J亚群禽白血病病毒gp37基因siRNA表达载体的构建及体外干扰效应的初步研究

摘要

本研究以禽白血病病毒J亚群(ALV-J)gp37基因为靶向基因，以RNA干扰的方法，干扰其表达，以达到限制ALV-J在细胞内复制的目的。 参照Takara和Ambion公司的成功的经验并利用Ambion公司的在线设计工具htt:www.ambion.com/techlib/misc/siRNAdesignhtml，针对ALV-JNX0101株gp37基因序列(编码跨膜蛋白TM)寻找siRNA靶序列，根据siRNA阴性对照设计原则设计相应的阴性对照。经BLAST验证，所选择的靶序列与鸡体和其它病毒基因片段无同源性。在设计的靶序列5’端开始的19个核苷酸为正义链，中间加入9个核苷酸TTCAAGAGA间隔以形成发夹结构，3’端加有转录终止信号TTTTTT。并且5’端带有BamHI(GATCC)酶切位点，3’端带有XhoI(CTCGAG)和HindⅢ(TTCGA)酶切位点。靶序列分别被克隆到psilencer2.1-U6载体上。经XhoI酶切鉴定和测序鉴定后，证明已成功地构建了针对gp37基因不同区域的siRNA(smallinterferingRNA)表达载体。分别命名为pu6gp37-1，pu6gp37-2，pu6gp37-3，pu6gp37-4，pu6gp37-5，pu6gp37-6，pu6gp(阴性对照)。 以提取的ALV-JNX0101株病毒基因组DNA为模板，根据GeneBank上发表的ALV-JNX0101株gp37基因序列设计1对特异性引物，PCR扩增出gp37(591bp)基因，克隆到pMD18-TVector。目的片段经双酶切连接到pEGFP-N1载体上，经酶切和测序鉴定后，证明已成功地构建了gp37基因的融合表达载体，命名为pEGFP-gp37。 用pEGFP.gp37融合表达载体转染CEF细胞，分别在转染后24h，48h，72h观察荧光的变化。发现转染后24h就可见到荧光，48h荧光最强，72h荧光逐渐减弱，减少；pEGFP-gp37与构建的针对gp37基因不同区域的siRNA表达载体分别两两共转染CEF细胞后，分别在24h，48h，72h观察荧光的变化，结果发现，共转染48h后与pu6gp37-2、pu6gp37-4质粒共转染的孔荧光均减弱，荧光细胞数减少，初步验证pu6gp37-2、pu6gp37-4对TM蛋白有抑制作用。 本研究为RNAi技术应用于抗ALV-J感染研究奠定了基础并为抗病毒研究提供了新途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

文献综述 第一章 J亚群禽白血病及其研究现状

1.J亚群禽白血病

2 ALV-J的分子病毒学特性

3 ALV-J的致病性及其免疫抑制作用

3.1 ALV-J的致病性

3.2 ALV-J的致瘤机制

3.3 ALV-J的免疫抑制作用

4.ALV-J流行病学

4.1 ALV-J的宿主范围

4.2 ALV-J的传播方式

5.J亚群禽白血病的病理变化

5.1临床症状

5.2组织学变化

6 诊断

6.1 ALV-J的分离与鉴定

6.2 ALV-J的PCR检测

6.3 ALV-J的ELISA检测

7.ALV-J的防制

文献综述 第二章RNA干扰的研究进展

1 RNAi的发现及发展

2.RNAi的作用机制

3.RNAi技术路线及应用

3.1 siRNA设计

3.2 siRNA的制备

3.3 siRNA表达载体体外输送

4 RNAi在动物病毒性疾病中的研究

4.1 RNA干扰流感病毒的研究

4.2 RNA干扰马立克氏病毒的研究

4.3 RNA干扰口蹄疫病毒的研究

5 RNAi技术的展望与未来

研究内容第一章siRNA表达载体的构建

1材料

1.1质粒和菌株

1.2工具酶和主要试剂

1.3引物合成

1.4主要仪器

2.方法

2.1 RNA靶位点的选择

2.2 siRNA设计

2.3插入片段的准备

2.4载体片段的准备

2.5连接和转化

2.6阳性克隆的筛选和鉴定

3.结果

3.1 siRNA的设计

3.2 siRNA表达载体构建

3.3重组质粒的序列测定

4讨论

5小结

研究内容 第二章pEGFP-gp37融合表达载体的构建

1.材料

1.1质粒和菌株

1.2工具酶和试剂

1.3主要仪器

1.4病毒和细胞

2方法

2.1 pEGFP-gp37重组质粒载体的构建及表达

2.2.重组质粒载体的鉴定

3结果

3.1间接免疫荧光检测

3.2 gp37基因的扩增

3.3 pMD-gp37质粒酶切鉴定结果

3.4序列的测定及同源性比较

3.5重组质粒载体pEGFP-gp37的酶切鉴定

3.6重组质粒载体pEGFP-gp37的测序鉴定

4讨论

5小结

研究内容 第三章siRNA体外干扰gp37基因的初步研究

1材料

1.1试剂

1.2主要仪器

1.3细胞

2方法

2.1重组质粒pEGFP-gp37在细胞上的表达

3结果

3.1 pEGFP-gp37融合表达载体转染CEF细胞荧光表达情况

3.2 pEGFP-gp37和不同的siRNA表达载体的质粒两两共转染CEF细胞

4讨论

5小结

全文总结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文