棉花纤维伸长相关基因GbEXPA2和GbEXPATR的克隆及功能分析

摘要

棉纤维是世界上最重要的天然纺织纤维。它由胚珠外表皮细胞分化而来，是高度伸长、增厚、无分支的单细胞表皮毛。成熟棉花纤维的品质主要由其细胞壁的特性所决定，因此对棉花纤维细胞壁相关基因的研究，其意义就显得尤为重要，不仅能丰富现有棉花纤维细胞壁的研究领域，还能为纤维品质的改良提供新的育种材料。本实验室在前期研究中，比较相同发育时期海岛棉3-79和陆地棉TM-1纤维表达谱时发现了一个在海岛棉和陆地棉中共同表达的细胞壁松弛蛋白基因GbEXPA2和一个海岛棉特异表达的细胞壁松弛蛋白基因GbEXPATR。经序列分析发现，GbEXPA2具有完整细胞壁松弛蛋白基因的结构（信号肽和两个结构域），而GbEXPATR只具有信号肽和第一个结构域，缺少C末端多糖绑定的结构域。基于以上研究，本论文进一步深入分析了这两个基因的功能。
　　1.海岛棉特异表达的细胞壁松弛蛋白基因GbEXPATR起源于A基因组
　　通过分析GbEXPA2和GbEXPATR基因的特异SNP位点，发现GbEXPA2与Gr-contig12和Gh-contig29-2的SNP位点高度相似，GbEXPATR与Ga-contig4和Gh-contig29-1的SNP位点相似，即GbEXPA2来自海岛棉的DT亚组，而GbEXPATR来自AT亚组。进一步分析表明，在Gh、Ga、Gr中不存在缺失第二个结构域的细胞壁松弛蛋白，因此推测GbEXPATR可能是在海岛棉多倍体加倍过程中或之后产生的。
　　2.proGbEXPA2和proGbEXPATR是表皮毛特异表达的启动子且proGbEXPA2受GA和ABA调控
　　通过Genome-Walking的方法从海岛棉3-79中克隆到长839 bp的GbEXPA2启动子和长1405 bp的GbEXPATR启动子。序列比对表明二者具有较高的相似度。分别将proGbEXPA2和proGbEXPATR与GUS报告基因融合转化棉花和拟南芥，组织化学染色表明这两个启动子具有相似的表达模式，在纤维伸长期和拟南芥表皮毛中高量、优势表达，在根、茎、叶等其它组织没有表达。与proGbEXPATR不同的是，proGbEXPA2在棉花幼嫩叶子的表皮毛中也有表达。进一步通过GbEXPA2启动子5'端的逐步缺失，发现长度为461 bp的proGbEXPA2能够驱动下游GUS基因在纤维和拟南芥表皮毛中表达，而长度为258bp则不足以驱动其表达，暗示了461bp的启动子片段是proGbEXPA2的核心启动子区域。用GA3和ABA处理proGbEXPA2全长和截短启动子的转基因拟南芥幼苗，GUS染色结果显示:proGbEXPA2经GA3处理后，GUS表达量明显上调;而ABA处理则使GUS表达量显著下调。
　　3.下调纤维中EXPA的表达后，纤维变短变粗;而超量表达GbEXPATR则促进纤维变长变细
　　为了验证细胞壁松弛蛋白基因EXPA在纤维发育中的功能，通过RNAi技术获得了EXPA表达量下调的五个转基因株系，对其成熟纤维品质检测发现纤维长度明显变短、马克隆值升高、断裂比强度下降。随后又检测了EXPA-RNAi成熟纤维细胞壁的厚度及晶体纤维素的含量，结果显示下调纤维中EXPA的表达后，纤维细胞壁增厚、晶体纤维素含量升高。进一步为了研究GbEXPA2和GbEXPATR对纤维发育的影响，构建了它们超量表达载体并转化陆地棉YZ1，分别获得3个高量表达的转基因株系。分析表明，超量表达GbEXPA2不影响纤维细胞的伸长，但能使其马克隆值上升、成熟纤维的细胞壁增厚、晶体纤维素含量升高;而超量表达GbEXPATR则能促进纤维品质的提高，使其更长、更细、更强。通过杂交手段将35S∷GbEXPATR导入到EXPA-3' UTR RNAi植株中，发现EXPA-3' UTR RNAi短纤维的表型在F1代被完全恢复，表明在纤维发育中全长的EXPA能被GbEXPATR功能互补。
　　4.GbEXPATR通过推迟次生壁合成相关基因的表达进而改变细胞壁成分来促进纤维的伸长
　　对EXPA-3' UTR RNAi株系10天纤维的RNA-seq分析表明抑制EXPA的表达不影响纤维细胞其它基因的表达，暗示了EXPA是一类下游基因。qRT-PCR分析其15和20天纤维次生壁相关基因CTLs、CESAs和GhTLP1的表达发现，与对照相比没有一致的变化。在GbEXPA2和GbEXPATR超量表达株系15天的纤维中，这些次生壁相关基因被下调表达;20天，这些基因在GbEXPA2中的表达变化不明显，但在GbEXPATR中仍有下降。用单糖关联分析的方法对转基因株系20天纤维细胞壁成分分析结果表明，在RNAi和GbEXPA2株系中纤维素含量显著升高，其它非纤维素多糖含量下降;而GbEXPATR与之相反，且纤维素的结晶度显著下降。这些数据表明，在纤维初生壁阶段，GbEXPA2和GbEXPATR的功能相似;在次生壁阶段功能不同，并且GbEXPATR促进纤维的伸长通过推迟次生壁的合成来实现。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 植物细胞壁的研究

1．1．1 纤维素

1．1．2 半纤维素

1．1．3 果胶

1．1．4 细胞壁蛋白

1．2 棉花纤维和细胞壁

1．2．1 棉花纤维发育的过程和特点

1．2．2 棉花纤维细胞壁及研究进展

1．3 Expansin蛋白的研究进展

1．3．1 Expansin的分类与蛋白结构

1．3．2 Expansin的作用机制

1．3．3 Expansin功能的研究进展

1．3．4 Expansin在棉花中的研究进展

1．4 本研究的目的、意义及技术路线

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验菌株及载体

2．2 实验方法

2．2．1 数据收集及分析

2．2．2 棉花基因组DNA的提取及Southern杂交

2．2．3 基因组DNA序列的克隆

2．2．4 棉纤维总RNA的提取及Northern杂交

2．2．5 实时定量PCR

2．2．6 表达载体的构建

2．2．7 棉花的遗传转化及检测

2．2．8 拟南芥的逮传转化及检测

2．2．9 转基因植株GUS蛋白的分析

2．2．10 石蜡切片

2．2．11 外源激素处理拟南芥转基因植株

2．2．12 棉花胚珠离体培养

2．2．13 拟南芥初生根及根毛长度的测量

2．2．14 纤维的长度测量及成熟纤维的品质鉴定

2．2．15 X-射线分析纤维素的结晶度

2．2．16 棉花纤维细胞壁多糖的成分分析

2．2．17 棉花转基因株系的Solexa测序

3 结果与分析

3．1 GbEXPA2和GbEXPATR基因的结构及表达分析

3．1．1 GbEXPA2和GbEXPATR基因结构分析

3．1．2 GbEXPA2和GbEXPATR的表达分析

3．2 GbEXPA2和GbEXPATR基因的进化分析

3．2．1 Ga和Gr基因组中expansin家族成员分析

3．2．2 陆地棉α-expansin基因的表达分析

3．2．3 GbEXPA2和GbEXPATR是同源基因

3．3 GbEXPA2和GbEXPATR的启动子分析

3．3．1 GbEXPA2和GbEXPATR启动子的克隆和序列分析

3．3．2 GbEXPA2和GbEXPATR启动子转录模式的分析

3．3．3 GbEXPA2和GbEXPATR核心启动子区域的确定

3．3．4 拟南芥中GA和ABA对proGbEXPA2的调控

3．4 GbEXPA2和GbEXPATR在棉花纤维中的功能及作用机制

3．4．1 GbEXPA2和GbEXPATR的亚细胞定位

3．4．2 超量表达GbEXPA2和GbEXPATR能增加拟南芥初生根及根毛的长度

3．4．3 棉花expansin转基因材料分析

3．4．4 棉花expansin转基因材料的表型鉴定

3．4．5 GbEXPATR能恢复EXPA下调表达所引起的纤维变短

3．4．6 异源表达GbEXPATR影响棉花纤维次生壁相关基因的表达

3．4．7 异源表达GbEXPATR和GbEXPA2影响棉花纤维次生壁的结构及成分

4 讨论

4．1 关于棉花中expansin超家族的分析

4．2 关于GbEXPA2和GbEXPATR启动子的分析

4．3 α-expansin在棉花纤维细胞壁重塑过程中的作用

4．4 GbEXPATR可能是海岛棉纤维品质优于陆地棉的原因之一

4．5 展望

参考文献

Protocols

附录

攻读学位期间所发表的论文及专利申请

致谢