一种检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP法检测试剂盒

摘要

本发明属于分子诊断领域，提供了一组用于检测P73基因及其启动子区甲基化状态的引物，包含该引物组的试剂盒，以及使用该试剂盒非诊断检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP方法。

说明书

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体的说，本发明使用甲基化和非甲基化引物对以MSP 法检测P73基因及其启动子区甲基化状态。

背景技术

DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中，是最早发现的修饰途径之一，是表观遗 传学的重要组成部分。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。甲 基化通常发生在胞嘧啶的C5位，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，甲基化的胞嘧啶多位于CpG岛上。 CpG岛是CpG二联核苷富集区域，CG含量大于50%，长约200～500bp。哺乳动物DNA甲基化的模 式只有5mC这一形式，真核生物中大约2%～7%的胞嘧啶被甲基化修饰。

甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，这种变化包含基因组整体甲基化水平降 低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如 果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的几率提高。因此，甲基化的研究为肿瘤 的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据。

甲基化特异性PCR(MSP)是Herman等首先提出的一种检测基因组DNA甲基化水平的常用方 法。该法是将DNA经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶 保持不变。在PCR反应时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后 的甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引 物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检 测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的DNA序列无互补配对。MSP 引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检 测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中CpG岛所占比例越高，甲基化DNA检出率 越高。

这种方法经济实用，灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制，无需特殊 仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。该法不足 之处在于：你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，引物的选择和设计非常 关键，否则易导致假阳性；如果亚硫酸氢钠对DNA处理不完全，也易导致假阳性。可通过限 制性内切酶酶解法检验PCR产物作进一步判断。

P73基因位于人类染色体1p36.33，含有两个启动子区域P1和P2，是1997年由Kaghad 发现的p53家族成员之一，该基因在结构、功能上与p53.基因具有相似性，被认为是一个 候选的抑癌基因。但是与P53基因在人类肿瘤发生中经常发生突变不同，至今极少发现P73 基因发生突变。目前研究发现，在多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤中P73基因沉寂往往与 基因甲基化有关（如Pei JH et al.The association between non-Hodgkin Lymphoma and  methylation of P73.Tumor Biol 2011，32（6）：1133-1138；Liu K et al.Loss of P73  expression in six non-small cell lines is associated with5’CpG island methylation.Exp  Mol Pathol,2008,84（1）：59-63）。

目前，大多数针对P73基因甲基化的检测，都是只是检测第一外显子区的甲基化状态 或者是只检测启动子区的甲基化状态，而根据我们研究发现，很多P73基因甲基化标本仅仅 只能检测出其中一个发生甲基化，只有少数能同时检测出启动子与第一外显子区都发生甲基 化；然而，不管是启动子区发生甲基化还是第一外显子发生甲基化，都会导致P73基因表达 发生抑制。所以，同时检测P73基因启动子区以及第一外显子区的CpG岛将能更加准确的 判断出其甲基化状态，使得检测的结果更加准确可靠。对于研究P73甲基化与相关疾病的关 系，其结果将会更加准确并且更有说服力；对于疾病的辅助诊断更加可靠。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一组用于检测P73基因及其启动子区甲基化状态的引物， 由：

序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的P73基因甲基化引物对（扩增片段长62bp）、

序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的P73基因非甲基化引物对（扩增片段长71bp）、

序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的P73基因启动子区甲基化引物对（扩增片段长 179bp）

序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的P73基因启动子区非甲基化引物对（扩增片段长 191bp），

组成。

上述引物组可以用于制备用于检测P73基因及其启动子区甲基化状态的试剂。

本发明还提供了包含上述引物组的，检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP法 检测试剂盒。

此外，本发明提供了使用上述试剂盒非诊断检测P73基因及其启动子区甲基化状态的 MSP方法，包括从样品中提取DNA、重硫酸盐处理DNA、使用权利要求的试剂盒中的引物 进行PCR反应、根据扩增片段的大小或有无确定样品的P73基因及其启动子区甲基化状态， 其中PCR反应的反应体系为：

反应程序为：

其中X为各对引物的退火温度，其分别为：

P73基因甲基化引物对58℃、P73基因非甲基化引物对58℃、P73基因启动子区甲基化引 物对64℃，P73基因启动子区非甲基化引物对60℃。

本发明中所述的非诊断检测方法可以是用于科研用途的方法，例如可以非诊断的检测来 自各保藏机构的细胞株样本，或者医疗机构所收集的研究用细胞/血液样本，这些样本的样 本主体已经去世/治愈/去向不明，所以显然检测其P73基因及其启动子区的甲基化程度并不 是为了检测样本主体的健康状态而是为了科研。

附图说明

图1为一份样品的P73基因启动子甲基化检测结果示例：（结果为该样本P73基因启动子区部 分发生甲基化），2%琼脂糖凝胶电泳。

图2为一份样品的P73基因第一外显子甲基化检测结果示例：（结果为该样本P73基因第 一外显子区部分发生甲基化），4%琼脂糖凝胶电泳。

具体实施方式

经过反复的试验与优化，本发明人选出两对特异性很好的甲基化及非甲基化引物对，应 用琼脂糖凝胶电泳技术作为结果的检出手段，得到了可靠地实验结果。利用所述引物对及试 剂盒检出P73基因甲基化状态的灵敏度高。

检测样品为来自人的骨髓穿刺物和血液样本共33份。

本发明的引物组由Invitrogen公司合成

人基因组非甲基化阴性对照和人基因组甲基化阳性对照商品（购自上海奇悟）

检测过程：

（1）血液基因组DNA抽提

用血液基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)，按照说明书上的操作流程，提取基因组DNA，于 -20℃保存。

（2）基因组DNA的重亚硫酸盐处理

取1-2μg的基因组DNA，用ddH₂O稀释至20μl。按照EpiTect Bisulfite Kit(QIAGEN)说明书上 的操作流程，进行重亚硫酸盐处理，并纯化收集处理后的DNA。于-20℃保存。

（3）利用本发明的P73基因甲基化MSP法检测的反应体系与反应程序如下：

PCR反应体系：

PCR反应程序如下（X为各引物对的退火温度）：

其中X为各对引物的退火温度，其分别为：

P73基因甲基化引物对58℃、P73基因非甲基化引物对58℃、P73基因启动子区甲基化引物 对64℃，P73基因启动子区非甲基化引物对60℃。

（4）检测结果判断：

每份样品中的阴性和阳性对照都得到了预期的阴性和阳性扩增结果，证明了本发明的引 物组有良好的特异性，能准确检测样本的甲基化情况。33份样品中，有9份P73基因启动子 区发生部分甲基化，有8份P73基因外显子区部分甲基化，启动子外显子区均发生甲基化的 样品共有3份。