一株具有乙酸耐受性的工业酿酒酵母菌株

摘要

一株具有乙酸耐受性的工业酿酒酵母菌株（4126-YHB1），属于微生物技术领域。该菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae，菌株的登记入册编号CGMCC No.8725，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月15日。本发明公开了重组菌株4126-YHB1的基因工程构建方法，包括基因的获得，染色体整合载体的构建，以及菌株乙酸条件下的生长和发酵实验。与整合空载体的对照菌株相比，重组菌株4126-YHB1可以在含有5g/L乙酸的培养基中进行快速乙醇发酵，可以耐受纤维素水解液中高浓度的乙酸，是环境胁迫条件下乙醇发酵的良好菌株。

说明书

技术领域

本发明涉及一株具有乙酸耐受性的工业酿酒酵母菌株（4126-YHB1），属于微生物技术领域。 

背景技术

由于化石燃料的储备量不断减少和国际原油价格的不稳定等因素，国内外对于可再生清洁能源的需要日益增加，生物燃料是具有良好发展前景的可再生能源。除了具有可再生能源的一般优点外，生物燃料还可以减轻由化石燃料所引起的一系列问题，尤其可降低气体排放所引起的温室效应。在众多类型的生物燃料中，燃料乙醇表现出了巨大优势（Applied Microbiology and Biotechnology,2009,85:253-263）。乙醇不仅是一种优良燃料，也是一种优良的燃油品质改善剂，同时又具有极好的抗爆性能。我国拥有丰富的纤维素生物质资源，如果能够充分有效地利用这些原料生产燃料乙醇，既可以保护环境，还可以解决利用淀粉质原料生产乙醇产生的与人争粮，与粮争地的弊端。利用纤维素为原材料生产乙醇有利于经济的可持续发展，同时也可以降低我国对于进口石油能源的依赖，保障国家的能源安全。 

木质纤维素生物炼制乙醇过程中，由于原料中纤维素、半纤维素和木质素之间致密的结构，不利于纤维素酶对纤维素的水解，因此，木质纤维素在酶水解前必须经过预处理以提高纤维素对纤维素酶的可及度。稀酸和蒸汽爆破预处理是目前研究较多的预处理方法，在稀酸和蒸汽爆破预处理过程中，由于酸和热的作用，原料中部分碳水化合物发生降解和分解作用，产生甲酸、乙酸等一 系列对后续发酵有害的物质，其中乙酸是主要的发酵抑制物，含量较高(生物工程学报,2014,30:368-380)。木质纤维素预处理所产生的抑制剂会影响酵母的正常生长和后续的发酵过程。为减小抑制剂的影响所采取的一些脱毒策略往往造成糖的损失和生产成本的增加，影响了生产的经济性。因此，选育具有强的抑制剂耐受性，包括具有强的乙酸耐受性的酿酒酵母菌株对于提高纤维素乙醇产率十分重要。 

通过寻找与细胞胁迫耐性相关的基因，对酿酒酵母菌进行代谢工程改造，可提高细胞在环境胁迫条件下的细胞活性，从而提高发酵效率。YHB1基因参与编码抑制一氧化氮毒性的黄素血红蛋白(Proceedings of the National Academy of Sciences,1992,89:5015-5019)，黄素血红蛋白可以保护细胞免受硝酸化胁迫压力。敲除了YHB1基因的细胞无法清除一氧化氮，黄素血红蛋白在无氧及有氧条件下均可保护细胞免受一氧化氮及硝酸盐胁迫作用(Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,97:4672-4676)。此外，黄素血红蛋白不仅与氮化胁迫相关，其在消除氧化胁迫方面也有显著作用(Journal of Biological Chemistry,2005,280:7645-7653)。但是该基因在乙醇及乙酸耐受性方面的研究很少，目前未见到有关于该基因的表达可提高乙酸耐受性的报道。 

发明内容

本发明的目的在于构建一株具有乙酸耐受性的重组酿酒酵母菌株，从而可以在高浓度乙酸抑制物存在条件下快速高效的进行乙醇发酵。 

本发明涉及一株具有乙酸耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-YHB1），该菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae，菌株的登记入册编号为CGMCC No. 8725，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月15日。 

所述菌株基因来源于实验室模式酿酒酵母S288c，将PCR扩增得到的YHB1基因连接到pHO组成型整合表达载体，线性化后转入工业酿酒酵母，实现整合表达。 

所述具有耐乙酸的重组酿酒酵母菌（4126-YHB1）过表达黄素血红蛋白YHB1基因，YHB1基因序列的GenBank登录号为NC_001139。PGK1启动子序列GenBank登录号为FJ415226.1，CYC1终止子序列GenBank登录号为EF210198.1。通过基因工程手段在酵母的HO整合载体（NCBI：#AF324728，美国Utah大学David J.Stillman惠赠；Nucleic acids research,2001,29:e59）的基础上连接PGK1强启动子和CYC1终止子构成pHO组成型表达载体（Applied Energy,2012,110：33-40）。然后把PCR扩增获得的YHB1基因连接在PGK1启动子和CYC1终止子之间，线性化后电转导入工业酿酒酵母4126中，进行插入基因的过表达。 

本发明采用酿酒酵母的pHO组成型表达载体进行重组菌株的整合表达，pHO载体可以通过同源重组的方式在酿酒酵母的HO位点进行整合表达，该载体含有遗传霉素G418抗性标记可进行筛选。 

本发明的有益成果是：本发明的重组酿酒酵母4126-YHB1能在培养基中含有高浓度乙酸的条件下进行快速高效的乙醇发酵，在进行纤维素乙醇发酵时，可节省调整pH的步骤，直接在较低pH条件下和较高乙酸存在条件下进行乙醇发酵。 

附图说明

图1是YHB1基因片段的PCR扩增。 

图2是载体的酶切验证。 

图3是重组酵母的PCR鉴定。 

图4是含空载体的对照酵母菌株4126-HO和重组酿酒酵母4126-YHB1在含有乙醇和乙酸的固体平板上的生长比较。 

图5是对照酵母4126-HO和重组酿酒酵母4126-YHB1在含有5g/L乙酸的液体培养基中的生长结果。 

图6是对照酵母4126-HO和重组酿酒酵母4126-YHB1在含有5g/L乙酸的液体培养基中的乙醇发酵结果。 

具体实施方式

实施例1：过表达黄素血红蛋白基因YHB1的重组酿酒酵母的构建和转化 

本发明涉及的黄素血红蛋白基因YHB1序列来自于NCBI公共数据库，该基因的GenBank登录号为NC_001139。基因的启动子用PGK1启动子，用CYC1终止子作为终止子，通过酶切连接的方式在PGK1启动子和CYC1终止子之间插入YHB1基因。然后通过酶切位点Not I把构建的质粒酶切成线性，转化到工业酿酒酵母4126中表达。 

1.1酿酒酵母基因组DNA提取 

（1）将过夜培养的酵母菌液离心，12000rpm，2min，去上清； 

（2）向沉淀加入480μL TE溶液（pH8.0），20μL溶菌酶（2mg/mL），震荡混匀后放入37℃摇床1.5小时； 

（3）加入适量RNase A，再次放入37℃摇床0.5小时； 

（4）从摇床中拿出，加入50μL20%SDS溶液，5μL蛋白酶K（浓度为20μg/mL）混合震荡，55℃水浴锅中放置1h以上； 

（5）离心将管盖上附着的液体收集到管底；加入500μL苯酚：氯仿：乙戊醇（25:24:1），震荡混匀后，12000rpm离心10分钟，取上清液，转新管； 

（6）加入等体积异丙醇，放入-20℃冰箱1小时以上，沉淀DNA； 

（7）12000rpm离心10分钟，去上清液，加入1mL70%乙醇，洗沉淀1—2次，12000rpm离心8分钟，弃上清； 

（8）37℃干燥后加入TE（pH8.0）50μL溶解DNA，-20℃保存备用。 

1.2PCR扩增目标基因条带 

以S.cerevisiae S288c基因组DNA作为模板扩增基因YHB1。引物序列如下： 

PCR反应体系如下（25μL）： 

PCR反应程序设置： 

PCR结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳检测片断大小是否符合。 

1.3目标片段酶切 

将PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，然后酶切。酶切反应体系如下： 

37℃温育反应2h。 

凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段，-20℃冻存备用。 

1.4与载体连接（25μL） 

将制备好的目的片段与酶切回收后的载体进行连接。 

反应体系如下： 

在连接仪中反应时间2-8小时，反应温度为16℃ 

1.5连接产物在大肠杆菌DH5α中转化 

1.5.1大肠杆菌感受态细胞制备 

（1）接种大肠杆菌DH5α于10mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜； 

（2）按1:100的比例转接过夜培养的菌液至50mL新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm培养3-4h，至OD₆₀₀约等于0.6； 

（3）将菌液转入在冰上预冷的50mL离心管中，冰上放置30min,4℃,4000rpm离心5min； 

（4）弃上清，用预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液15mL悬浮细胞，冰上放置30min，4℃，4000rpm离心5min； 

（5）重复上述步骤； 

（6）用预冷的0.1mol/L CaCl2溶液2mL悬浮细胞，加入2mL预冷的30%甘油，轻轻混匀，分装成200μL的小份，-76℃冻存。 

1.5.2连接产物的转化 

（1）从-76℃冰箱中取200μL感受态细胞，冰上融化； 

（2）将10μL连接产物加入感受态细胞中，用移液枪轻轻混匀，冰上放置30min； 

（3）将感受态细胞置于42℃水浴锅中热激90秒，然后迅速置于冰浴中冷却2min； 

（4）向管中加入800μL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1小时； 

（5）4000rpm离心5min，去上清，将剩余溶液涂布于含相应抗生素的筛选平板上（氨苄青霉素终浓度100mg/mL），正面向上放置半小时，待菌液完全晾干后倒置培养皿，37℃培养12-16小时； 

（6）挑菌落进行鉴定。 

1.5.3转化子质粒提取（所用溶液配制方法来源于Takara（大连）网站） 

（1）挑取转化平板上的克隆到添加有相应抗生素（氨苄青霉素终浓度100mg/mL）的新鲜LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜； 

（2）取3ml菌液于l.5mL Eppendof管中，12000rpm离心l min，弃上清，收集沉淀菌体； 

（3）将沉淀重悬于100μL冰上预冷的溶液Solution I中，涡旋震荡； 

（4）加入200μl Solution II,轻轻颠倒离心管5次，使溶液混匀； 

（5）加入150μL冰上预冷的溶液Solution III，上下颠倒数次，将离心管置于冰上，放置5min； 

（6）4℃，12000rpm离心10min，留上清； 

（7）加入等体积（约500μl）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），充分震荡，12000rpm离心10min，将上清转移到新管中； 

（8）加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒充分混匀，于-20℃放置30min， 12000rpm离心10min，弃上清； 

（9）用1mL70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min，去除上清液，可以再重复一遍该洗涤过程，然后放置在室温中挥发剩余酒精； 

（10）加入适量含有RNaseA的蒸馏水或TE溶液溶解质粒DNA，37℃消化，-20℃冻存或直接用于后续实验。 

1.5.4PCR鉴定转化子 

将提取的质粒进行PCR反应，以验证转化子。 

验证引物如下： 

PCR反应体系如下（25μL）： 

PCR反应程序设置： 

PCR结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳检测片断大小是否符合。 

1.6重组质粒的线性化 

因为重组质粒需要线性化后才能转入酵母中，进行整合表达，所以用Not I酶切对质粒进行酶切。酶切反应体系如下： 

37℃温育反应2h。 

凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段，-20℃冻存备用。 

实施例2：含黄素血红蛋白YHB1基因的工业酿酒酵母的转化 

酿酒酵母细胞转化方法如下： 

2.1酿酒酵母电转化感受态细胞的制备 

（1）酵母接种YPD培养基，30℃，150rpm培养12-14小时，然后转接新的YPD培养基（1%接种）过夜培养； 

（2）次日，将培养瓶放在冰上至少15min，让菌停止生长。将50mL离心管，超纯水，1M的山梨醇溶液都放在冰上预冷，处于低温状态； 

（3）离心收集菌体，用等体积的超纯水将菌体轻轻混匀（上下颠倒晃动，不要 用移液枪吹打），3000g，5min，4℃离心收集菌体，弃上清，重复此步骤两次； 

（4）用20mL预冷的1M山梨醇溶液清洗菌体沉淀2次，最后一次用0.5mL，1M山梨醇溶液重悬酵母细胞，即为酵母感受态细胞。 

2.2电转法获得转化子 

(1)将感受态细胞分装至1.5ml EP离心管中，加入3-5μL线性化质粒，用移液枪轻轻混匀，放置冰上； 

(2)将40ul感受态细胞和线性化质粒混合液加入0.2的电转杯中，冰浴5-10分钟； 

(3)设置酵母参数“fungi”，“Sc02”，点击Pulse； 

(4)取出电转杯，迅速加入1ml冰浴的山梨醇，用枪轻轻吹打，再转移至5ml灭菌离心管中，30℃静置，孵育5h； 

（5）3000g离心5分钟； 

（6）浓缩，涂布含有300μg/ml的YPD-G418平板； 

（7）将平板于30℃培养箱培养，至酵母转化子克隆长出； 

（8）随机挑取12个菌落重新培养在YPD液体培养基中（含100μg/ml的G418抗生素），然后提基因组DNA，PCR验证基因的整合情况。 

结果见图3。 

实施例3：重组酿酒酵母4126-YHB1在不同胁迫因素下的平板生长比较 

（1）把含有空载体的重组酵母对照菌株4126-HO和重组酿酒酵母4126-YHB1接种到含有50mL种子培养基（20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉）的250mL摇瓶中，30℃，150转/分，过夜培养； 

（2）重复步骤（1）； 

（3）分别取菌液，测其在620nm处吸光值OD，然后用种子培养基调节OD都为0.3，以10%的接种量分别接种到种子培养基中（同步骤（1）），培养5h； 

（4）分别取菌液，测其在620nm处吸光值OD，此时OD值都在1.2左右，用灭菌后的蒸馏水调节OD值至相同； 

（5）对调节后的菌液按10倍梯度稀释； 

（6）2μl点样于浓度分别为4.5g/L、5g/L乙酸及8%乙醇的YPD平板上（20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，20g/L琼脂粉）； 

（7）于30℃培养箱中静置培养，待菌落长出后观察对比并拍照。 

结果见图4。 

结果：图4中结果可以得出4126-YHB1与4126-HO在普通YPD中生长状况无差异，说明过表达YHB1基因不会影响菌株的正常生长。4126-YHB1菌株与4126-HO菌株在8%乙醇培养基中生长状况也基本无差异，说明过表达YHB1基因不影响菌株的乙醇耐受性。但4126-YHB1菌株与4126-HO菌株在含有4.5g/L及5g/L乙酸的固体培养基中生长均明显好于对照菌株4126-HO菌株，说明过表达YHB1基因提高了菌株对乙酸的耐受性。 

实施例4：含空载体的对照酵母4126-HO和重组酿酒酵母4126-YHB1在含有5g/L乙酸培养基中的发酵比较 

为了验证重组酿酒酵母的发酵性能，考察了重组菌在含有高浓度乙酸的发酵培养基的发酵性能。 

（1）把对照酵母菌株4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-YHB1接种到含有50mL种子培养基（20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉）的250mL摇瓶中，30℃，150转/分，过夜培养； 

（2）重复步骤（1）； 

（3）分别取菌液，测其在620nm处吸光值OD，然后用种子培养基调节OD都为0.3，以10%的接种量分别接种到种子培养基中（同步骤（1）），培养5h； 

（4）分别取菌液，测其在620nm处吸光值OD，此时OD值都在1.2左右，用灭菌后的蒸馏水调节OD值至相同； 

（5）以10%的接种量接种到发酵培养基（100g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，添加5g/L乙酸），在30℃，150转/分的条件下进行发酵比较。 

在相同的时间对空载酵母4126-HO和重组酿酒酵母4126-YHB1取样，分别取部分菌液用酶标仪测定吸光值来确定菌体的含量（图5）；剩余的菌液离心后取上清液通过高效液相色谱检测剩余葡萄糖和乙醇的含量（图6），当上清液中葡萄糖的浓度低于1g/L时定义为发酵结束。 

结果：由图5可以看出，随着发酵的进行，从12h开始，过表达菌株4126-YHB1的OD值快速增加，在70小时时4126-YHB1菌株生长的OD值为4126-HO菌株的2倍，说明过表达菌株4126-YHB1在含有5g/L乙酸的发酵培养基中菌体生长远好于含有空载体的对照菌株4126-HO。 

由图6中可以看出，过表达菌株4126-YHB1葡萄糖的消耗速度及乙醇产率均高于空载菌株4126-HO，在发酵58小时时，过表达菌株4126-YHB1已经消耗掉所有的葡萄糖，而对照菌株4126-HO葡萄糖的消耗量仅仅不到一半。这些结果说明过表达黄素血红蛋白编码基因YHB1的菌株4126-YHB1具有较高的乙酸耐受性。