体内 转录与复制的应用。

背景技术

J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一种肿瘤性疾病。ALV-J是具 有囊膜的反转录病毒，禽临床感染主要表现为髓细胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生长迟缓。 1997～1998年间,ALV－J呈全球性爆发，对世界肉种鸡业造成了毁灭性打击。ALV-J感染除 引起髓细胞瘤外，成红细胞瘤、血管瘤、肾瘤和肉瘤常在感染后期伴随发生，通常死亡率为 1%～5%，高峰期可达50%。研究证实，ALV-J对免疫应答具有持久损害作用,使生产力低下, 继发感染和混合感染频发，J亚群禽白血病严重危害养殖业的健康发展。国外通过净化控制 本病的发生，由于净化周期长、成本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过淘汰感染鸡 只进行大群净化，这种方法由于不及时不彻底而无法控制ALV-J的感染，同时，不科学、不 合理的净化措施，还会加速病毒的突变和进化，使疾病愈加复杂；ALV－J为囊膜病毒，病 毒囊膜决定了病毒的抗原性，而抗原性又不断变动，这成为禽白血病常规疫苗研制无法逾越 的瓶颈；

ALV为双RNA病毒，其基因组全长约7.6-7.8kb。ALV-J的前病毒基因组主要含有3个结 构基因，分别编码病毒结构蛋白、RNA依赖的DNA聚合酶(反转录酶)和囊膜糖蛋白。从5’端 至3’端其排列顺序依次为LTR-leader-gag-pol-env-leader-LTR。env基因含有表面 膜蛋白合成的遗传信息，编码病毒囊膜糖基化蛋白，包括膜表面糖蛋白亚单位gp85和跨膜蛋 白亚单位gp37。gp85蛋白是病毒的主要抗原，病毒中和反应的作用位点，含有病毒-受体决 定簇，主要起病毒粘附于易感动物细胞的作用，同时也能诱导有免疫力的鸡群产生要特异性 抗体，称为表面膜蛋白SU；gp37包含有与细胞膜融合的两个重要的疏水区，介导病毒与细胞 的融合过程，称为跨膜蛋白TM；

同时ALV－J为囊膜病毒，病毒囊膜决定了病毒的抗原性，而抗原性又不断变动，这成 为禽白血病常规疫苗研制无法逾越的瓶颈。基于此，研制抗J亚群禽白血病生物制剂成为目 前J亚群禽白血病防控的焦点和热点，如何将该基因用于J亚群禽白血病防控成为亟待解决 的问题。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，特别是env基因对于ALV的重要意义，利用 该基因设计合成siRNA干扰载体，并将该干扰载体与病毒共转染细胞，最终发现本发明提供 的这种干扰载体可有效地干扰体外细胞及活鸡体内J亚群禽白血病病毒转录与复制，为J亚 群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。

发明人首先基于env基因保守序列设计合成了siRNA，碱基序列为 GTACAGCGATGGAATTATT，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示;

该段序列与靶基因的一段序列相同，是利用siRNA在线设计软件筛选得到；

设计可以形成siRNA的发卡结构，并反转录得到ds oligo DNA，连接进干扰载体，载体 转染进细胞后，可以转录出其中的编码链，并在细胞内形成发卡结构（链内斜体部分碱基互 补，可以形成发卡结构），在细胞内酶切得到siRNA，siRNA解旋，其反义链与靶基因互补， 从而与靶基因结合，使靶基因降解。其作用过程如图1所示；

进而发明人利用上述方法将ds oligo DNA连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体中， 最终获得本发明所述的这种干扰载体，

其中所述的干扰载体购自invitrogen公司；

同时发明人还公开了上述干扰载体的具体制备方法，如下：

基于env基因保守区域设计合成siRNA；

其具体操作为：对ALV不同亚群及J亚群不同的毒株进行同源性分析，其同源性最高的 env基因中较保守区域片段作为筛选siRNA的序列片段，利用siRNA在线设计软件，得到 siRNA，碱基序列为GTACAGCGATGGAATTATT，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

其中发明人所选取的毒株包括：NX0101(ALV-J,DQ115805)、MQNCSU(ALV-A,DQ365814)、 SDAU09E3(ALV-B JF826241)、RSV-Prague(ALV-C,J02342)、RSV-Schmidt-Ruppin  D(ALV-D,D10652)、SD0501(ALV-E,EM467236）、HPRS103(ALV-J,Z46390)and  ADOL-7501(ALV-J,AY027920)。

设计合成含上述目的片段的发卡结构，如图3中top strand DNA，其基因序列如序列表 SEQ ID NO：2所示，和与之对应的bottom strand DNA，其基因序列如序列表SEQ ID NO：3 所示，将其退火形成双链后连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体中，连接产物转化到感 受态细胞DH5α，涂LB平板（含50μg/ml壮观霉素）后，37℃孵育；

转化平板分别挑取3个克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，以验证重组克隆中插入片段序 列是否与设计的寡聚单链DNA（也就是top strand DNA和与之对应的bottom strand DNA） 序列一致；

通过常规方法的验证发现本发明做获得重组载体，重组克隆中插入片段序列与设计的寡 聚单链DNA序列一致，

进一步发明人通过体内和体外检测的方式，证实该重组干扰载体可以有效地干扰体外细 胞及活鸡体内J亚群禽白血病病毒转录与复制，一般干扰效率达到85%以上，较之现有的防 治手法有着极大的进步，其中所采用的体外检测方法如下：

培养DF-1细胞，12h后接毒（ALV-J NX0101毒株），待细胞状态良好，细胞丰度达到70%-80% 时，将DF-1细胞传到24孔板上；

待细胞丰度达到70%时（大约8h-12h，），进行重组质粒的转染，72h后通过Real-time PCR 检测病毒基因的表达水平、间接免疫荧光检测ALV-J活病毒囊膜蛋白的表达水平、Western  blot检测重组质粒转染DF-1细胞后病毒囊膜蛋白的表达水平以验证干扰效果，蛋白表达结 果显示，经干扰后，ALV-J蛋白表达及mRNA转录水平明显降低，干扰效率达到85.3%；

同样的，体内试验检测：

重组干扰质粒与病毒同时接种6日龄鸡胚，同时设ALV-J感染阳性对照组及阴性对照组。

雏鸡出壳后，饲养至7周龄，全部剖杀，期间每周进行血液学、组织病理学观察以及病 毒学检测抗病毒效果；

结果显示重组质粒干扰组鸡生长正常，血液各类白细胞未见明显变化，ALV-J抗原/抗体 阴性，无排毒现象，病理组织学检测未见组织损伤及炎症反应。而ALV-J阳性对照组出现严 重的病毒血症，排毒，肝脏及心脏等重要器官出现明显的损伤和炎症。实验证明RNA干扰重 组载体可达到显著的抗病毒效果。

综上所述，本发明利用env基因非常保守这一情况且对于ALV的重要意义，利用该基因 设计合成siRNA干扰载体，并将该干扰载体与病毒共转染细胞，最终发现本发明提供的这种 干扰载体可有效地干扰体外细胞及活鸡体内J亚群禽白血病病毒转录与复制，为J亚群禽白 血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。

附图说明

图1为本发明所涉及的干扰原理图；

图2为本发明所涉及的干扰载体图谱；

图3为本发明所设计的top strand DNA和bottom strand DNA的示意图；

图中可见top strand中的斜体字体所示序列与靶基因上的一段序列相同，另一端斜体字 体序列与其互补，bottom strand中与其设计思路相同；

图4为本发明构建载体质粒电泳结果示意图，

其中电泳图左侧为DNA marker右侧为质粒的条带，

由于质粒存在的螺旋结构不同，电泳时会形成多条条带，从上到下依次为松弛开环的OC 构型、松弛线性的L构型（5700bp）和超螺旋的SC构型；图5为本发明所得干扰载体病毒荧 光的干扰效果图，

图中p-si-env为干扰组、Null-vector control为空载体对照组、ALV-J infected control 为病毒感染未干扰对照组、normal cells control为正常细胞未接毒未干扰对照组图中干扰 组与阳性对照组相比，荧光细胞数大大减少，证明本实验所用的干扰质粒有较好的干扰效果；

图6为本发明RT-PCR检测病毒表达的相对定量比较结果，

图可知干扰组与的阳性对照相对比，其病毒基因的表达水平显著降低。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定 本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变 和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术， 所采用的试剂也均为现有试剂；

实施例1双链DNA的制备

靶向env基因保守区域，起始位点为6146，结束位点为6165，设计合成siRNA，其碱基 序列为GTACAGCGATGGAATTATT，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

设计合成含上述目的片段的发卡结构，其中top strand DNA，其基因序列如序列表SEQ  ID NO：2所示；和与之对应的bottom strand DNA其基因序列如序列表SEQ ID NO：3所示； 用ddH₂O溶解成100μM，互补单链各取5-10μl两两混合，按表一给出体系进行退火。将混 合物在95℃加热5～10分钟，然后放置室温20分钟，形成双链DNA。

表一、oligo DNA退火体系

100μM top strand oligo 5μl 100μM bottom strand oligo 5μl 10×oligo annealing buffer 2μl ddH2O 8μl Total volume 20μl

实施例2重组干扰载体的构建：

将退火的双链DNA用灭菌ddH₂O继续稀释成10nM浓度，按表三给出体系在室温连接30-45 分钟。

表二、酶连接体系

5×ligation buffer 4μl pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 2μl ds oligo(10nM) 4μl T4DNA ligase（1U/μl） 1μl ddH2O 9μl Total volume 20μl

实施例3转化测试

取10μl连接产物转化100μl感受态细胞DH5α，涂LB平板（含50μg/ml壮观霉素）后， 37℃孵育。

转化平板分别挑取3个克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，以验证重组克隆中插入片段序 列是否与设计的寡聚单链DNA，也就是top strand DNA和bottom strand DNA序列一致；

通过将克隆获得的重组载体送交测序公司测序，结果发现本发明做获得重组载体，重组 克隆中插入片段序列与设计的寡聚单链DNA序列一致，可见目标片段已经成功的插入到克隆 载体中。

实施例4

干扰载体效果的体外检测：

培养DF-1细胞，12h后接毒（ALV-J NX0101毒株），待细胞状态良好，细胞丰度达到70%-80% 时，将DF-1细胞传到24孔板上；

待细胞丰度达到70%时（大约8h-12h，），进行重组质粒的转染，具体过程为：用无血无 抗的DMEM配制RNA干扰转染复合物，具体如下：转染试剂Lipofectamine^TM2000（μl）与 干扰质粒（μg）按照2.5:0.5的比例制备RNA干扰转染复合物，通过调整无血无抗的DMEM 用量使质粒终浓度为1μg/μl，将细胞生长培养基换为无血无抗DMEM，之后加入上述质粒终 浓度为1μg/μl的转染复合物，8h后更换为维持培养基。

72h后通过Real-time PCR检测病毒基因的表达水平、间接免疫荧光检测ALV-J活病毒 囊膜蛋白的表达水平、Western blot检测重组质粒转染DF-1细胞后病毒囊膜蛋白的表达水 平以验证干扰效果，蛋白表达结果显示，经干扰后，ALV-J蛋白表达及mRNA转录水平明显降 低，干扰效率达到85.3%；（如图6所示）

实施例4体内试验检测：

重组干扰质粒与病毒同时接种6日龄鸡胚，同时设ALV-J感染阳性对照组及阴性对照组。

雏鸡出壳后，饲养至7周龄，全部剖杀，期间每周进行血液学、组织病理学观察以及病 毒学检测抗病毒效果；

结果显示重组质料干扰组鸡生长正常，血液各类白细胞未见明显变化，ALV-J抗原/抗体 阴性，无排毒现象，病理组织学检测未见组织损伤及炎症反应。而ALV-J阳性对照组出现严 重的病毒血症，排毒，肝脏及心脏等重要器官出现明显的损伤和炎症。实验证明RNA干扰重 组载体可达到显著的抗病毒效果。