用于监测抗凝疗法的方法

摘要

测定用于监测抗凝疗法的凝血因子II和X且仅是它们的结合活性的方法和使用该方法的试剂盒。该方法基于如下推定：因子II和因子X(FII和FX)的结合活性比常规方法(例如PT,P&P)更精确地反映出VKA抗凝血药在患者中的凝固性和抗血栓形成作用。该方法包括混合来自待测试人体的测试血浆与专门制备的缺乏凝血因子II和X且仅是缺乏它们、但具有正常水平的其他因子的血浆(本文称作Fiix-缺乏血浆或Fiix血浆)，以便校正测试样品中非FII和FX的其他凝血因子的任何可能的缺乏。通过添加凝固试剂和钙，可以测定凝血酶或纤维蛋白的生成。本发明的试剂盒包含凝固试剂、钙和专门制备的缺乏因子II和因子FX且仅是它们的血浆。该试剂盒成分是适当冻干的。

说明书

发明领域

本发明属于医学诊断和药物监测领域，特别地，属于测定采用药物 化合物的抗凝疗法的患者中血液凝固的领域。

技术背景和现有技术

血液凝固是在血液循环系统的任何部分受损时防止持续失血的机 制。它涉及形成血液物质的半固体块，其起到填充血管创口的作用。该 系统包含必须保持平衡的血液和血管壁中的系列相互作用成分；失活的 系统导致严重和致命性的出血风险，而凝血系统的过度活性导致循环系 统内血块形成风险(血栓形成和血栓栓塞)、阻塞动脉与因组织坏死(细 胞死亡)导致的潜在致命性后果。

抗凝药或“血液稀释剂”是最频繁施用的药物类型，且在该类型内， 维生素K拮抗剂(VKA，香豆素类)直到最近才成为唯一可利用的口服药 剂。由于患者体内凝血系统的巧妙平衡和患者对疗法的敏感性和响应性 非常大的改变，所以必须谨慎地调整和持续监测VKA剂量，因为患者响 应和适合的剂量频繁地随时间改变。据估计全世界每年进行8亿次检验 以监测使用VKA的患者的凝血情况。

凝血系统包含互连的酶原、酶和辅因子的复杂系统，其作用在人体 内活化血小板和内皮细胞表面上和破损的血管内发挥。当该系统活化 时，通常是在血管创口中，最终的结果是形成包含不溶性纤维蛋白网孔 的血块。在体内，凝固过程在活化的血小板和内皮细胞表面上谨慎地得 到控制，但在测试的实验室中，血小板表面通常被适合的磷脂类取代。 酶原、酶和辅因子传统上称作凝血因子(F)，它们中的大部分在肝内形 成。

维生素K依赖性凝血因子和维生素K拮抗剂：4种凝血因即在肝内 形成的FII、FVII、FIX和FX是无活性的，除非在合成后，它们进一步 通过肝内的维生素K依赖性酶过程被羧化。在维生素K缺乏的患者或用 维生素K拮抗剂(VKA)治疗的患者中，羧化的维生素K依赖性(VKD)因 子的量减少，且由此相关患者血液凝固性(凝固能力)降低。除非VKA的 作用得到控制，否则它可能导致严重且甚至是致命性的内出血。但是， 通过以受控方式降低VKD因子水平，可以预防血管内的异常凝血(血栓 形成)，同时将出血的风险降低到最低限度。因此，必须使用适合的凝 固试验监测VKA的作用。基于试验结果，然后可以调整剂量，使抗血栓 形成作用最大化，同时将抗凝过度导致的异常出血风险降低到最低限 度。

基于测定凝血酶原时间(PT)监测VKA患者中的凝血活性已经超过 60年了，为起始Quick PT(PT)(Quick,A.,J Bio Chem1935(109)： p.73-4)或其改进、Owren's PT(也称作PP,P&P-检验或凝血酶原复合 物试验)(Owren和Aas.Scand J Clin Lab Invest,1951.3(3)：p. 201-8.)。PT检验测定已经耗尽了钙的血浆样品中4种维生素K依赖性 凝血因子中的3种(即FII、FVII和FX)和纤维蛋白原(因子I)和因子V 的凝血活性，通过添加凝固试剂(促凝血酶原激酶，组织因子)和钙、然 后测定血液凝固所需的时间来进行。后面的检验(P&P)是PT的改进，其 中将吸收的血浆(总体缺乏维生素K依赖性因子)混入测试血浆，校正因 子V或纤维蛋白原的任何可能的缺乏并且保留仅对因子II、VII和X敏 感的P&P检验。因此，PT检验也对非维生素K依赖性的因子V和纤维蛋 白原的缺乏敏感，且如果缺乏，则可能使服用VKA的患者中的结果混淆。 然而，使用两种检验，测定的凝血时间对该检验所测定的3种维生素K 依赖性因子即FII、FVII和FX的任一种的减少等同地敏感。通过这些 检验无法测定FIX凝固活性。实际上推定使用基于PT的检验得到的凝 血时间直接反映出除了启动VKA疗法过程中之外的VKA在患者中的抗血 栓形成作用。然而，不一定情况属实。

实际测定的对正常个体测定的凝血时间将根据所应用的方法且还 有分析系统和所用的具体试剂的不同而改变。所用的不同的凝固试剂且 甚至不同批次的制造商的组织因子(促凝血酶原激酶)和蛋白质都将导 致使用PT或P&P得到的凝血时间的变异性。因此，设计了用于校准方 法的方案。每个制造商都指定了所提供的组织因子的ISI值(国际敏感 指数)(参见WHO Guidelines for Thromboplastins and Plasma Used to  Control Anticoagulant Therapy,TRS,No889,附录3.)。ISI值表 示特定批次的组织因子与国际标准的样品比较如何。ISI通常是1.0－ 2.0。由此可以计算“国际校准的比”值(INR)，其为患者的凝血酶原时 间与平均正常群体PT之比，然后使得上述之比值取分析系统的ISI值 的次幂。INR值由此可以用如下等式描述：

INR=(PT/MNPT)^ISI

其中MNPT是指“平均正常凝血酶原时间”。为了实际目的，MNPT 一般作为至少20份来自健康个体的新鲜样品的凝血酶原时间的平均值。 高INR水平，例如INR超过5，表示存在高出血机会，而如果INR为1.3 或以下，则对具有血栓栓塞无预防作用。对于健康人的正常INR范围在 0.8-1.3，对于使用香豆素疗法(例如华法林)的人而言，最为常见推荐 的治疗范围在2.0-3.0。在具体情况中可以将目标INR设定得较高，例 如对于具有人工心脏瓣膜的个体而言。

精确评价血液凝固能力的改进的检验可以克服本领域中现有的方 法的缺陷，并且能够更精确地调整剂量且优选监测抗凝患者中抗凝血药 活性的频率减少，从而可以显著地得到赞赏。

发明概述

本发明涉及抗凝疗法的新的监测方法和用于该方法的试剂盒。该方 法基于发明人的实验，其显示仅测定因子II和X(FII和FX)的活性比 目前的常规方法(PT,P&P)更精确地反映出凝固能力，且由此能够由新的 检验方法更好地显示VKA抗凝血药在患者中的抗血栓形成作用。本发明 基于测定仅凝血因子II和X的结合活性并且排除所有其他凝血因子对检 验结果的影响。该方法包括混合来自待测试人体的检验血浆与缺乏凝血 因子II和X且仅缺乏它们、但具有正常水平的其他因子的血浆(本文称 作Fiix-缺乏血浆)，以便校正测试样品中非FII和FX的其他凝血因子 的任何可能的缺乏，否则可能影响检验结果。通过添加凝固试剂和钙， 可以测定凝血酶或纤维蛋白的生成。按照这种方式，可以在不混淆其他 因子缺乏的作用的情况下准确地评价因子II和X的活性及其结合活性。 因此，本发明提供了血液凝固能力的评价，发明人认为它能够比目前的 方法更精确地反映出对待测试的受试者给予的VKA抗凝血药的抗血栓形 成作用。

本发明还提供了适合于实施本发明方法的试剂盒，其包含凝固试剂 和因子II和X缺乏且仅缺乏它们的血浆。

附图简述

图1：Quick凝血酶原时间(PT,图A)或Owren凝血酶原时间(P&P, 图B)与各维生素K依赖性因子活性的选择性降低的关系。

图2：来自使用华法林稳定抗凝的患者的65份样品中的ROTEM参 数与P&P百分比的关系。

图3：缺乏血小板血浆中ROTEM参数(CT、MaxVel、MCF)与各维生 素K依赖性凝血因子活性选择性降低的关系。

图4：Fiix-凝血酶原时间依赖性；使用具有1.6%－100%的结合FII 和FX活性的检验血浆得到的凝血时间。曲线描述了使用不同实验条件 得到的结果，即检验血浆与Fiix缺乏血浆之比和不同检验血浆的预稀 释液。有代表性的实验显示检验血浆与总血浆之比(检验血浆体积+ Fiix血浆体积)：0.09(1+10)；0.17(1+5)；0.25(1+3)； 0.28(1+2.5)；0.31(1+2.2)；0.40(1+1.5)。

图5.在38份随机选择的来自使用华法林的稳定患者的样品中 Fiix-INR与INR(PP-INR)的相关性。

图6.单一个体中从使用华法林开始的FII、FVII和FX依次测量 值与INR(PP-INR,黑色曲线)Fiix-INR(红色曲线)的相关性。凝血时 间(INR)改变与VKD因子浓度改变的相关性。

详细描述

本发明涉及新方法和基于该方法的试剂盒，用于测定人体血浆样品 中的血液凝固能力，特别地，用于测定抗凝血药在服用这种药物的患者 中的活性。通过该方法消除了非FII和FX的其他凝血因子的影响。该 方法可以特别改善使用香豆素(维生素K拮抗剂,VKA)例如华法林的抗 凝疗法，降低了活性(γ-羧化的)凝血因子II、VII、IX和X的浓度。这 种新方法还可以应用于监测抑制FII或FX或它们两者的其他抗凝血药。

本发明的主要基础基于实验结果，这些结果表明，正如基于常规的 凝血酶原时间的PT(Quick)和P&P(Owren)测定中所进行的，为了测定 血液凝固能力，包括凝固FVII对使用VKA的患者中的凝血时间的影响 可能导致所测定的凝血时间结果波动，而这种波动可能是治疗上无关 的。在调整这些潜在的危险性药物的剂量时，这种混淆的检验结果可能 会误导临床医师。这种新的推定产生了新的发明，其基于如下考虑和实 验结果：

I.在启动使用VKA和如下剂量改变的口服抗凝血药(OA)的过程 中，具有生理学活性的γ-羧化的维生素K依赖性(VKD)凝血因子(F)各自 的浓度受影响至不同的程度和不同的比例，这归因于其明显不同的半衰 期，即FVII(转变加速因子)约3.5小时，FX(Stuart因子)52小时； FII(凝血酶原)72小时(Roberts,H.R.,Escobar M.A.,Other  coagulation factor deficiencies.第3版.Thrombosis and  Hemorrhage,ed.S.A.I.Loscalzo J.第1卷.2003,Philadelphia： Lippincott Williams & ns.575-598)。因此，FVII浓度改变比其他 因子快且这一结果可能对测定的PT/P&P值具有巨大影响，甚至在FII 和FX未显著改变时也是如此。

II.一些在先的研究已经显示香豆素疗法过程中FVII的抗血栓形 成影响可能比凝血酶原(FII)或FX的重要性低(Zivelin等人,J Clin  Invest,1993.92(5)：p.2131-40;Xi等人,Thromb Haemost,1989. 62(2)：p.788-91)。Xi等人证明来自使用香豆素的患者的抗凝样品中 促凝血酶原激酶活性(凝血酶生成)对FX具有依赖性，且特别是FII浓 度依赖性的，而对FVII活性的依赖性较低，这表明在极低FVII浓度下 阈值相关性是第一明显的。Zivelin等人发现VKD因子在家兔中的抗血 栓形成作用依赖于FX的浓度且特别依赖于FII的浓度，但不依赖于FVII 的浓度。此外，已经在临床研究中证明，通过用ELISA测定天然凝血酶 原抗原(NPA)监测VKA显然比使用PT监测更能够预测不良反应，这表明 了PT测量值的一些不准确性(Furie等人,Blood,1984.64(2)：p. 445-51;Furie等人,Blood,1990.75(2)：p.344-9;Kornberg等人, Circulation,1993.88(2)：p.454-60)。最终，Brummel等人使用来 自使用华法林的患者的抗凝血浆的研究证明基于PT的凝血时间(INR)与 对稀释组织因子的响应的凝血酶生成之间相关性差(Brummel等人, Circulation,2001.104(19)：p.2311-7)。我们使用旋转血栓弹性测 定法(ROTEM)和稀释组织因子的发现证明了这一观察结果，从而表明基 于PT或P&P的监测方法的不准确性。

术语“检验血浆”或“检验血浆样品”在本文上下文中是指来自其 凝血试验是期望的患者或受试者的血浆。

“正常血浆”是指适合于用作对照品的来自正常健康个体的血浆， 其优选和典型地采集自几个个体，以校准相关因子浓度的任何个体间变 异。

“凝固试剂”是指触发血液或血浆样品中凝固途径的试剂，其导致 凝血酶原转化成凝血酶和纤维蛋白原转化成纤维蛋白。

本发明的方法基于测定凝血因子II和X且仅是它们的结合活性， 即来自在检验样品中可变的其他因子(例如FI、FV、FVII和FIX)的作用 得到消除。本文的“结合活性”是指所测定的归因于FII和FX的活性 的作用，但其作用彼此无差异。

在本发明的方法中，如上所述将检验血浆与Fiix-缺乏血浆混合， 检验血浆与缺乏性血浆之比适合地在1:1－1:20，优选的范围在1:4－ 1:10，例如1:5－1:8，例如、但不限于1:5、1:6、1:7、1:8或1:10。 本文所用的注释1:4是指1份检验血浆与4份缺乏性血浆，即总计5份 血浆(即20%的检验血浆和80%的缺乏性血浆)。

一般而言，如对常规凝固试验所述处理血浆检验样品，即用钙耗尽 的柠檬酸盐处理抽取自患者的新鲜血样，且通过离心从血浆中分离红细 胞。然后适当地在分析前，可以便利地将所制备的检验血浆样品与Fiix 缺乏血浆混合。

将凝固试剂加入到检验血浆中，然后加入钙，以触发凝固。可以将 凝固试剂和钙一起预混合或各自单独地加入到检验血浆样品中。或者， 将任一试剂或它们两者与缺乏性血浆预混合。因此，请求保护的方法的 步骤包括混合检验血浆样品与缺乏性血浆且可以在一个、两个或三个步 骤中加入凝固试剂和钙。

凝固试剂可以是如上所述那些常规检验中任意的常用试剂，例如、 但不限于促凝血酶原激酶(包括重组组织因子)、磷脂类、因子IXa、因 子XIa、因子XIIa、激肽释放酶、因子VIIa、因子VIIa和外源性激活 物，例如活化因子X的蛇毒液。

本发明的方法通过经内在途径或外在途径激活凝固起作用。凝固试 剂促凝血酶原激酶和因子VIIa将激活外在途径，而下列凝固试剂激活 内在途径：磷脂类、因子IXa、因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶或因 子IXa/VIIIa复合物。

外源性激活物例如蛇毒液可以用于本发明的方法。它们包括 Russel蝰蛇毒(来自Daboi russelii的蛇毒液)，其可以由天然来源得 到或重组生产。还可以使用通过常规途径直接激活因子X的其他蛇毒液。

促凝血酶原激酶不是纯蛋白质，而是组织因子蛋白和磷脂类的复合 物。组织因子(也称作血小板组织因子、因子III、凝血酶原激酶或CD142) 是完整跨膜蛋白，其为因子VIIa的细胞表面受体，作为对因子X而言 的因子VIIa的蛋白水解活性而言强制性的辅因子起作用，所述活性将 因子X转化成活性蛋白酶因子Xa。组织因子需要结合促凝剂磷脂类以完 整表达其辅因子功能。

用于本发明方法和试剂盒的促凝血酶原激酶可以获自本领域技术 人员已知的动物来源，包括、但不限于家兔脑、人胎盘、人脑、牛脑、 牛肺或其他适合的来源。促凝血酶原激酶也可以是重组生产的促凝血酶 原激酶，其优选是重组人促凝血酶原激酶。重组促凝血酶原激酶可以通 过在适合的细胞培养物中表达组织因子成分生产，例如胎盘小鼠细胞培 养物、仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)；真菌细胞、原核生物生物体，例如大 肠杆菌培养物中(E.coli)；转基因植物或其他适合的表达载体；随后在 体外脂化组织因子。

在本发明的一些实施方案中，凝固试剂包含磷脂类，它们可以来源 于各种天然来源或以化学方式合成和/或修饰。用于凝固试验的磷脂类 也称作部分促凝血酶原激酶，不过，典型地，部分促凝血酶原激酶是指 分离自不同组织的磷脂类提取物。当使用磷脂类作为凝固试剂时，它们 可以优选具有适当的组成，富含具有良好促凝活性的磷脂类，例如、但 不限于磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，凝固试剂可以与激活物一起 使用，特别是在将磷脂类用作凝固试剂时。这种激活物可以适当地选自、 但不限于高岭土颗粒、硅藻土、玻璃颗粒、可以是微粉化也可以不是微 粉化的二氧化硅的二氧化硅颗粒或鞣花酸。在该实施方案中，所述方法 相当于所谓的APTT检验(活化的部分促凝血酶原激酶时间)，除本发明 外，加入Fiix-缺乏血浆，使得Fiix-APTT检验结果仅反映出FII和/ 或FX的活性。当使用磷脂类作为检验试剂而不使用激活物时，可以将 检验与所谓的PTT检验即Fiix-PTT比较。

在一些实施方案中，使用一种以上凝固试剂的组合，这种组合包括 使用促凝血酶原激酶和因子VIIa，以及因子IXa和VIIIa的组合。

钙源是一般的，但不必须是氯化钙。

用于该方法的凝固试剂的量/浓度一般与用于测定凝固的目前的方 法类似。当使用促凝血酶原激酶时，结果基于ISI值校正，适当地如校 正Quick PT和Owren PT检验进行。

优选冻干凝固试剂和/或缺乏性血浆，且在这种情况中，在使用前 用水或适合的缓冲液再溶解。

钙以常规浓度使用，例如1.0-4.0mM，优选2.5mM。

终点确定：

本发明方法中的终点确定可以具有任意常规目前使用的类型，包 括、但不限于通过倾斜-试管技术手动(视觉)确定、使用凝块检测方法 例如“滚珠”或震动探针技术(在探针因较高粘度而静止时检测)的机械 检测、使用纤维蛋白形成的光学检测的光学检测方法，且还有基于使用 显色底物的显色技术，包括凝血酶底物(例如底物S2238 (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA,Milano,Italy)和 FXa底物，例如BIOPHEN CS-11(22)(Aniara,Mason OH,USA)。

其他实施方案包括荧光底物的应用，在用酰胺裂解酶(例如凝血酶 或因子Xa)裂解时，其释放荧光标记。它们包括、但不限于肽-4-甲基香 豆素酰胺类(MCA)，例如Pefafluor Fxa(Pefa-5534)(Pentapharm Ltd. Basel,Switzerland)，其为因子Xa的敏感性底物。在其他实施方案中， 使用发光（luminogenic）底物，它们包括底物S-2613(叔丁氧羰基- 异亮氨酰基-谷氨酰基-γ-肽基-甘氨酰基-精氨酰基-异氨基苯二酰肼)， 其他底物参见，例如Hemker H.C.,Handbook of synthetic substrates  for the coagulation and fibrinolytic system,Martinus Nijhoff  Publishers,Boston(1983)。

本发明的试剂盒：

在另一个方面中，本发明提供了适合于在全世界范围内的临床实验 室中操作本发明方法的试剂盒。因此，将该试剂盒配置成以适量和在即 时可用的容器中提供必要的运行本发明检验的试剂。本发明的检测试剂 盒包含凝固试剂例如上述本发明方法描述中举出的一种或多种和仅缺 乏因子II和因子X的正常血浆(Fiix-缺乏血浆)。

缺乏性血浆是仅缺乏因子II和因子X的血浆，使得它仍然包含其 他凝血因子，包括因子VII和IX。缺乏性血浆适合于如上所述生产，即 如上述所定义的优选使用免疫耗竭方法制成的缺乏FII和FX的正常血 浆。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒还包含钙离子源，其可以被提 供在自身指定的容器中或与凝固试剂或缺乏性血浆一起被包括。在其他 实施方案中，钙不作为试剂盒的组成部分提供，因为许多实验室和凝固 仪器带有适合的钙试剂来源。

在一些实施方案中，可以将凝固试剂和所述缺乏性血浆提供在一个 单一容器中，该容器中还可以提供钙离子或不提供钙离子。在其他实施 方案中，可以将凝固试剂和缺乏性血浆提供在单独的容器中。

优选以冻干粉的形式提供凝固试剂和缺乏性血浆，无论将它们单独 提供还是合并在同一小瓶中。适当地配制一个或多个容器，使得可以在 原始容器中再溶解冻干的材料。

实施例-实验部分

我们感兴趣的是研究VKD凝血因子各自对凝固的贡献，正如通过旋 转血栓弹性测定法(ROTEM)所测定的。这些实验结果使得我们认为，在 这些因子的临床相关浓度下FII和FX对血块形成的影响比FVII和FIX 更为巨大。然而，我们不能分辨FII与FX的作用差异。这种观察结果 导致我们的新发明如下所述。

我们没有意识到在先的研究使用高度稀释的促凝血酶原激酶激活 的ROTEM以系统性评价维生素K依赖性凝血因子各自对血块形成的贡 献。ROTEM为通常对全血进行的全面凝固测试。除确定启动纤维蛋白聚 合的时间即凝血时间(ROTEM CT,启动期)外，ROTEM方法还测定了作为 结果的凝固方面(Rand等人,Blood,1996.88(9)：p.3432-45)，包括 随后大量血块形成扩散期的速率(测定为α角或ROTEM最大速度， “MaxVel”)和最终最大血块的硬度(MCF)，它反映出最终的稳定期 (Sorensen等人,J Thromb Haemost,2003.1(3)：p.551-8)。对全 血进行的ROTEM结果不仅随凝血因子的功能变化、而且随血小板功能、 蛋白酶、抑制剂和纤维蛋白溶解系统变化。从一些研究人员的观点来看， ROTEM比使用PPP进行的传统凝固试验更好地描述了血块形成，因为传 统凝固检验仅测定启动期(Ganter等人,J Cardiothorac Vasc Anesth, 2008.22(5)：p.675-80)。由于我们不能对全血进行实验，所以我们 比较了使用PPP进行的实验与使用添加的血小板磷脂或血库血小板的实 验。对大部分情况而言，结果是类似的，除非另有描述。在我们的ROTEM 实验中，我们使用了高度稀释的促凝血酶原激酶(1:17,000)，它可以比 用于PT试验的高促凝血酶原激酶浓度更接近地反映出组织因子的生理 浓度(Brummel等人,上文)。

实验试剂和条件：

血浆和血小板制备

从使用华法林抗凝的患者中抽取血液用于制备PPP检验样品。还从 20个健康供体中抽取血液(10位男性，10位女性)，用于制备合并的正 常血浆(PNP)，以用于凝固测试和ROTEM分析。使用最小阻塞技术，通 过21G针头将血液抽入1/10 vol/vol3.2%(0.109mol/L)缓冲柠檬酸 钠Vacuette@试管(Greiner,Kremsmunster,Austria)。通过在4℃ 以2,500g离心15分钟、除去上清液和以2,500g再离心15分钟制备 缺乏血小板血浆(PPP)。通过合并再离心的正常血浆制备PNP，将最终的 物质以0.5mL等分贮存在-80℃。缺乏免疫耗竭的因子的血浆获自 Haematologic Technologoies Inc.(Essex Junction,Vermont,USA)。 使免疫耗竭的血浆选择性地耗尽凝血因子II、VII、IX或X，且在血浆 中无残留的抑制活性。

由新鲜捐献的在酸性枸橼酸盐葡萄糖(ACD)中的血库血小板浓缩液 制备冷冻-融化的(猝发)血小板(血小板磷脂)和洗涤的血小板。就两者 而言，以如下方式洗涤血小板：以2,500g将富含血小板的血浆(PRP) 离心15分钟，10次再混悬于1:1vol/vol的TBS缓冲液(6.055g Trizma 碱(Sigma,Seetze,Germany)，8.766g NaCL,pH7.4,1000mL H₂O) 中。再混悬后，向试管灌注TBS缓冲液，以2,500g再离心10min。除 去上清液，再混悬沉淀2次。使用Sysmex4000(Sysmex Corp.,Kobe, Japan)自动计数最终的混悬液，将最终溶液调整至血小板计数为 100x10⁹/L。将最终溶液在-80℃冷冻，再次融化，然后再等分入小试 管，再次冷冻，制备血小板磷脂类；或可选地，将洗涤的血小板贮存在 室温下并且在2天内使用。

试剂

用于测定凝血因子的因子缺乏性血浆获自Diagnostica Stago (Asnieres,France)。Hepes缓冲液(Hepes20mM，NaCl150mM，具 有和不具有CaCl₂200mM，pH7.4)获自Bie和Berntsen Inc.(Herlev, Denmark)。重组促凝血酶原激酶(TF)()获自Dade Behring (Marburg,Germany)。再溶解Innovin，以100μL等分部分在80℃ 下贮存于埃彭道夫管中。对每一实验再溶解1支Innovin试管，将10μL Innovin混入990μL Hepes CaCL₂，以制备1:100稀释液，再通过混合 100μL1:100稀释液与500μL Hepes CaCL₂稀释，从而制成1:600的 工作溶液。

免疫耗尽凝血因子FII或FVII或FIX或FX或FII和FX二者的PPP 获自Haemotologic Technologies Inc.(Essex Junction,Vermont, USA)。将耗尽的血浆如下面每一实验以不同比例所述混入采集的正常血 浆。加入促凝血酶原激酶和钙，使用Owren缓冲液逐步递增稀释的正常 血浆来测定凝血时间。

ROTEM实验

如另外部分详细描述的[Sorensen,B.,等人.J Thromb Haemost, 2003.1(3)：p.551-8.Ingerslev,J.等人Haemophilia,2003.9(4)： p.348-52.Fenger-Eriksen,C.等人Br J Anaesth,2005.94(3)： p.324-9]，用ROTEM血栓形成弹性测定凝固分析仪(Pentapharm,Munich, Germany)记录动态血块形成特性，但差别在于不使用全血，而使用含枸 橼酸盐的PPP。简言之，反应混合物包含270μl含枸橼酸盐的血浆+30 μl的缓冲液+20μl稀TF和CaCl₂。所示的全部结果是4次实验的平均 值。血栓形成弹性测定法的测定(ROTEM)基于使用高度稀释的促凝血酶 原激酶(最终反应混合物稀释度TF1:17,000)激活凝固。血浆血块形成 的评价基于标准栓形成弹性测定参数，例如凝血时间(CT)、最大速度 (MaxVel)和最大血块硬度(MCF)。CT表征血块形成起始期。MaxVel表示 凝血扩散期且MCF表示稳定期。

ROTEM实验使用由相关因子缺乏血浆(FII、FVII、FIX或FX)制成 的PNP稀释液进行，所述的缺乏性血浆中逐步混入了递增比例的正常血 浆，以制成1、2、4、8、16、32和50%的最终凝血因子浓度。在2步中 用HEPES CaCl₂缓冲液按1:600稀释该混合物。实验在不添加和添加血 小板磷脂或洗涤的血库血小板的情况下进行。将实验比色杯固定在恒温 控制在37℃的铝杯支持物上。将270μl各血浆稀释液和30μl洗涤的 血小板的混合物置于测定杯中。通过添加20μl重组TF1:600稀释液 和将杯置于连接垂直轴下端的6mm直径枢轴(pin)上开始测定。每次实 验一式四份进行。

凝血酶原时间

使用患者样品测定Quick凝血酶原时间(PT)和Owren凝血酶原时间 (凝血酶原前转化时间，P&P检验)。使用STA-R凝固分析仪(Diagnostika  Stago,Asnieres,France)。使用CI+凝固试剂与 ISI值1.3进行PT，使用STA-SPA50试剂与ISI1.01进行P&P(两者 均来自Diagnostika Stago)。P&P试剂与PT试剂类似，而且由添加的 吸附牛血浆作为凝血因子V和纤维蛋白原的来源组成，且由此仅对FII、 FVII和FX活性敏感。根据基于用Owren缓冲液系列稀释的合并的血浆 的标准曲线计算P&P百分比。如上所述计算INR。

统计学分析

GraphPad Prism5.0统计学软件(GraphPad Inc.CA,USA)用于图 表和统计计算，包括线性和非线性回归分析。全部数据显示为平均值± 1平均值的标准误差(SEM)。

结果

实施例1：PT和P&P与各VKD因子的选择性减少的相关性

PPP中PT与选择的VKD凝血因子FII、FVII、FIX或FX浓度降低 的相关性如图1中所示。Quick凝血酶原时间如图A中所示，Owren凝 血酶原时间(P&P)如图B中所示。通过经逐步在正常血浆中混合而逐步 充满完全免疫耗竭的单一因子的血浆进行实验。正如所预计的，在测试 浓度自始至终两种类型的PT测定(Quick和Owren)同样对FII、FVII和 FX浓度敏感，而没有一种测定对FIX活性敏感。

实施例2：来自使用华法林的患者的样品中ROTEM参数与Owren's PT的相关性

在获自参与抗凝临床的使用华法林的65位连续患者中得到的PPP 样品中比较ROTEM参数和P&P检验结果(图2)。在凝固活性P&P检验百 分比与ROTEM CT之间仅存在适度的相关性(R²=0.27,p<0.0001)，其中 在类似P&P百分比下ROTEM CT变化显著。在P&P与ROTEM Max Vel (R²=0.08,p<0.0001)和ROTEM MCF(R²=0.11,p=0.0014)之间的相关性 差。如果将INR对ROTEM参数绘图，则观察到类似结果(未显示)。还用 等同耗尽所有VKD因子的吸附PPP测定了ROTEM参数。通过混合逐步递 增浓度的合并的正常PPP，逐步用等同浓度的VKD因子充满吸附的血浆。 由于所有VKD因子浓度同样降低，所以发现了良好的相关性，即对于 ROTEM CT，使用非线性回归的R²为0.79，对于ROTEM MaxVel，为0.64， 对于ROTEM MCF，为0.77(未显示曲线)。

实施例3：ROTEM参数与各VKD因子选择性减少的相关性

为了单独地评价每种VKD因子对ROTEM参数的影响，我们使用 ROTEM在选择性耗尽单一各VKD因子的PPP中测试了凝固，然后通过混 合正常血浆逐步充满相关缺乏因子。图3中所示的数据涉及在使用不添 加血小板磷脂或洗涤的血小板的PPP中的实验。通过在轻度和适度低水 平下(与抗凝过程中的那些目的类似)FII或FX逐步选择性减少使ROTEM CT(起始期)(图3A)明显比通过类似FVII或FIX减少的ROTEM CT(起 始期)延长。结果与使用添加的血小板磷脂的PPP和使用添加的洗涤的 血小板的PPP类似(数据未显示)。代表ROTEM血块形成扩散期的ROTEM  MaxVel(图3B)对FII和FX浓度的依赖性也比对PPP中FVII或FIX浓 度的依赖性更高，且还比富含血小板磷脂类的PPP中更高(数据未显示)， 但可能对II的依赖性比添加洗涤的血小板的X浓度的依赖性更高(数据 未显示)。最终，PPP中的稳定期或ROTEM MCF(图3C)对FII和FX的依 赖性比对FIX或FVII的依赖性更高。

基于这些ROTEM实验，我们得出结论：在轻度和适度降低的因子浓 度下，FII或FX对纤维蛋白形成的影响比因子FVII和FIX的影响大， 这与那些目前的和香豆素疗法过程中的目的类似。FII和FX对血块形成 的的所有期间(起始、扩散和稳定)影响都高于FVII和FIX。在患者血浆 样品中上述ROTEM参数与Owren PT(INR)的相关性差可能反映出一方面 FVII与另一方面FII和FX之间对PT和ROTEM试验中血块形成的偏差。

我们还得出结论：在涉及抗凝疗法的因子浓度下，FII和FX的结合作用可能对血块形成的影响明显高于FVII或FIX。然而，由于FVII 比FII和FX具有短得多的半衰期，所以凝血酶原时间(PT或P&P)的波 动有时可能主要与FVII浓度改变相关，且可能无法预测血块形成可能 性或抗血栓形成作用的真实改变。导致PT波动的FVII混杂作用可能潜 在地导致错误剂量的VKA给药和不一定频繁的监测试验。因此，目前的 监测试验中包含FVII敏感性可能降低效力和安全性和增加香豆素疗法 成本。关注可以通过消除FVII对监测试验的影响降低VKA的抗凝作用 的波动。

实施例4：施用于样品血浆的Fiix方法

基于Fiix方法的检验

我们的发明基于如下理念：通过混合待检验的血浆样品与缺乏(完 全耗尽)因子FII和FX的血浆(本文称作Fiix-缺乏血浆)，由此校正样 品中所有其他可能的凝血因子缺乏且随后在用凝固试剂激活凝固后测 定凝血时间，检验结果仅反映出FII和FX凝固活性。

检验结果作为以下形式获得：凝血时间、凝血时间比或测定凝血酶 生成或纤维蛋白形成的任意其他终点。实验结果显示，本文的实施例基 于测定使用促凝血酶原激酶(CI+，来自 Diagnostica Stago)作为凝固试剂、应用STA-R仪器(Diagnostica Stago) 进行测定。由于这是凝血酶原时间变化形式，所以我们将其称作“Fiix- 凝血酶原时间”或Fiix-PT。

在我们的新方法中，我们称作Fiix-方法，将检验的血浆样品(患 者血浆)与FII和FX免疫耗尽的正常血浆(Fiix-缺乏血浆)混合。使用 这种混合物，通过添加促凝血酶原激酶和钙，可以测定凝血酶原时间， 其仅对FII和FX敏感，即Fiix-PT。在Fiix-PT中，检验血浆与Fiix- 缺乏血浆之比可以在1:1－1:20份，优选1:2－1:10(参见下文)。

来自使用促凝血酶原激酶作为凝固试剂的我们的试验(即Fiix-PT) 的证明结果如图4中所示。结果显示得到的凝血时间与“Fiix-百分比” 的相关性，即合并的FII和FX百分比浓度。不同的曲线代表正常血浆 的不同稀释液和混合物中不同比例的正常血浆与Fiix缺乏血浆。

样品中检验血浆与Fiix缺乏血浆之比如下图4中所示：0.09 (1+10)；0.17(1+5)；0.25(1+3)；0.28(1+2.5)；0.31 (1+2.2)；0.40(1+1.5)。

使用不同比例，但我们的目的在于能够可靠地测定<2u/dL的FII 和FX浓度(u是指血浆当量单位)。为了精确地测定低至<2u/dL的FII 和FX浓度，实验结果表明检验血浆与Fiix-缺乏血浆的优选比例在 1:2-1:10。

基于图4中所示的实验，我们决定测定Fiix-PT，通过混合80uL 的1:7稀释的检验血浆与25uL Fiix-缺乏血浆进行(即最终比例为1 份检验血浆与2.2份Fiix-缺乏血浆)。我们然后测定了来自38位使用 稳定的华法林疗法的患者的样品中的“Fiix-PT”，并且计算了国际标 准化比率(“Fiix-INR”)。正如图5中所示的，Fiix-INR与基于Owren's PT的INR值具有良好的相关性(PP-INR；R²=0.87，p<0.0001)。当 Fiix-INR与基于Quick PT的INR相关时(PT-INR，数据未显示)，发现 了相应的结果。

在图6中，我们显示了从使用华法林开始的单一患者中49天内 Fiix-INR、PP-INR、FII、FVII和FX的连续测量值。凝血因子的量(百 分比)显示在左侧Y-轴，INR值显示在右侧Y-轴上。与VKD因子浓度改 变相关的INR改变衍生自示意图。简言之，PT-INR显示比Fiix-INR波 动性更大，原因在于PT-INR对发生在FVII中、而Fiix-INR未发生的 快速改变有响应。然而，由于-基于上述讨论的实验和我们基于其中 的推断，FII和FX浓度主要负责华法林的抗血栓形成作用-我们认为 Fiix-INR更精确地描述了患者中存在的抗血栓形成作用。

特别地，可以观察到PT-INR值在给药前几天升高远快于Fiix-INR， 这可以归因于FVII快速减少，对测定的PT-INR值有影响，而对Fiix-INR 值无影响。PT-INR值显示，已经在第3天时，患者达到了可接受的抗凝 范围(灰色区域)，且在第4天后下降表明华法林剂量可能已经降低。另 一方面，Fiix曲线显示在第5天时患者达到可接受的INR值(可接受的 抗凝作用)。在随后的第6和7天，Fiix值保持在适当的INR区域中， 而PT-INR值错误地显示患者接受了过高的华法林剂量。