一种以vtaA9 基因为靶点的引物组及其在副猪嗜血杆菌鉴别和诊断中的应用

摘要

本发明公开了一种以vtaA9基因为靶点的引物组及其在副猪嗜血杆菌鉴别和诊断中的应用。本发明通过研究发现以vtaA9基因为靶点的PCR方法能够精确地区分具有不同致病力，同时定居于猪上呼吸道的H.parasuis和其相似的菌株A.indolicus，A.minor和A.porcinus。此外，本发明基于vtaA9基因序列，设计并合成了特异性引物，所述的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示。特异性实验表明，通过本发明的方法能够100%的完全区分H.parasuis和A.indolicus，A.minor和A.porcinus。敏感性实验表明，使用本发明的方法可以检测到不低于20CFU/ml和5pg/μl的基因组DNA。另外，以vtaA9为靶点的PCR方法对临床样品的阳性结果高于菌株的分离培养和经典的16S rRNA PCR方法。本发明的提出为副猪嗜血杆菌的鉴别诊断和流行病学监测提供了一种新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于鉴别和诊断副猪嗜血杆菌的新靶点以及基于该靶点的特 异性引物组，特别涉及一种以vtaA9基因为靶点的，用于鉴别和诊断副猪嗜血杆菌 的引物组及其在制备鉴别和诊断副猪嗜血杆菌的试剂中的应用。本发明属于副猪嗜 血杆菌的检测领域。

背景技术

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）是NAD（Nicotinamide Adenine  Dinucleotide）依赖性Pasteurellaceae家族中的一员，可以引发猪的疾病， 以发生浆膜炎、腹膜炎和脑膜炎等全身症状为特征。该疾病的诊断通常依赖临床症 状、剖检变化和病原菌分离综合性的诊断。由于临床混合感染和抗生素药物的治疗 致使临床症状复杂，病原菌的分离培养难度大大增加。尤其，具有不同致病性并定 居于猪上呼吸道的相似菌群吲哚放线杆菌（A.indolicus），猪放线杆菌（A.porcinus） 和小放线杆菌（A.minor），更加扰乱了H.parasuis精确诊断的过程。

为提高H.parasuis检测的准确性和敏感性，需要建立H.parasuis的分子生物学 诊断方法。2001年Oliveria在16S rRNA基因的基础上建立了经典PCR方法，从临 床样品检测中评估了该方法的有效性，并表明该方法敏感性高于传统的细菌培养分 离法，但是不能区分同样来源于猪上呼吸道的相似菌株A.indolicus，这是因为此段 基因序列的相似性与A.indolicus的达到97.4-97.7%。为了克服这个问题，2007年 Angen采用3个特异性引物改进了PCR方法，特异性增强的同时敏感性却下降10 倍。2009年Tumi利用real-time PCR进行检测H.parasuis，但是仍然存在与Pasturella  mairii菌株发生非特异性反应的问题。发展和改善检测H.parasuis PCR方法的同时， 研究者对检测目的基因也进行了替换，如ABC，hsp60，aroA，infB等。虽然这些 基因具有一定程度的特异性，但是非特异性反应和与其他种属基因的相似性，到目 前为止尚未解决。然而，利用特异性基因精确区分相似菌在Straptococcus和 Heamophilus种属中已有报道。在此情况下，在PCR方法的基础上选择唯一并特异 性的基因作为靶点去检测H.parasuis是我们需要解决的问题。

H.parasuis基因组中拥有毒力相关的三聚合转座子（Virulence-associated  Trimericautotans,VtaA）。VtaA属于多拷贝基因，13个拷贝的VtaA在H.parasuis 基因组中已被鉴定，并且依据他们转座结构域的不同分为三组，其中，group3具有 种特异性。另外VtaA家族中VtaA8和VtaA9结构功能特性已有报道。但是利用vtaA 基因作为唯一特异性基因区分H.parasuis和相关菌株，还没有报道。

本发明利用VtaA多基因家族中一个拷贝vtaA9基因作为特异性基因，基于vtaA9 基因的保守性，采用PCR方法证明该基因在检测H.parasuis中的特异性和敏感性。 结果表明vtaA9是一种可靠的临床诊断标记，vtaA9作为鉴别诊断基因相对其他的 检测基因具有敏感、特异、可靠等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种可用于副猪嗜血杆菌诊断和鉴别的 临床诊断标记。

本发明所要解决的技术问题之二是以该临床诊断标记为靶点设计并合成特异性 引物组，该引物组能够特异性的检测副猪嗜血杆菌（H.parasuis）菌株，而对于其 他任何一株非副猪嗜血杆菌菌株都无法得到特异性扩增，尤其可以区分副猪嗜血杆 菌（H.parasuis）菌株与其相似菌株，例如吲哚放线杆菌（A.indolicus），猪放线杆 菌（A.porcinus）和小放线杆菌（A.minor）。

本发明所要解决的技术问题之三是提供一种利用所述的引物组进行副猪嗜血杆 菌诊断和鉴别的方法。

本发明所要解决的技术问题之四是提供所述引物在制备鉴别、诊断或检测副猪 嗜血杆菌的试剂中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

本发明通过筛选得到了作为多基因VtaA家族中一员vtaA9基因片段，并且根 据vtaA9基因的C端的部分序列进行了引物的设计。利用合成的特异性引物建立了 以vtaA9为检测靶点的PCR方法，通过对15株副猪嗜血杆菌标准菌株以及24株 非副猪嗜血杆菌（包括A.minor,A.indolicus以及A.porcinus.）进行检测，结果表明 所述的引物组能够实现对15株副猪嗜血杆菌标准菌株的特异性扩增，但是对于24 株非副猪嗜血杆菌均没有得到特异性PCR产物，说明本发明的方法具有100%的特 异性。

为了更好的确定PCR产物的特异性，本发明对vtaA9基因的PCR产物进行了 测序。基于15株标准菌株vtaA9PCR产物的序列分析和比对，显示出15个PCR产 物的基因序列之间同源性高于97%。此序列没有在非副猪嗜血杆菌中（包括A. minor,A.indolicus and A.porcinus.）发现，说明vtaA9基因完全不存在于其他的相似 菌株基因组内部。因此，可作为用于副猪嗜血杆菌诊断和鉴别的特异性临床诊断标 记。

敏感性实验表明，使用本发明的方法可以检测到不低于20CFU/ml的细菌数和 5pg/μl的基因组DNA。

因此，本发明提出了以vtaA9基因为靶点的引物组在制备检测、鉴别或诊断副 猪嗜血杆菌的试剂中的应用。

在本发明中，优选的，所述的引物组是以vtaA9基因的C端序列为靶点进行扩 增的。

更优选的，所述的引物组包括一条正向引物和一条反向引物，其中所述的正向 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID  NO.2所示。

本发明的一种以vtaA9基因为靶点的，用于副猪嗜血杆菌检测的引物组，其特 征在于包括一条正向引物和一条反向引物，其中所述的正向引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

相较于现有技术，本发明具有以下优点：

1、本发明建立了以vtaA9为靶点的，用于副猪嗜血杆菌鉴别和诊断的引物组 及PCR方法。特异性和敏感性实验证明通过对vtaA9基因进行特异性扩增能够区 分副猪嗜血杆菌（H.parasuis）菌株与吲哚放线杆菌（A.indolicus），猪放线杆菌（A. porcinus）和小放线杆菌（A.minor）。

2、本发明所建立的以VtaA9基因为靶点PCR方法具有能够对不同部位的临床 样品进行H.parasuis检测的优点。

3、副猪嗜血杆菌很容易在体质弱小的猪鼻腔中发现，本发明所建立的以VtaA9 基因为靶点的PCR方法与A.indoulicus以及A.pocinus不存在非特异性反应，因此 可以用于对鼻拭子的检测。而现有的方法以16s rRNA为靶点进行PCR检测，由于 存在非特异性反应，所以在活体动物检测中是受到限制的。本发明所建立的以vtaA9 基因为靶点的PCR方法可以检测到不低于20CFU/ml的细菌数和5pg/μl的基因组 DNA，vtaA9基因的特异性致使通过鼻拭子检测的准确性高于以16S rRNA为靶点 的PCR方法。

综合上述结果，本发明所建立的以vtaA9基因为靶点的PCR方法，以其敏感、 特异和可靠性完全可以作为副猪嗜血杆菌感染的替代的诊断方法。同时vtaA9基因 作为种属特异性基因可以区分相似菌株。同样可以从临床病料中进行检测，拥有广 阔的实验室应用前景。从长远来看，以vtaA9基因作为副猪嗜血杆菌感染的鉴别和 诊断的标记基因，能够为疾病的监测和预防治疗提供诊断的新策略。

附图说明

图1为评估以vtaA9为靶点的检测副猪嗜血杆菌的PCR方法的敏感性和特异性 实验结果；

图1A为从15个副猪嗜血杆菌参考株（泳道1-15，1-15血清型）、Actinobacillus  indolicus,以及Actinobacillus minor中进行vtaA9扩增的结果；图1B为使用副猪嗜 血杆菌血清5型进行vtaA9PCR（右图）以及16S rRNA PCR（左图）敏感性实验的 对比结果，数字代表每个PCR反应的菌落数（2×CFU/ml）；图1C为使用副猪嗜血 杆菌血清5型进行vtaA9PCR（右图）以及16S rRNA PCR（左图）敏感性实验的对 比结果，数字表示每个PCR反应的基因组浓度，范围从10⁰-10^-6代表基因组浓度 500ng/μl-0.5pg/μl；“-”为在每个实验之内的不包括DNA的阴性PCR对照；泳道 M为DL2000DNA marker（分子量从上到下依次为：2000bp，1000bp，750bp，500 bp，250bp和100bp；-：阴性PCR对照）

图2A-D为vtaA家族基因的多序列比对结果，其中用于扩增vtaA9基因的引物 以黑色方框标出。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1以vtaA9基因为靶点进行副猪嗜血杆菌鉴别和诊断的PCR方法的建立 及敏感性和特异性分析

1、样本材料

本发明样品中包括15株H.parasuis参考菌株，见表1，24株非H.parasuis菌株， 以及10个相关菌株的纯化基因组DNA，见表2。同时，对临床疑似H.parasuis感 染的病料取1.0g样品加入500μl的PBS缓冲液进行研磨后直接进行菌种的分离和 PCR的检测。

表1.应用于本发明中的H.parasuis参考菌株

表2应用于本发明中的非H.parasuis菌株

由病料中分离得到的H.parasuis生长在固体TSA（Trypticase Soy Agar）和液 体TSB（Trypticase Soy Broth）培养基中，并补充添加NAD(10μg/ml)和5%(V/V) 的灭活马血清进行37℃培养24-36h。H.parasuis生化鉴定试验参照 Kielstein(2001)。同时对每个实验菌株都进行全长16S rDNA(1600bp)的进化树分 析，进一步补充确定为H.parasuis种(Kielstein，2001)。

2、方法

2.1、PCR产物的扩增

基于vtaA9基因(GenBank Accession Number:ADZ54070.1)的C端序列，设计特 异性引物vtaA9-正向（F）以及vtaA9-反向引物（R），预计扩增产物大小477bp。 同时合成用于16S rRNA PCR扩增的引物，表3所示：

表3引物序列及其所对应的PCR扩增条件

2.2、vtaA9PCR的特异性分析

采用表1和表2中所有的菌株验证vtaA9PCR的特异性。分别从培养基中挑取 各菌株单克隆菌落于20μl蒸馏水体系中，煮沸10min，取1μl作为模板按照以上 所述的PCR产物的扩增条件进行PCR反应。

2.3、vtaA9PCR的敏感性分析

为了评估vtaA9PCR敏感性，分别以基因组DNA和菌落数的梯度稀释做为PCR 反应模板。以H.parasuis血清5型参考株Nagasaki进行vtaA9PCR敏感性实验。

基因组DNA：提取基因组DNA参见John Wiley and Sons(2003)方法。将基因 组DNA进行10倍梯度稀释，浓度范围500ng/μl至0.5pg/μl，进行PCR反应的扩 增。

菌落数的稀释：收集2×10⁷CFU/ml菌落数，10倍梯度稀释后菌落数范围在2×10⁷至2×10CFU/ml。每个实验进行三次重复。

2.4、vtaA9基因的测序

特异性引物扩增vtaA9基因，纯化PCR产物后送至英俊测序公司进行基因测序。 序列分析在(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行。序列比对和进化树分析利用DNA STAR软件包，序列比对结果如图2所示。

3、结果

3.1、vtaA9基因片段的分析

为了确定vtaA9基因在H.parasuis中的保守性，对15株参考菌株的vtaA9基 因进行了序列测定，然后在NCBI数据库中进行分析和比对。结果显示15个基因序 列的一致性为97-99%，表现出vtaA9基因序列在该区域内的高度保守性。另外，在 4株H.parasuis临床分离株中扩增的vtaA9基因产物同样保持98%的一致性。 BLAST搜索比对表明，vtaA9基因没有和其他的非H.parasuis相似菌株A. indolicus，A.porcinus和A.minor基因组中任何基因匹配。

3.2、vtaA9PCR的特异性分析

为了评估vtaA9基因的特异性，对15株副猪嗜血杆菌参考株（1-15血清型） 和24株非H.parasuis的煮沸基因组DNA以及10个相关菌株的纯化基因组DNA 进行PCR扩增。在70min PCR反应后，在15株的H.parasuis的分离株中扩增得 到了预期的477bp的PCR产物，条带扩增明显。而对于24株非H.parasuis以及 10个相关菌株的纯化基因组DNA，没有任何一株菌株得到特异性扩增，特别是A. indolicus,A.porcinus以及A.minor。结果如图1A、表2所示。

不同的是，利用16s rRNA（821bp）作为PCR靶标检测，在A.indolicus中出 现非特异性的PCR产物条带，见表2。

因此，这里指出，vtaA9基因具有100%特异性，能够检测H.parasuis菌株， 尤其可以区分相似的菌株A.indolicus、A.porcinus以及A.minor。

3.3、vtaA9PCR的敏感性分析

以细菌培养物2.0×10⁷CFU/ml作为原始浓度，进行10倍梯度稀释后分别添加 到每个PCR反应体系中。以一系列细菌培养物稀释物作为PCR模板，vtaA9PCR 实验阳性反应的检测下限为20CFU/ml。进一步我们利用纯化的基因组DNA验证 PCR方法的敏感性。基因组DNA浓度范围从500ng/μl-5pg/μl，PCR反应均为阳 性，最小检测基因组浓度为5pg/μl。实验结果显示，随着基因组DNA浓度的降低， PCR产物的亮度也随之降低，直至低于5pg/μl,没有出现特异性的PCR条带。每个 实验分别进行三次重复。

利用H.parasuis serovar5Nagasaki细菌培养物比较，16S rRNA以及vtaA9两 种PCR方法的敏感性和特异性，结果如图1B和1C。结果表明：以纯化的基因组 DNA和菌落为模板的PCR反应体系中，利用vtaA9基因敏感性相对于16S rRNA 均高出10倍。

实施例2以vtaA9为靶点的PCR方法在副猪嗜血杆菌鉴别和诊断中的应用

为了进一步描述本发明的以vtaA9为靶点检测副猪嗜血杆菌临床样品的可靠 性。本发明收集2008年至2011年感染副猪嗜血杆菌（H.parasuis）的53头猪的121 份临床样品。样品采集不同的组织和器官，包括关节液、鼻拭子，心脏，肺脏，胸 腔积液，病料立即送往实验室进行细菌分离培养。同时，取1.0g样品加入500μl 的PBS缓冲液进行研磨后直接进行PCR的检测。

121份样品中90份和88份样品分别利用vtaA9PCR和16S rRNA PCR检测为 阳性，阳性比例分别为74.4%和72%，其中121份样品中83份细菌分离培养结果为 阳性，分离率为68.6%，结果如表4所示。

表4利用细菌分离培养以及PCR方法对样本进行分析的结果

以上结果表明：VtaA9PCR敏感性高于16S rRNA PCR方法和细菌分离法，分 别高出2%和6%。细菌分离培养为阳性结果的，两种PCR方法检测结果均为阳性。

实施例3通过vtaA9基因分离得到的临床分离株的鉴定与分型

实施例2中利用vtaA9PCR方法检测并分离到90株H.parasuis临床分离株， 他们具有典型的H.parasuis特性，利用生物化学反应揭示出90株临床分离株为 NAD依赖性型，无溶血现象，urease利用阴性，catalase阳性与Kielstein et al.(2001) 结果一致。90株H.parasuis临床分离株表现出分离部位不同，分离率也不同，肺 脏分离率(n=34;37.8%)，胸腔积液分离率(n=14;15.6%)，心脏分离率(n=13;14.4%)， 关节液分离率(n=10;11.1%)，气管分离率(n=8,8.9%)，脑部分离率(n=6;6.7%)，鼻腔 分离率(n=4;4.4%)，扁桃体分离率(n=1;1.1%)。与Nedbalcova(2006)结果相似，在胸 腔积液，关节液和脑部分离培养的成功率比较高的，扁桃体分离率比较低。分离株 采用Indirect Hemagglutination Test(IHA)方法进行血清分型鉴定，其中血清型4 (n=1,1.1%),血清型5(n=19,21.1%)以及血清型13(n=19,21.1%),血清型 14(n=15,16.7%),不可分性菌株(n=36,40%)，与cai（2008）的报道是一致的，中 国部分地区主要流行的H.parasuis的血清型为4型，5型，13型，14型，其他为不 能确定血清型的分离菌株。