一种使用病毒诱导的基因沉默系统培育雄性不育植株的方法

摘要

本发明提供了VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用。本发明建立了一个基于VIGS技术的高效实用的植物不育株系创建技术体系，不育率超过了96%，可达到98%，且具有不稳定遗传的特点，不会在后代中遗传，不会发生因不可控生物技术扩散而引起的基因污染或生物安全。同时，本发明操作简单，时间短，田间工作量少，大大节约成本，提高育种效率。

说明书

技术领域

本发明涉及以生物技术手段培育雄性不育植株的载体系统和方法，尤其涉及 双子叶植物。

背景技术

培养拥有不育性稳定，彻底，各方面性状良好的雄性不育株系是实现植物 杂交育种目标的关键。目前，生产上培育雄性不育株系的主要途径有胞质不育系 统、核不育系统和化学杀雄系统等。

细胞质雄性不育是当前油菜杂种优势利用中应用最广泛而又最有效的途径 之一，但是该系统不育系的不育性不够彻底、易受环境温度的影响。在初花期低 温条件下易出现微量花粉，微粉的产生将迫使母本自交结实，使F1代种子恢复度 降低，在生产上应用存在一定风险。例如，对于油菜来说，胞质不育系统微粉问 题是目前国内外育种界尚未彻底攻克的技术难题，也是油菜三系制种普遍存在的 一大隐患。细胞核不育系不育性彻底稳定，不受环境条件影响，恢复系多，易获 得强优势组合。该系统的不足之处在于其不育系中存在50％可育株，在亲本繁殖 和杂交种生产中要人工去除不育系中50％的可育株，导致生产成本增加，而且一 旦去除不及时，杂交种中会出现一定比例的不育株系。经过改进，人们育成了隐 性和显性核不育三系，解决了核不育亲本繁殖和杂交种制种过程中需要拔除50 ％可育株的难题，但是该系统存在保持系较少、亲本选育较难的问题。化学杀雄 是指在植物雄性器官分化前或发育过程中，喷施内吸性药剂，经过一系列生理生 化过程，以阻止花粉的形成或抑制花粉的正常发育，而导致的雄性不育。利用化 学杀雄剂培育品种是一种新型的油菜育种方法，在国内外应用较为广泛，但是该 系统杂交种由于易受外界条件影响、田间操作繁琐，而且由于农药残留等问题， 在生产上大面积应用也存在一定局限性。

近来的分子生物学研究中，利用生物技术手段来培育雄性不育植株是一个重 要的研究方向。与传统不育系选育相比，生物技术不育系的培育可以不受遗传资 源的限制，通过转基因等可以从分子水平上改变植物育性的手段实现。然而，利 用转基因生物技术培育的稳定不育系不仅面临着转基因扩散的安全问题，而且同 样存在上述细胞核不育系的缺点。

病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)也是一种可用 于调控植物内源基因表达水平的生物技术。VIGS引起的基因沉默是一种转录后 基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象，是植物体内普 遍存在的遗传免疫机制。VIGS技术通过在病毒载体中插入目的基因片段，并侵 染寄主植物，利用植物体内天然存在的遗传免疫机制，将内源目的基因mRNA降 解，使植物出现目的基因功能丧失或表达水平下降的表型。与植物转基因技术相 比，VIGS无需培育转基因植株，而且具有操作简便、获得表型快速等优点，目 前已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因 功能的研究。但是，利用VIGS技术沉默植物内源基因一直存在一个沉默效率的 问题，一股获得有表型材料的比例低于30％，限制了这一技术应用。

发明内容

本发明的目的在于利用生物技术建立不受育种资源限制、可利用现有可育优 质种质资源，快速培育不育性彻底稳定及性状优良的雄性不育系，而且具有田间 操作简单、制种成本低的授粉控制系统。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用。

优选地，上述VIGS载体系统来源于烟草脆裂病毒(TRV病毒)，包括辅助 病毒载体pTRV1(含TRV病毒的RNA1片段)和表达病毒载体pTRV2(含TRV病毒 的RNA2片段)。

上述pTRV1载体包括以下结构：依次为左边界(LB)、2×35S启动子、2×35S 启动子驱动表达的烟草脆裂病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、富半胱氨酸 16K蛋白、运动蛋白(MP)、自主剪切核酶(Rz)、转录终止子(NOS_t)、右边 界(RB)；上述pTRV2载体包括以下结构：依次为左边界(LB)、2×35S启动 子、2×35S启动子驱动表达的烟草脆裂病毒外壳蛋白(CP)、多克隆位点(MCS)、 自主剪切核酶(Rz)、转录终止子(NOS_t)、右边界(RB)。如图9所示。在利 用VIGS方法沉默植物基因时，利用pTRV2载体CP和Rz之间的多克隆位点(MSC) 将靶基因片段构建在的pTRV2载体中。pTRV1和pTRV2载体均有T-DNA的左右边 界，用于在侵染植物过程中将载体中的目的片段导入植物细胞，以启动烟草脆裂 病毒的复制。pTRV1含TRV病毒的RNAl cDNA克隆，为病毒复制组装所必须；pTRV2 含TRV病毒RNA2cDNA克隆和多克隆位点(MCS)。

上述VIGS载体系统带有植物育性调控基因，主要为隐性雄性不育基因，优 选为COI1基因(Coronatine-insensitivel)，MSP1基因(MultipleSporocyte)， TDR基因(tapetum degeneration retardation)和UDT1基因(undeveloped  Tapetuml)等，在基因沉默后可影响小孢子母细胞发育、绒毡层发育、花粉囊和 花粉外壁发育而导致雄性不育性状的基因。

上述双子叶植物优选为十字花科植物。

油菜COI1基因的序列为SEQ ID NO.1，其中核苷酸(1181)至(1694)的 序列片段可以用于沉默整个油菜COI1基因。烟草COI1基因的序列为SEQ ID  NO.2，其中核苷酸(444)至(952)可以用于沉默整个烟草COI1基因。SEQ ID NO.3 为pTRV1载体中的烟草脆裂病毒RNA1序列片段，SEQ ID NO.4为pTRV2载体 序列。

使用上述VIGS载体系统培育双子叶雄性不育植株的方法，包括以下步骤：

(1)克隆植物育性调控基因，构建携带植物育性调控基因的重组pTRV2病毒载 体；

(2)将携带植物育性调控基因的重组pTRV2病毒载体、pTRV1载体导入农杆菌， 将含携带植物育性调控基因的重组pTRV2病毒载体和pTRV1载体的农杆菌配制成 OD600为0.6～1.0的菌液；

(3)切除植株的部分根须后，将根部浸入步骤(2)的菌液中；

(4)取出侵染后的植株，经培育，最终表现为不育性状。

优选地，上述使用VIGS载体系统培育双子叶雄性不育植株的方法，包括以 下步骤：

(1)克隆COI1基因，构建携带COI1基因的重组pTRV2-COI1病毒载体；

(2)将pTRV2-COI1和pTRV1载体导入农杆菌GV3101，将分别含有pTRV2-COI1 和pTRV1载体的农杆菌GV3101按1：1的比例配制成OD600为0.6～1.0的菌液；

(3)切除植株的部分根须后，将根部浸入步骤(2)的菌液中；

(4)取出侵染后的植株，经过栽种、春化，开花后，最终表现为不育性状。

有益效果

1.本发明创造性的将VIGS技术应用于雄性不育植株的培育，建立了一个高效实 用的植物不育株系创建技术体系。在利用该技术体系培育不育材料的实践中，不 育率超过了96％，可达到98％。

2.本发明创造的雄性不育系具有不稳定遗传的特点，不会在后代中遗传，因此， 在田间生产中不会发生因不可控生物技术扩散而引起的基因污染或生物安全。

3.本发明可快速培育雄性不育植株，可以任意选择最优的品种作为不育亲本， 不存在像细胞核，细胞质雄性不育体系中所要求的恢保关系，因此亲本选择自由， 可任意组配杂交组合，有利于优中选优，筛选出较强的优势组合。同时，本发明 操作简单，时间短。在室内对幼苗根部进行浸泡侵染后即可移栽到田里，后面没 有人工去雄和化学去雄的田间操作，田间工作量少，大大节约成本，提高育种效 率。提高植株杂种优势的利用效率以及实现“杂优+优质”的育种目标。

附图说明

图1实施例2油菜COI1基因cDNA片段的PCR扩增图(514bp)：Marker：DNA 分子量标准；2，3：烟草COI1基因片段的PCR扩增产物；

图2实施例2pTRV2-COI1载体构建的菌落PCR鉴定图：Marker：DNA分子量标 准；1-6：对不同菌落中pTRV2-COI1载体鉴定的PCR扩增产物；

图3实施例2pTRV2-COI1质粒酶切鉴定图：Marker：DNA分子量标准；1，2： pTRV2-COI1质粒的NcoI与EcoICRI双酶切鉴定；3，4：pTRV2-COI1质粒的EcoICRI 与SmaI双酶切鉴定；

图4实施例2转pTRV2-COI1载体农杆菌的菌落PCR检测图：Marker：DNA分子 量标准；1-3：转pTRV2-COI1载体农杆菌不同菌落的PCR扩增检测；

图5实施例2COI1基因沉默油菜中COI1基因的表达水平：对照为使用含空载 体农杆菌侵染的油菜；L1-5，为5个用含有COI1基因载体农杆菌侵染的油菜植株；

图6实施例2VIGS侵染油菜的果荚表型：左侧为对照油菜果荚，正常结实；右 侧为VIGS侵染油菜的果荚，无果实；

图7实施例2VIGS侵染油菜花序的不育表型，其果荚均未正常结实；

图8实施例3以VIGS沉默烟草COI1基因引起的不育表型；

图9VIGS系统载体pTRV1和pTRV2结构示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例 只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域 技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

1.构建VIGS沉默油菜COI1基因的载体

1.1油菜COI1基因cDNA的获得

培育油菜幼苗，待其长到10cm左右时用TRIZOL法提取茎秆和子叶的总RNA， 通过反转录获得油菜总RNA对应的cDNA，取少量cDNA作为模板，正向引物为： AAATCTAGAGTGTCTCCGAACCATAGGC，反向引物为：TCTCTCACCTCTCCAAGCTG，PCR扩 增获得一条大小为514bp的一段油菜COI1基因cDNA片段(SEQ ID NO.1(1181) 至(1694))。

1.2含油菜COI1基因的pTRV2载体的获得

用XbaI酶切COI1基因的cDNA片段，用XbaI和EcoICRI双酶切质粒pTRV2， 酶切体系分别为：1.5μL Buffer(Buffer3)，1μL XbaI，5μL COII基因cDNA 片段，添加水补充至15μL；1.5μL Buffer(Buffer MultiCore)，0.5μL Xba1， 0.5μL EcoICRI0.1μL BSA，3μL pTRV2质粒，添加水补充至15μL.经过2 小时酶切反应后，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得COI1片段和载体片段。以下列 方案切胶回收：

紫外灯下切胶，放入1.5ml离心管，按300μL／1OOmg胶块加入溶胶液，将 离心管置于准备好的50℃预热水浴锅中约10min，至胶块完全融化。将融化好的 溶液转入胶回收吸附柱中，8krpm离心1min，弃液。向吸附柱中加500μL洗涤 液，静置1min，12000rpm离心1min，弃液，重复步骤4。空甩(吸附柱12000 rpm离心1min)，将吸附柱转入一干净离心管，加26-30μL ddH₂O于中央膜处， 室温静置4min，12000rpm离心1min，即得到回收产物。

将回收COI1片段和pTRV2载体片段于4℃连接过夜，得含油菜COI1基因的 pTRV2载体，命名为pTRV2-COI1，连接体系为：1μL T4DNA连接酶Buffer(10x) 1μL T4DNA连接酶，1μL PEG4000，6μL COI1片段，1μL载体片段。

2pTRV2-COI1载体连接产物热激转化大肠杆菌DH5α。

2.1转化

在-80℃冰箱取感受态大肠杆菌(DH5α)，冰水浴约10min解冻，将连接产物 加入混匀。冰浴30min后，在42℃水浴锅中热激60s，立刻冰浴1-2min，加 900-1000μL LB溶液，37℃180rpm摇床复苏约1h。5krpm5min离心，吸弃900 μL上清液，余下重悬，涂LB平板(含30mg／L的Kan)，37℃倒置过夜培养(约 14h)。

2.2挑取阳性克隆

在经过过夜培养的平板上挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，进行初筛。经电泳 跑胶确认后，将含有正确质粒的菌液(按1：1比例加50％甘油)储存于-20℃备 用。按下列方案提取质粒：

将摇好的菌液分装于偶数只10ml无菌试管7krpm离心4min，弃上清液，向 试管中加入200μL sol I(4℃)混匀，再加入200μL sol II(室温)，上下颠 倒混匀(约10下)，溶液变粘稠(像清鼻涕)。再向试管中加入250μL sol III(室 温)，上下颠倒混匀(约10下)，出现絮状或块状白色沉淀，溶液变清亮。将 上述试管离心11krpm6min，取上清液转入纯化柱内，离心8krpm30s，弃液。 向纯化柱中加入650μL洗涤液，离心8krpm30s，弃液。纯化柱空甩(13k rpm 2min离心)，将纯化柱转入干净1.5ml离心管，向纯化柱加30μL ddH₂O(加到 纤维膜上)，室温静置4min，离心13krpm2min，即得到质粒。

最后，将提取质粒分别进行NcoI-EcoICRI双酶切鉴定和EcoICRI-SmaI双酶 切鉴定。酶切鉴定体系分别如下：1.5μL Buffer，0.5μL NcoI，0.5μL EcoICRI， 0.1μL BSA，3μL pTRV2-COII质粒，添加水补充至15μL；1.5μL Buffer，0.5 μL Sma1，0.5μL EcoICRI，0.1μL BSA，3μL pTRV2质粒，添加水补充至15 μL.酶切1小时后，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。酶切结果与预期一致的为 阳性质粒。最后，交由生物公司测序验证。

3.农杆菌GV3101感受态制备

(1)农杆菌GV3101划线培养28℃2天

(2)挑1个单菌落接种于5mlYEB(已加入5μL Rif)，28℃过夜培养

(3)取菌液GV31013ml接种于200mlYEB液体培养基，28摇菌至OD≈0.6(约 4h)

(4)将摇好的菌液装入离心瓶离心5krpm11min，弃液加(冰处理2h)双蒸水重 悬，5krpm离心11min，弃液

(5)向离心瓶中加冰冷0.1mM CaCl2重悬静置10min，5000rpm离心11min， 弃上清液

(6)向离心瓶中加2mL冰冷含15％甘油的85mL CaCl2溶液

(7)用1.5ml离心管分装(100μL／管，离心管上做好标记)，迅速放入液氮中 处理数分钟

(8)将处理好的感受态细胞从液氮中取出置于-80℃保存

4.转化农杆菌

(1)取-80℃保存的感受态农杆菌GV31013份于冰上解冻

(2)向每一份农杆菌的菌液中分别轻轻加入质粒：5μL pTRV2-COI1，1μL  pTRV1，1μL pTRV2(空载体)，小心混匀

(3)将上述混匀的菌液冰水浴5min

(4)冰水浴处理后的菌液液氮处理5min(液氮液面高过菌液面)

(5)37℃水浴热激5min

(6)上述处理后的菌液中加入900μL室温放置的YEB于28℃200rpm摇床复 苏1h

(7)复苏后的菌液6krpm离心5min，弃上清900μL

(8)余下菌液重悬涂于YEB平板(1μL Kan／1ml YEB，1μL Rif／1ml YEB)

(9)28℃倒置培养约2d，至长出直径1-2mm的菌落

挑取单菌落进行菌落PCR鉴定进行初筛，经电泳跑胶确认后获得含VIGS沉 默油菜COI1基因的pTRV2-COI1载体的农杆菌，命名为：GV-COI1，并将含有pTRV2 空载体的农杆菌命名为：GV-C，将含有pTRV1载体的农杆菌命名为：GV-1。

实施例2

1.实验油菜幼苗播种，春化，育苗

播种油菜中双11号，采用塑料纤维做固定物，MS液体培养基为养料，茎秆 长到5cm左右喷施1／500稀释的矮壮素以抑制油菜幼苗的过分生长.半月后开始 春化，春化条件为白天9h，9℃；黑夜15h，40℃。春化14d后12℃复苏2d白 天9h，黑夜15h。复苏完后移入25℃温室培养。

2.用含有VIGS载体的农杆菌侵染油菜幼苗，培育沉默COI1基因的油菜株系

2.1侵染用农杆菌准备

分别将GV-C、GV-1和GV-COI1在6ml YEB培养基中，加入6μL Rif、6μL Kan， 并调取三个单菌接种，于28℃，220rpm.摇菌培养过夜；然后，在50ml YEB培养 基中，加入50μL Rif、50μL Kan、5μL乙酰丁香酮及500μL过夜培养菌液，再 28℃，220rpm.培养至明显变浓(约12h)。

2.2高浓度侵染

将二摇培养的各农杆菌菌液5krpm离心5min，弃上清，各加20ml新鲜YEB液 体培养基重悬，然后将A液：10ml GV-C和10ml GV-1；B液：10ml GV-COI1和 10ml GV-1，分别混匀。分别将油菜幼苗100株，用剪刀剪去部分根系，完全浸入 到A液；将油菜幼苗100株，用剪刀剪去部分根系，完全浸入B液，置于暗箱中 过夜(约12h)。

2.3低浓度侵染

将高浓度侵染过的油菜幼苗从高浓度菌液中取出，分别加入少量新鲜MS单 独在暗箱培养10h.

3.已进行浸根处理的油菜植株的培育

将已进行浸根处理的油菜幼苗按单株栽种，用蛭石和腐殖土按体积比1：1做 栽培土，按处理液A液B液分别为每组油菜命名为GV-C和GV-COI1，移入温室 培育。用自来水浇灌，其间浇4-5次40ml霍格兰(Hoagland)营养液。

结果与分析：

1.油菜COI1基因cDNA片段的获得

通过反转录获得油菜总RNA对应的cDNA，取少量cDNA作为模板通过PCR扩增获 得一条大小约为514bp的油菜COI1基因cDNA片段，如图1。

2.pTRV2-COI1载体转化大肠杆菌DH5α后质粒的PCR鉴定

将酶切油菜COI1基因片段与酶切pTRV2载体的连接产物转化大肠杆菌DH5α后， 在过夜培养的平板上挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。电泳结果如图2，与预期相 符，表明得到阳性克隆。

3.对PCR鉴定的阳性克隆的酶切鉴定

对上一步鉴定为阳性的克隆，提取其中的pTRV2-COI1载体质粒，继续进行酶切 鉴定，电泳结果如图3，酶切结果与预期相符，进一步表明为阳性克隆。

4.对得到的阳性克隆测序

测序结果与预期的基因序列相符，表明得到油菜pTRV2-COI1载体。

5.pTRV2-COI1载体载体转化农杆菌后的菌液PCR鉴定

pTRV2-COI1载体转化农杆菌GV3101后，进行菌液PCR鉴定，电泳结果如图4， 有目的条带，表明得到pTRV2-COI1载体的农杆菌阳性克隆。

6.COI1基因沉默油菜中的COI1基因表达水平明显下降

油菜在幼苗期经过根部浸泡侵染并正常生长6周后，对对照及以VIGS沉默 COI1基因油菜植株中COI1基因的表达水平检测，表明沉默COI1基因油菜植株 中COI1基因的表达水平低于对照的20％，其表达收到了显著抑制。这说明VIGS 方法成功沉默了油菜中的COI1基因。

7.目的基因沉默的油菜表现不育症状

油菜在幼苗期经过根部浸泡侵染后，正常生长开花，到了结实期，对照植株 可以正常结实，而目的基因COI1沉默的植株果荚未能正常发育，表现为不育， 如图6(对照植株与目的基因沉默植株的单个果荚)，图7。对照植株的根部侵 染液为A液，组成为GV-C+GV-1，即空载体pTRV2的农杆菌与辅助载体pTRV1 农杆菌的混合液。目的基因COI1沉默的植株根部侵染液为B液，其组成为 GV-COI1+GV-1，即含有目的基因COI1的重组载体pTRV2-COI1的农杆菌与辅助 载体pTRV1农杆菌的混合液。实验结果表明病毒诱导的基因沉默体系成功按预期 使油菜不育，培育出油菜雄性不育株系，可作为油菜育种中的父本使用。VIGS 侵染油菜中不育油菜植株的统计情况见表1。

表1VIGS侵染油菜中不育油菜植株的统计结果

VIGS处理 GV-C+GV-1 GV-COI1 侵染油菜株数 150 150 不育油菜株数 0 149

实施例3

将烟草COI1基因的对应序列(SEQ ID NO.2的(444)..(952))构建入 VIGS载体，并侵染烟草后也获得了烟草的雄性不育植株。如图8所示，沉默COI1 基因的烟草由于雄蕊的发育异常导致了不育。