棉花细胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个分离克隆自棉花的细胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及应用。本发明从海岛棉纤维不同发育时期的cDNA文库中获得海岛棉纤维特异表达的缺少第二个结构域的细胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中52-306为碱基所示的区域是编码区，它特异地在海岛棉纤维伸长期、转换期及次生壁合成初期高效表达。将获得的全长ORF构建到植物超量表达载体pCAMBIA2301

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种棉花细胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及应用。利用 反向遗传学的方法，通过对海岛棉纤维不同发育时期cDNA文库的分析，发现该基因GbEXPATR缺少细胞壁 伸展蛋白（α-expansin）第二个结构域。本发明分离克隆的GbEXPATR基因在海岛棉纤维伸长期、转换期 及次生壁合成初期优势表达。在棉花体内超量表达该基因能够有效促进纤维的伸长、马克隆值的降低并使 纤维从C2级上升到B2级，断裂比强度升高。利用本发明可有效改良棉花纤维品质。

背景技术

棉花是世界上最重要的经济作物之一，为纺织业提供了最主要的自然纤维，它的品质好坏直接关系到 纺织产品质量、档次的高低。棉花纤维是由胚珠外表皮细胞分化而来的单细胞表皮毛，成熟的纤维细胞长 度一般为30-40mm，厚度为15μm（Qin,Y.M.;Zhu,Y.X.,How cotton fibers elongate:a tale of  linear cell-growth mode.Current opinion in plant biology2011,14(1),106-11.）。纤维的发育 分为起始（Initiation）、伸长（Elongation）、转换（Transition）、次生壁合成（Secondary cell wall  biosynthesis）和脱水成熟（Maturation）五个彼此重叠的过程（Haigler,C.H.等,Cotton fiber:a  powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.Frontiers in Plant Science2012, 3.）。细胞壁在纤维发育过程中起着重要的作用，从伸长时初生壁的合成到次生壁加厚时纤维素的合成， 这种细胞壁性质的转换决定了纤维的品质（长度、强度、成熟度）。近几年，随着生物信息学的快速发展， RNA、DNA测序技术的逐渐完善，不同纤维发育时期细胞壁相关基因被大量挖掘出来，通过转基因技术对这 些基因的功能进行验证，发现它们影响了纤维的品质：将纤维伸长期高量表达的木葡聚糖内切转移酶基因 GhXTH超量表达后，转基因株系纤维-的长度与对照相比增长了15-20%，而断裂比强度和马克隆值没有改 变（Lee,J.等,Xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase genes in cotton and their role in fiber  elongation.Planta2010,232(5),1191-205.）。GhPEL是一个10DPA纤维高量表达的果胶裂解酶，它 能够降低去酯化果胶的含量，将该基因抑制后，转基因株系纤维长度下降了16%（Wang,H.等,The essential  role of GhPEL gene,encoding a pectate lyase,in cell wall loosening by depolymerization of the  de-esterified pectin during fiber elongation in cotton.Plant molecular biology2010,72(4-5), 397-406.）。蔗糖合成酶能够催化蔗糖生成果糖和UDP-葡萄糖，而UDP-葡萄糖是纤维素合成的重要底物， 将GhSusA1超量表达后能够使纤维的长度、强度增加，并且提高幼苗的生物量（Jiang,Y.等, Overexpression of GhSusA1increases plant biomass and improves cotton fiber yield and quality. Plant Biotechnology Journal2012,10(3),301-312.）。

从1992年McQueen-Mason发现细胞壁伸展蛋白--expansin到现在已有二十年的时间，它被认为是一 种在酸性条件下诱导细胞壁发生不可逆伸展的细胞壁蛋白。典型的细胞壁伸展蛋白expansin是由250-275 个氨基酸组成，包括一个N端的信号肽（20-30个氨基酸），两个结构域domain1（120-135个氨基酸）和 domain2（90-120个氨基酸）（Cosgrove,D.J.,Loosening of plant cell walls by expansins.Nature  2000,407(6802),321-326.）。通过序列的进化分析发现，在植物中存在四个expansin家族：α-expansin  (EXPA)，β-expansin(EXPB)，expansin-like A(EXLA)和expansin-like B(EXLB)。α-expansin存 在于双子叶植物中，β-expansin只存在禾本科植物。α-expansin和β-expansin已被证实具有细胞壁 松弛的活性，而expansin-like A和expansin-like B的功能还在研究中（Cosgrove,J.S.a.D.J.,The  expansin superfamily.2005.）。生物信息学分析表明，禾本科植物中存在一组只与expansin第二个结 构域（domain2）同源的分泌蛋白，在免疫学上划分为禾本科第二组花粉过敏源G2As（grass group-2pollen  allergens）。它们可能是由β-expansin进化而来，与β-expansin的相似度达35-45%，但是其生物学功 能还不清楚。还有两类与expansin第一个结构域相似度达25-35%的植物蛋白：p12和植物尿钠肽（PNP， plant natriuretic peptide），它们大量的存在于患有黄萎病的柑橘木质部中，具有信号功能而不具备细 胞壁松弛的活性。类Barwin蛋白是抗真菌蛋白PR4家族的成员，与expansin的相似度只有20-30%。

细胞壁伸展蛋白expansin存在于不同的组织和器官中，例如：下胚轴、根尖、节间、茎间、根毛、 花和成熟的果实，参与调控了许多植物的生长、发育、繁殖以及对逆境响应等过程。超表达PhEXPA1能增 加细胞的大小，影响细胞壁成分及叶腋分生组织的形成（Zenoni,S.等,Overexpression of PhEXPA1  increases cell size,modifies cell wall polymer composition and affects the timing of axillary  meristem development in Petunia hybrida.New Phytologist2011.）；下调IbEXP1能够增强甘薯储藏 根的形成（Noh,S.A.等,Down-regulation of the IbEXP1gene enhanced storage root development  in sweetpotato.Journal of Experimental Botany2012.）；在烟草中超表达形成层富集的CiEXPA1和 CiEXPA2，能够影响植株的生长发育，并且增加茎秆细胞壁的纤维素含量（Wang,G.等,Overexpression of  two cambium-abundant Chinese fir(Cunninghamia lanceolata)α-expansin genes ClEXPA1and ClEXPA2 affect growth and development in transgenic tobacco and increase the amount of cellulose in stem  cell walls.Plant Biotechnology Journal2011,9(4),486-502.）。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种缺少第二个结构域的棉花细胞壁伸展蛋白 （α-expansin）的GbEXPATR基因及应用。本发明可采用已经克隆的GbEXPATR基因作探针，从cDNA和基 因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因；也可以采用PCR（polymerase chain reaction）的方法， 从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的GbEXPATR基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段 DNA分子。采用以上技术，可以分离得到包含GbEXPATR基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源 基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得成熟蛋白α-expansin含量较高的转基因植株；而将这 一序列的一部分序列作为靶标构建的可在植物体内产生RNA干涉载体转化植物，可获得成熟蛋白 α-expansin含量降低的植物。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加 上任何一种强启动子、特异启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用 增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相 同，以保证整个序列的翻译。

本发明的另一个目的是在于提供一种缺少第二个结构域的棉花α-expansin基因GbEXPATR在促进棉 花纤维细胞伸长、马克隆值降低、断裂比强度升高中的应用。申请人将得到的GbEXPATR基因的ORF区域 （见序列表SEQ ID NO：2，序列长度为567bp）构建了超量表达，通过农杆菌的遗传转化在棉花植株中超 量表达，利用RT-PCR、Southern等杂交等方法筛选出表达量高的低拷贝转基因株系后，发现超量表达该 基因能够有效促进棉花纤维的发育，从而导致了成熟纤维的长度增长7%左右；马克隆值降低6%左右，使 纤维从C2级升到B2级（按照马克隆值的大小，棉花纤维分为以下几个等级：A级：范围为3.7-4.2；B1 级：范围为3.5-3.6；B2级：范围为4.3-4.9；C1级：范围为3.4以下；C2级：范围为5.0及以上。其中， A级最优，B1、B2次之，C1、C2最差）；断裂比强度提高6%左右，进一步实现改良棉花纤维品质的目的。

为了实现上述的目的,本发明采用以下技术方案：

为了获得一种缺少第二个结构域的棉花细胞壁伸展蛋白（α-expansin）GbEXPATR基因，我们采用了 如下的分离方法，具体步骤如下：

申请人所在的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的前期工作中从海岛棉纤维发育不同时期 cDNA文库中分离出一条与其它植物α-expansin基因同源度较高的cDNA（序列见SEQ ID NO:1)，生物信 息学分析表明，该cDNA包含一个完整的ORF（见SEQ ID NO:2），通过生物信息学预测可知该ORF可以翻 译出一条缺少第二个结构域的α-expansin蛋白（SEQ ID NO:3），申请人将其命名为GbEXPATR基因。该 基因在纤维伸长、转换、次生壁合成期高效表达，从海岛棉品种3-79中提取10DPA纤维总RNA（提取方法 参照Zhu等An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium  spp.suitable for cDNA library construction.Acta Agronomica Sinica.2005，31.1657-1659报道的 方法），利用反转录酶SuperscriptⅢ（购自Invitrogen公司）将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃ 5min，50℃60min，70℃10min。用引物GbEXPATR（5’ATGGCAACCAAAACGATGATGT3’）和GbEXPATR （5’CATAAATATCATGCACCTCCCAC3’）扩增出GbEXPATR基因的全长ORF（567bp）。PCR反应条件为：94 ℃预变性3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸10min。将扩增获 得的PCR产物连入pGEM-T载体（购自Promega公司），筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因全长ORF。 结果表明：该基因是从海岛棉纤维发育不同时期cDNA文库中分离克隆到的全长序列，该基因的cDNA序列 为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该基因的ORF的序列是SEQ ID NO：3，或至少50％同源性的序列， 以及上述DNA片段编码的蛋白：该基因翻译后对应的蛋白，为与SEQ ID NO：3所示的蛋白质的序列。本 发明克隆的基因GbEXPATR基因在海岛棉纤维发育不同时期中均有一定量的表达，在伸长期的纤维中的表 达量相对较高，随着纤维的发育表达量下降，但在根、茎、叶、花瓣、花药和柱头中没有表达。

根据上述GbEXPATR cDNA设计超表达引物，在引物两端分别加上NcoI和BstEⅡ的酶切位点及保护碱 基，我们分别将该引物命名为引物GbEXPATRPoef和GbEXPATRPoer，再以GbEXPATR基因的cDNA为模板进 行PCR扩增，得到的PCR产物通过酶切连接的方法连入到以相同酶消化的pCAMBIA2301^m载体上 （pCAMBIA2301^m载体的前体是由澳大利亚CAMBIA实验室Center for the Application of Molecular  Biology to International Agriculture惠赠的pCAMBIA2301，通过PCR介导突变法去掉载体pCAMBIA 2301的NPTⅡ上游的Nco I、BglⅡ两个酶切位点改造而成，可由专利发明人张献龙直接提供），构建得 到一种过量表达载体p35S::GbEXPATR，所述的过量表达载体p35S::GbEXPATR含有SEQ ID NO：1或SEQ  ID N0：3所示核苷酸片段的表达载体，一种过量表达载体p35S::GbEXPATR，所述的表达载体为植物表达 载体pCAMBIA2301^m。其表达翻译后形成含有SEQ ID N0:2所示序列对应的氨基酸序列。

上述克隆的基因GbEXPATR在促进棉花纤维细胞伸长、马克隆值降低、断裂比强度升高中等到应用， 其应用的具体过程是:

将构建的载体转化农杆菌菌株LBA4404（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻组林拥军提 供），再通过农杆菌介导的转化方法转化棉花，所采用的转化受体材料为YZ-1（河南省农业科学院植物保 护研究所马奇祥惠赠），农杆菌介导的转化棉花的方法参照Jin等的文献（Identification of a novel elite  genotype for in vitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum,2006, 50:519-524）。转化方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(An efficient grafting system for  transgenic plant recovery in cotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 85:181-185,2006)。

GbEXPATR基因超量表达转基因系得到3个表达量较高的家系。对转基因株系提取基因组DNA，通过 Southern blot分析，鉴定其转基因的效果以及拷贝数。按单株提取转基因株系总RNA，每个株系至少三 个生物学重复，通过Realtime PCR进行表达分析，Realtime-PCR方法同实施例2。

通过HFT9000大容量纤维测试仪对成熟纤维长度、马克隆值、断裂比强度进行测量，转基因超表达的 三个株系OE2、OE3和OE4的成熟纤维长度对比野生型显著增长了1.6-2.1毫米；马克隆值下降了0.23-0.38， 使纤维从C2级上升到B2级；断裂比强度升高了1-1.73cN/tex。

本发明的优点：

（1）通过海岛棉纤维发育不同时期cDNA文库中得到缺少第二个结构域的细胞壁伸展蛋白GbEXPATR基 因，本发明的方法高效，准确性高。

（2）将携带有本发明GbEXPATR基因的表达载体载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转 化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998,Method for Plant Molecular  Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular  Biology(2nd Edition)。

（3）通过转基因对GbEXPATR基因进行了功能验证，证实该基因的高效表达能够显著提高棉花纤维中 GbEXPATR的表达量，从而进一步促进棉花纤维细胞的伸长、马克隆值的降低、断裂比强度的升高，为棉花 纤维品质改良创造了理论基础。

（4）可使用包括本发明的GbEXPATR基因的表达载体转化的宿主是包括棉花在内多种植物，来促进细胞 的伸长；可使用包括本发明的GbEXPATR基因片段为靶标的连接35S高效启动子的超量表达载体转化宿主 棉花，可用于培育较长纤维的棉花品种。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是从海岛棉纤维发育不同时期cDNA文库中分离出一条与其它植物α-expansin基 因同源度较高的cDNA序列，序列全长为820bp，其中该序列的第52-306bp所在的区段是该基因的编码区， 它编码85个氨基酸。

序列表SEQ ID NO：2是上述GbEXPATR基因片段编码区的蛋白质的序列。

序列表SEQ ID NO：3是从上述SEQ ID NO：1所述的cDNA序列中分离出的完整ORF（缺少第二个结构 域的棉花α-expansin基因片段），序列长度为567bp。序列1包含序列SEQ ID NO：3。

图1：采用ClustalW软件（公开使用软件）对GbEXPATR基因序列的分析结果。

结果表明：与陆地棉的6个α-expansin基因相比(AF512539,AF512540,AF512541,AF512542,AF512543 和AF512544)，GbEXPATR基因的氨基酸序列在N端的α-expansin信号肽以及6-8个半胱氨酸残基和HFD 基元（His-Phe-Aap）是完全保守的。

图2：利用Real-time PCR方法检测GbEXPATR基因在棉花不同组织中的表达水平。图中显示：

GbEXPATR基因只在海岛棉3-79纤维发育不同时期中有表达，在陆地棉TM-1中没有表达。在伸长期的 纤维中的表达量相对较高，并随着纤维的发育表达量下降，但在根、茎、叶、花瓣、花药、柱头没有表达。 选取的24个组织分别是海岛棉3-79和陆地棉TM-1的：1.根；2.茎；3.叶；4.花瓣；5.花药；6.柱 头；7.0DPA胚珠；8.5DPA纤维；9.10DPA纤维；10.15DPA纤维；11.20DPA纤维；12.25DPA纤维(DPA: day post anthesis开花后天数)。

图3：是本发明利用的原始质粒和改造后的质粒图。其中：图3A是质粒pCAMBIA2301的原始质粒图， 图3B是本发明构建的超量表达载体所用的pCAMBIA2301m质粒图,图3C是本发明构建的过量表达载体 p35S::GbEXPATR图。

图4：GbEXPATR转基因棉花Southern杂交检测结果。图中：OE为超表达株系，其中OE2为双拷贝， OE3和OE4为单拷贝。

图5：通过Realtime-PCR方法对GbEXPATR转基因棉花T4代进行表达分析的结果。

取10DPA、15DPA、20DPA的纤维提取总RNA对GbEXPATR转基因后代进行表达分析。通过Realtime-PCR 对GbEXPATR转基因后代进行表达分析，结果表明在OE2、OE3和OE4三个株系中的表达量显著提高。

图6：GbEXPATR转基因棉花图片，GbEXPATR能促进纤维变长。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1：GbEXPATR基因分离克隆及其在棉花不同组织的表达特性

申请人的作物遗传改良国家重点实验室的前期工作中从建立的海岛棉纤维发育不同时期cDNA文库（Tu, L.L.;等Genes expression analyses of sea-island cotton(Gossypium barbadense L.)during fiber development. Plant cell reports2007,26(8),1309-1320.）中分离出一条与陆地棉细胞壁伸展蛋白α-expansin基因(基因 登陆号：AF043284)高度同源但缺少第二个结构域的cDNA（见SEQ ID NO:1)，生物信息学分析表明，该 cDNA包含一个完整的ORF（见SEQ ID NO:3），通过生物信息学预测可知该ORF可以翻译出一条非完整的 α-expansin蛋白（其编码的蛋白质的氨基酸序列见SEQ ID NO:2），我们将该片段命名为GbEXPATR基因。 该基因在纤维伸长各个时期高效表达，从海岛棉品种3-79中提取10DPA纤维总RNA（提取方法参照Zhu等 报道的方法：Zhu等。An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium  spp.suitable for cDNA library construction.Acta Agronomica Sinica.2005，31.1657-1659.），利 用反转录酶SuperscriptⅢ（购自Invitrogen公司）将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min， 50℃60min，70℃10min。用引物GbEXPATR（5’ATGGCAACCAAAACGATGATGT3’）和GbEXPATR（5’ CATAAATATCATGCACCTCCCAC3’）扩增出GbEXPATR基因的全长ORF（567bp）。PCR反应条件为：94℃预 变性3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的 PCR产物连入pGEM-T载体（购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，即美国Promega公司总代理），筛 选阳性克隆并测序，获得所需的基因全长ORF。结果表明：该基因是从海岛棉纤维发育不同时期cDNA文库 中分离克隆到的全长序列，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中第52-306bp处的区段为该基因 的编码框即ORF（见SEQ ID NO：1中所示对应的氨基酸序列，编码85个氨基酸），该基因编码的蛋白质的 序列见SEQ ID NO：3所示。

实施例2：超量表达载体的构建和转化

为了验证GbEXPATR基因在棉花中的功能，申请人构建了超量表达载体来转化棉花。

根据实施例1中得到GbEXPATR cDNA的ORF区域（见SEQ ID NO：1中52-306碱基对应的区域）设计 超表达引物对（该引物对的DNA序列见本段后的描述），我们在引物对两端分别加上NcoI和BstEⅡ的酶切 位点及保护碱基，分别将该引物对命名为引物GbEXPATRPoef和GbEXPATRPoer，再以GbEXPATR基因的cDNA 为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物通过酶切连接的方法连入到以相同酶消化的pCAMBIA2301^m载体上 （pCAMBIA2301^m载体的前体是由澳大利亚CAMBIA实验室Center for the Application of Molecular  Biology to International Agriculture惠赠的pCAMBIA2301，通过PCR介导突变法去掉载体pCAMBIA 2301的NPTⅡ上游的Nco I、BglⅡ两个酶切位点改造而成（pCAMBIA2301^m载体图见图3B），构建得到一 个过量表达载体p35S::GbEXPATR（见图3C）：用GbEXPATR的基因片段替换了pCAMBIA2301^m载体中的Gus  Second Exon片段。超量表达载体p35S::GbEXPATR含有SEQ ID NO：2所示的其中之一核苷酸片段的表达 载体，其表达翻译后形成含有SEQ ID NO：2的序列。本发明构建的超量表达载体p35S::GbEXPATR的图 谱见图3C。

上述引物对的DNA序列如下：

GbEXPATRPoef:5'gcgtCCATGGCAACCAAAACGATGATGT3'；

GbEXPATRPoer:5'gtcGGTCACCCATAAATATCATGCACCTCCCAC3'。

将构建的载体转化农杆菌菌株LBA4404，再通过农杆菌介导的转化方法转化棉花，所采用的转化受体 材料为棉花YZ-1，该材料是本申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室棉花课题组经过大量的筛选发现 的一个具有很高胚胎发生能力的材料（Jin等，Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and  genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum,200650(4):519-524），农杆菌介导的转化棉花的方法参照 Jin等的文献（Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetic  transformation of cotton.Biologia Plantarum,2006,50:519-524）。转化方法和程序参照Jin等建 立的高效转化体系(An efficient grafting system for transgenic plant recovery in cotton(Gossypium  hirsutum L.).Plant Cell,Tissue and Organ Culture,85:181-185,2006)，并作了相应的调整和修 改，具体方法和流程如下：

1、无菌苗的培养

将陆地棉YZ-1）棉籽壳去掉，先用0.1%的升汞溶液灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培 养基上（配方如下：2/1MS大量元素+葡萄糖15g.L^-1+植物胶phytagel2.5g.L^-1），灭菌前调整培养基的 pH至7.0，在121℃的高压蒸汽下灭菌30min,将接种后的培养容器置于培养室内，28℃，暗培养3-6天。

2..农杆菌的活化和保存

2..1培养基和相关材料的准备：

农杆菌LBA4404；制备含卡那霉素50mg.L^-1的MGL液体培养基（培养基的配方：胰化蛋白胨5g/L， 氯化钠5g.L^-1，MgSO4.7H2O0.1g.L^-1，KH2PO40.25g.L^-1，甘露醇5g.L^-1，甘氨酸1.0g.L^-1，用蒸馏水 补充培养基至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0）；灭菌的三角瓶；LB培养基（固体、液体）（配方：胰化 蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+氯化钠5g/L+琼脂粉15g/L，灭菌前调整培养基的pH至7.0，在121℃的 高压蒸汽下灭菌；卡那霉素50mg.L^-1；灭菌甘油；枪头；5mL离心管。接种后的培养容器置于培养室内。

2..2操作：

2..2..1活化，悬浮：

从超低温冰箱内取出保存的具有超表达载体的农杆菌菌株LBA4404的甘油管在冰上融化，LB平皿上 划线，26.5℃暗培养36-48hr，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5℃暗培 养36-48hr，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，28℃、 200rpm培养2hr，使OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。

2..2..2菌株的保存：

从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpm，26℃摇48hr，按菌液和甘油体积比为1:1 加入到1.5mL离心管混匀，-70℃保存。

3..浸染，共培养：

3..1准备：

暗培养5天左右幼嫩健壮的YZ-1幼苗，经活化的农杆菌，无菌培养皿和无菌滤纸等。

3..2操作：

无菌条件下将YZ-1幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-1cm长的切段，转入到经活化的农杆菌菌液中， 搅匀，静置5-10分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，薄层分散布于垫有滤 纸的共培养培养基中（配方：MS无机盐+B5有机物+2,4-D0.1mg/L+KT(激动素)0.1mg/L+氯化镁1g/L+ 葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，调pH至7.0），于19-21℃暗培养38-42小时。

4..愈伤组织的诱导

将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上（配方：MS无机盐+B5有机物+2,4-D0.1mg/L+ KT(激动素)0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L），灭菌前调培养基的pH至7.0。

5、非胚性愈伤组织的增殖

非胚性愈伤组织的增殖培养基如下所示：MS无机盐(其中硝酸钾的量加倍，硝酸铵的量减半)+B5有 机物+2,4-D0.05mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，灭菌前调培养基的pH至7.0。

6、愈伤组织的分化

愈伤组织经继代（一个月继代一次）几次后，有的愈伤组织转化成米粒状颗粒，将其转入分化培养基 上（配方：MS基本培养基+B5有机物+激动素（KT）0.15mg/L+吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L+葡萄糖 30g/L+phytagel2.5g/L），灭菌前调培养基的pH至7.0，使其进一步分化成胚状体。

7、胚性愈伤组织的继代

胚性愈伤组织的继代培养基如下所示：

MS无机盐(其中硝酸钾的量加倍，硝酸铵的量减半)+B5有机物+KT0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷 胺酰胺)1.0mg/L+天冬酰胺(Asn)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，灭菌前调培养基的 pH至7.0。

8、成苗生根培养

将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上（配方：1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖 15g/L+phytagel2.5g/L，灭菌前调培养基的pH至7.0）。

9、炼苗移栽

将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大 田。

实施例3：GbEXPATR转基因株系相关分析

1、GbEXPATR转基因株系分子鉴定

通过GbEXPATR基因超量表达转基因系得到3个转基因家系，分别命名为：OE2、OE3和OE4。从所获 得的转基因家系中提取基因组DNA（按常规方法），通过Southern blot分析，鉴定其转基因的效果以及拷 贝数。转基因家系基因组DNA提取方法和Southern实验参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆 实验指南（第三版），科学出版社，2002版报道的方法。结果见图4所示。

2、GbEXPATR转基因株系表达分析

按单株提取转基因株系总RNA（J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南（第三版），科学 出版社，2002版），每个株系至少三个生物学重复，通过Realtime PCR进行表达分析，Realtime-PCR方 法与实施例2相同，具体分析方法参考涂礼莉报道的方法（涂礼莉.海岛棉花纤维发育相关基因表达谱分 析及功能基因的发掘.[博士学位论文].武汉.华中农业大学图书馆，2007.中国知网网址： http://www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&QueryID=11&CurRec=3&dbname=CDFD9908 &filename=2007209600.nh&urlid=&yx=&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlRaSXUwTVpZUXF0cnY5WGVoUWR6R25P  VTVRYUtudHZHUi8xKzNtbFhqaUJSTGZjeg==），结果见图5。

3、GbEXPATR转基因株系表型分析

在田间取10月中下旬在湖北省武汉市华中农业大学试验棉田收获的棉花进行纤维品质分析，采用型 号为HFT9000大容量纤维测试仪进行成熟纤维品质分析（按常规方法），结果表明：转基因超表达的三个 株系OE2、OE3和OE4的成熟纤维长度对比野生型（非转基因）植株显著增长了1.6-2.1毫米；马克隆值 下降了0.23-0.38，使纤维从C2级上升到B2级；断裂比强度升高了1-1.73cN/tex。详细结果见表1。

表1转基因棉花纤维品质参数

样品 纤维长度(mm) 马克隆值 强度(cN/tex) YZ1 26.99±0.07 5.05±0.07 27.20±0.39 OE2 29.09±0.15** 4.82±0.10** 28.93±0.75** OE3 28.87±0.38** 4.73±0.13** 28.20±0.24** OE4 28.63±0.91** 4.67±0.18** 28.90±0.14**