具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶AgaAJB07及其基因、重组载体、重组菌株

摘要

本发明公开了一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶AgaAJB07及其基因、重组载体、重组菌株。本发明提供了一种来源于中生根瘤菌（Mesorhizobium sp.）的α-半乳糖苷酶AgaAJB07，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了上述α-半乳糖苷酶的编码基因agaAJB07，α-半乳糖苷酶基因agaAJB07的重组载体和α-半乳糖苷酶基因agaAJB07的重组菌株。本发明的α-半乳糖苷酶具有以下性质：最适pH6.5；经0.2M pH7.0–9.0缓冲液在37℃下处理1h，仍能保持75%以上的活性；最适温度45℃；在37℃及50℃下稳定；可水解密二糖、棉籽糖及水苏糖；具有转糖基活性，可催化密二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖及木糖的转糖基反应。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种具有转糖基活性的α-半乳 糖苷酶AgaAJB07及其基因、重组载体、重组菌株。

背景技术

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，EC3.2.1.22）又叫密二糖酶（melibiase），可 催化水解密二糖、棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖底物及半乳甘露聚糖等多 聚糖底物中的α-半乳糖苷键。α-半乳糖苷酶可应用于饲料、食品和医疗等行业中。 在饲料行业中，α-半乳糖苷酶制剂可促进动物对营养物质的消化，提高饲料利用 率；在食品行业中，α-半乳糖苷酶制剂可以减少棉籽糖等在豆奶中的含量，增加 人类对豆类营养的吸收；在医疗行业中，α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O 型红细胞及治疗Fabry疾病等（Zhou et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2010,88: 1297–1309）。

某些α-半乳糖苷酶还具有转半乳糖基作用，以pNPG （p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside）和密二糖为半乳糖基供体，以pNPG、单 糖、二糖以及低聚糖（如麦芽低聚糖、纤维素低聚糖和甘露低聚糖等）作受体， 将半乳糖基团专一地以α-1,6或α-1,4糖苷键转移到受体上，形成α-半乳糖苷低 聚糖（如水苏糖和α-半乳糖基-β-环糊精），从而应用于食品和医疗等行业中（Nakai  et al.,FEBS J,2010,277:3538–3551）。已发现的具有转半乳糖基作用的α-半乳糖 苷酶多来源于霉菌，不同α-半乳糖苷酶催化糖苷键水解、转半乳糖基的速率及受 体专一性均存在差异（郝桂娟等，中国畜牧兽医，2013，40：149–154）。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶AgaAJB07。

本发明的再一目的是提供编码上述α-半乳糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述α-半乳糖苷酶AgaAJB07可得自中生根瘤菌（Mesorhizobium  sp.）。AgaAJB07的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的α-半乳糖苷酶AgaAJB07总共含721个氨基酸，理论分子量为 78.8kDa。该酶的最适pH值为6.5，在pH6.0–7.5的范围内维持45%以上的酶活 性；经pH7.0–9.0的缓冲液处理1h，该酶酶活剩余达75%以上；该酶最适温度为 45℃；在37℃及50℃下稳定，在60℃时半衰期小于10min；在pH6.5及45℃下， 该酶对2mM pNPG（p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside）的比活为15.9±0.2U  mg^-1，对0.5%（w/v）的密二糖（melibiose）、棉籽糖（raffinose）和水苏糖（stachyose） 的比活分别为11.7±0.3、0.07±0.01和0.03±0.004U mg^-1。

本发明提供了编码上述α-半乳糖苷酶的基因agaAJB07，该基因序列如SEQ  ID NO.2所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了α-半乳糖苷酶AgaAJB07的编码基因 agaAJB07，其全长2166bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经BLAST比 对，该α-半乳糖苷酶AgaAJB07与GenBank中Rhodobacter sp.SW2来源的潜在 α-半乳糖苷酶（EEW27035）具有最高的一致性，为51.6%；与确证活性的 Pseudoalteromonas sp.KMM701来源α-半乳糖苷酶（ABF72189）的一致性为 37.3%。说明α-半乳糖苷酶AgaAJB07是一种新的α-半乳糖苷酶。

本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因agaAJB07的重组载体，优选为 pEasy-E2-agaAJB07。将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到表达载体中，使其核 苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发 明的α-半乳糖苷酶基因和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大 肠杆菌表达质粒pEasy-E2-agaAJB07。

本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因agaAJB07的重组菌株，优选所 述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株 BL21(DE3)/agaAJB07。

本发明制备α-半乳糖苷酶AgaAJB07的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶表达；

3）回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶AgaAJB07。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转 化大肠杆菌细胞BL21（DE3），得到重组菌株BL21(DE3)/agaAJB07。

本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶最适 pH6.5；经0.2M pH7.0–9.0缓冲液在37℃下处理1h，仍能保持75%以上的活性； 最适温度45℃；在37℃及50℃下稳定；可水解密二糖、棉籽糖及水苏糖；具有 转糖基活性，可催化密二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖及木糖的转糖基反应。该 酶可应用于食品及医疗行业。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的SDS-PAGE分析， 其中，M：蛋白质Marker；1和2：含有重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的大肠杆 菌菌体破碎上清液；3：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07。

图2：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的pH活性。

图3：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的pH稳定性。

图4：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的热活性。

图5：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的热稳定性。

图6：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07对不同底物的转糖基产物分析， 其中，CK-Mel，CK-Man，CK-Gal，CK-Glu，CK-Xyl：分别是在400mM密二 糖、400mM甘露糖及40mM pNPG、400mM半乳糖及40mM pNPG、400mM葡 萄糖及40mM pNPG、400mM木糖及40mM pNPG底物中加入失活的AgaAJB07 （95℃下处理10min）；S-Mel：以400mM密二糖为转糖基的供体和受体进行反 应；S-Man，S-Gal，S-Glu，S-Xyl：分别以400mM甘露糖、半乳糖、葡萄糖、 木糖为转糖基的受体，以40mM pNPG为转糖基的供体进行反应。pNPG： p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，Suc：蔗糖，Mel：密二糖（melibiose），Raf： 棉籽糖（raffinose），Sta：水苏糖（stachyose），Gal：半乳糖，Glu：葡萄糖，Man： 甘露糖，Xyl：木糖，Mel^T：密二糖转糖基产物，Gal^T：半乳糖转糖基产物，Glu^T： 葡萄糖转糖基产物，Man^T：甘露糖转糖基产物，Xyl^T：木糖转糖基产物。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：中生根瘤菌（Mesorhizobium sp.）同文献报道菌种性质，如 中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株Mesorhizobium loti CGMCC1.2559；DNA 聚合酶、dNTP及pMD18-T载体购自TaKaRa公司，大肠杆菌Escherichia coli  BL21（DE3）和表达载体pEasy-E2购自北京全式金生物技术有限公司。

2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶、dNTP和pMD18-T载体购自TaKaRa 公司；pNP（p-nitrophenol）、pNPG（p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside）、半乳 糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、蔗糖、密二糖（melibiose）购自Sigma公司； 棉籽糖（raffinose）购自美国Amresco公司；水苏糖（stachyose）购自日本东京 化成工业株式会社（TCI）；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买 得到）。

3、培养基：

LB培养基：Peptone10g，Yeast extract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000ml， pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克 隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试 剂盒和产品说明书进行。

实施例1：α-半乳糖苷酶基因agaAJB07的克隆

提取中生根瘤菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL 溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM  EDTA，Nacl500mM，2%SDS（w/v），pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min 混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白， 再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。 弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃ 备用。

表1.α-半乳糖苷酶基因agaAJB07的克隆与表达引物

根据糖苷水解酶第36家族的保守序列（[F/L/V]-[L/V]-[L/M/V]-D-D-G-W-F 和E-P-E-M-[V/I]-[N/S]-[P/E]）合成了简并引物GH36F和GH36R（表1）。以中 生根瘤菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然 后94℃变性30sec，43℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。 PCR结果得到一约184bp片段，将该片段回收后与pMD18-T载体相连，然后送 北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计热不对称交错PCR（简称TAIL-PCR）上 游特异性引物2条，并将它们分别命名为usp1和usp2；另设计下游特异性引物 4条，并将它们分别命名为dsp1、dsp2、dsp3、dsp4（表1）。以中生根瘤菌基因 组DNA为模板，通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，TAIL-PCR反应参 数参照文献设置（Zhou JP et al.,Appl Biochem Biotech2010, 160:1277–1292），特异性引物退火温度为67℃。扩增产物送北京六合华大基因 科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到 α-半乳糖苷酶基因agaAJB07，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的制备

以agaAJB07F和agaAJB07R为引物对（表1），中生根瘤菌基因组DNA为 模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec， 70℃退火30sec，72℃延伸2min30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR结果 得到α-半乳糖苷酶基因agaAJB07，并在该基因3’端引入突出的A碱基。将α- 半乳糖苷酶基因agaAJB07和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，获得含 有agaAJB07重组表达质粒pEasy-E2-agaAJB07。将pEasy-E2-agaAJB07转化大 肠杆菌BL21（DE3），获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/agaAJB07。

取含有重组质粒pEasy-E2-agaAJB07的重组大肠杆菌菌株 BL21(DE3)/agaAJB07，以0.1%的接种量接种于LB（含100μg mL^-1Amp）培养 液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含 100μg mL^-1Amp）培养液中，快速振荡培养约2–3h（OD600达到0.6–1.0）后， 加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡 培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0Tris-HCl缓冲液悬 浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm 离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0–500mM的咪唑分别亲和 和纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07 在大肠杆菌中得到了表达，经纯化后，产物为单一条带。

实施例3：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的性质测定

1、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的活性分析

实施例2纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的活性测定方法采用pNPG 法：将pNPG溶于0.2M缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL适量 酶液，450μL的2mM底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液再反应 10min，然后加2.0mL1M Na₂CO₃终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定 释放出的pNP；1个酶活单位（U）定义为每分钟分解pNPG产生1μmol pNP所 需的酶量。对底物棉籽糖和水苏糖的活性测定方法采用DNS法：将底物溶于0.2M 缓冲液中，使其终浓度为0.5%；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物 在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应适当时间，然后加2.0mL DNS终 止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单 位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖（以半乳糖计） 所需的酶量。对底物密二糖的活性测定方法采用葡萄糖氧化酶法：将底物溶于 0.2M缓冲液中，使其终浓度为0.5%（w/v）；反应体系含50μL适量酶液，450μL 底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后根据葡 萄糖氧化酶-过氧化物酶法原理，利用葡萄糖测定试剂盒（上海荣盛生物药业有 限公司，CAT361500）说明书测定酶活性；1个酶活单位（U）定义为在给定的 条件下每分钟分解底物产生1μmol葡萄糖所需的酶量。

2、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的pH活性和pH稳定性测定：

酶的最适pH测定：将α-半乳糖苷酶AgaAJB07在37℃下和0.2M pH5.0–10.0 的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于0.2M pH5.0–10.0 的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH6.5及37℃下进行酶促反应，以未处 理的酶液作为对照。缓冲液为：0.2M McIlvaine buffer（pH5.0–8.0）和0.2M  glycine-NaOH（pH9.0–10.0）。以pNPG为底物，反应10min，测定纯化的AgaAJB07 的酶学性质。结果表明：AgaAJB07的最适pH为6.5，在pH6.0–7.5的范围内维 持45%以上的酶活性（图2）；经pH7.0–9.0的缓冲液处理1h，仍能保持75%以 上的活性（图3）。

3、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的热活性及热稳定性测定：

酶的热活性测定：在pH6.5的缓冲液中，于10–60℃下进行酶促反应。酶的 热稳定性测定：将同样酶量的酶液分别置于37℃、50℃和60℃中，处理0–60min 后，在pH6.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPG为 底物，反应10min，测定纯化的AgaAJB07的酶学性质。结果表明：AgaAJB07 的最适温度为45℃（图4）；该酶在37℃及50℃下稳定，在60℃时半衰期小于 10min（图5）。

4、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07的动力学参数测定：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH6.5及45℃下，以1.0mM pNPG 或10mM密二糖为底物，依次在酶促反应的1–30min内终止反应并测定酶活性， 计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为 一级反应时间。用0.1–2.0mM pNPG或4.0–40.0mM密二糖为底物，在pH6.5、 45℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定K_m、V_max和k_cat。经测 定，在45℃及pH6.5条件下，AgaAJB07对pNPG的K_m、V_max和k_cat分别为0.14 mM^-1、15.55μmol min^-1mg^-1和20.96s^-1，对密二糖的K_m、V_max和k_cat分别为34.63 mM^-1、129.87μmol min^-1mg^-1和175.02s^-1。

5、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组AgaAJB07活力的影响：

在酶促反应体系中加入1.0mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的 影响。在37℃及pH6.5条件下，以pNPG为底物测定酶活性。结果（表2）表明， 1.0mM的SDS、HgCl₂及AgNO₃可完全抑制AgaAJB07；CuSO₄对AgaAJB07具 一定的抑制作用（剩余酶活83.8%）；PbAC和ZnSO₄对AgaAJB07有促进作用， 分别提高酶活约0.2倍和0.5倍；其余金属离子和化学试剂对AgaAJB07的影响 较小。

表2.金属离子及化学试剂对纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07活力的影 响

6、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07对底物的降解：

在pH6.5及45℃下，该酶对2mM pNPG的比活为15.9±0.2U mg^-1，对0.5% （w/v）的密二糖（melibiose）、棉籽糖（raffinose）和水苏糖（stachyose）的比 活分别为59.0±2.3、0.08±0.01和0.03±0.004U mg^-1。

7、纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAJB07对不同底物的转糖基产物分析：

转糖基反应体系为每毫升底物含1U酶液，反应在pH6.5及37℃下进行， 反应时间为24h。转糖基供体和受体为同一底物时，底物用40mM的pNPG或 400mM的密二糖、棉籽糖、水苏糖；转糖基供体和受体为不同底物时，供体底 物为40mM的pNPG，受体底物为400mM的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、 乳糖、蔗糖、棉籽糖或水苏糖。转糖基产物分析采用薄层层析法（使用青岛海洋 化工有限公司的高效薄层层析硅胶板G型），层析步骤如下所示：

（1）配制展开剂（冰醋酸20mL，双蒸水20mL，正丁醇40mL，混匀），取 适量倒入展开槽，静置30min左右；

（2）将硅胶板放在110℃烘箱中活化30min，冷却后划线，点样（每次0.5μL， 吹干，共点3次）；

（3）将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中，点样点不要没入展开剂；

（4）待展开剂到距硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展开一次；

（5）第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂（1g二苯胺溶于50mL 丙酮中，溶解后加入1mL苯胺及5mL85%的磷酸，混匀，现用现配）；

（6）几秒钟后，立即取出硅胶板并放置于90℃烘箱中10–15min，使斑点显 色。

结果表明：当转糖基供体和受体为同一底物时，AgaAJB07可使400mM的 密二糖作为转糖基的供体和受体，使密二糖获得半乳糖基（图6），而不能催化 40mM的pNPG或400mM的棉籽糖及水苏糖的转糖基反应；当供体底物为 40mM的pNPG时，AgaAJB07可使400mM的半乳糖、葡萄糖、甘露糖及木糖 获得半乳糖基（图6），而不能催化乳糖、蔗糖、棉籽糖及水苏糖的转糖基反应。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或 变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。