鸡MMP-9基因启动子区-1954突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用

摘要

本发明涉及了一种鸡MMP-9基因5′调控区-1954突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用；本发明构建的MMP-9基因启动子-1954位点C

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡MMP-9基因启动子区-1954突变位点的分子标记方法及其育种中的应用。 

背景技术

动物的大多数器官在形成后,极少出现周期性的组织重建与再生。雌性动物的生殖系统,尤其是卵巢中的卵泡在不同阶段经历着生长、成熟和萎缩等周期性变化，Nalbandov指出尤其是鸟类卵泡应该是所有高等脊椎动物中生长速度最快的结构，小卵泡在短短几天内可增长150-200倍发育成熟并排卵。这些动态组织的变更要求细胞外基质的不断的降解和重建。胞外基质内环境稳定性的维持在很大程度上依赖于基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制因子(TIMPs)的协调控制。 

大量研究发现，哺乳动物中MMPs对卵泡发育、闭锁、排卵以及黄体退化过程中起了非常重要的作用。Imai等认为，MMP-2的表达量是衡量牛卵母细胞是否发育正常的一个重要指标。Brannstrom和Ogiwara研究发现，在MMPs的抑制剂或者抗体作用下，小鼠排卵被完全抑制或者减少。而MMPs在鸟类卵巢发育中的研究却很少，前期本课题组发现MMP-9随鸡卵巢成熟和卵泡增大中表达量显著上升，分离培养颗粒细胞，添加激素和TGF-β进行处理，发现MMP-9基因表达只受到TGF-β调控，而其启动子区-1700至-2400含有此基因表达的重要调控元件。 

众所周知，DNA分子标记辅助育种技术，是一种通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可在生长发育的早期进行准确、稳定的选择，而且可克服再度利用隐性基因时识别难的问题，从而加速育种进程，提高育种效率。 

基因启动子区的碱基突变，通常会影响基因转录表达。因此，本研究对不同产蛋率鸡种间的MMP-9基因启动子区存在的SNPs进行了筛查，发现并找出了一个有意义的分子标记，为方便快速地选育出早产、高产的品系/种提供了有利的理论依据。 

发明内容

根据现有技术，发明人进行了进一步的研究和实验，具体涉及了一种鸡MMP-9基因5′调控区突变位点的分子标记方法及其育种中的应用，发明人发现鸡MMP-9 5′调控区上游-1954位点存有C碱基插入/缺失突变，并进行了标记分析，结果发现，新杨褐鸡种中此位点纯合缺失C^-C^-基因型与高产蛋数相关联（P=0.024）。另外，该基因型对应较小的开产日龄（158d），C⁺C⁺型对应较大的开产日龄（161d），有使母鸡提前开产的趋势（P=0.19）。可见检测这个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，并且有助于选育高产蛋的鸡种，为育种工作提供有利的帮助。 

本发明的具体标记方法是： 

采用标记引物P-MMP-9，包括 

P-MMP-9-F，其序列如Seq ID No:1所示； 

P-MMP-9-R，其序列如Seq ID No:2所示； 

扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如Seq ID No:5所示，发现MMP-9基因TSS上游-1954位点在新杨褐鸡中存在C⁺C⁺、C⁺C^-和C^-C^-三种基因型。 

在产蛋数低的群体中，选择C^-C^-基因型的个体，或者选C⁺C^-基因型的公母鸡，通过相互交配得到C^-C^-基因型的后代，然后C^-C^-基因型个体进行繁育扩群，可以得到全为C^-C^-型高产蛋数的群体。 

通过这种标记方法得到的C^-C^-基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有目的地增加C^-C^-基因型的频率对提高产蛋量是一个有效措施；而对于开产较晚的群体，这样的措施也会使其开产适当提前，从而实现早期选种。 

（四）附图说明

图1为P-MMP-9-F/R引物PCR扩增的片段电泳图； 

图2为鸡MMP-9 5′调控区-1954位点的多态性测序图； 

图3为构建定点突变PGL3-载体后序列比对结果； 

图4为分离培养的鸡卵泡颗粒细胞图片，200×倍镜观察； 

图5为C⁺C⁺和C^-C^-两种基因型荧光素酶报告基因启动活性检测示意图； 

（五）具体实施方式

实施例1 鸡MMP-9 5′调控区序列的克隆测序、序列比对及突变位点分析 

1.试验材料 

新杨褐基因组（上海家禽育种有限公司，国家家禽工程技术研究中心），文昌鸡基因组（海南省文昌鸡育种公司），海兰褐基因组（山东泰安海兰褐育种公司）。 

2.试验方法 

2.1 引物设计 

根据已发表红色原鸡序列（GenBank Accession NC_006107.3）设计引物P-MMP-9见表1（Seq ID No:1和2所示），此引物是为研究鸡MMP-9 5′调控区的突变而根据数据库中登录的红色原鸡的序列特意设计的。 

表1 MMP-9启动子扩增引物 

2.2 PCR扩增 

随机选取新杨褐和文昌鸡各50个个体的基因组混池作为模版，用引物P-MMP-9进行PCR扩增。反应体系20μL，其中包括1μL基因组DNA（50-100ng），2μL10×Ex-buffer，1.6μL dNTPs （2.5mM each，TaKaRa），上下游引物各0.5μL（10μM），0.1μL Ex-Taq DNA polymerase（5U/μL，TaKaRa），ddH₂O补足至20μL。扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，退火30sec（退火温度如表3），72℃延伸45sec，进行35个循环；循环结束72℃孵育5min。 

2.3 克隆测序 

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖电泳分离后切取目的带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，AXYGEN）纯化PCR产物，将纯化产物连接到pJET1.2载体（Fermentas），并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，包含目的片段的重组质粒纯化后测序。 

3.结果与分析 

PCR产物电泳见附图1，目的片段520bp（Seq ID No:5）。 

使用DNAMAN version 7.0比对序列同源性和完成突变核苷酸的检索。对测序结果分析，发现扩增的新杨褐和文昌鸡MMP-9 5′调控区-1954位点存有C碱基的插入/缺失突变（见附图2）。 

实施例2 鸡MMP-9 5′调控区-1954bp突变与开产日龄和产蛋量的关联分析 

1 试验材料 

有产蛋记录的文昌鸡88只（海南省文昌鸡育种公司），海兰褐50只（美国海兰国际公司），有产蛋记录的新杨褐个体280只（上海家禽育种有限公司，国家家禽工程技术研究中心），以上均为随机采样，翅静脉采血，ACD抗凝，低温带回，-20℃保存。 

2 试验方法 

2.1 鸡血液DNA的提取 

采用常规酚/氯仿法提取鸡血液DNA。 

2.2 PCR扩增 

以有生产性能记录的新杨褐基因组为模版，进行PCR扩增。引物见表1（Seq ID No1和2），反应体系20μL，其中包括1μL基因组DNA（50-100ng），2μL10×Ex-buffer，1.6μL dNTPs（2.5mM each，TaKaRa），上下游引物各0.5μL（10μM），0.1μL Ex-Taq DNA polymerase（5U/μL，TaKaRa），ddH₂O补足至20μL。扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，退火30sec（退火温度如表3），72℃延伸45sec，进行35个循环；循环结束72℃，孵育5min。 

PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，AXYGEN）进行回收，送公司测序。 

2.2 突变位点统计及关联分析 

利用DNAMAN version 7.0和ChromasPro对突变位点进行统计分析。 

数据统计采用SAS8.1统计软件包的单因素方差ANOVA程序进行基因型与性状（产蛋数、开产日龄）的关联分析，并对其进行Hardy-Weinberg平衡性检测。试验数据用均值±标准误表示（Means±SEM），显著差异水平设定P<0.05。 

3 结果与分析 

3.1 MMP-9 5′调控区-1954突变位点在新杨褐、海兰褐和文昌鸡中基因型和等位基因频率的分布 

由表2可知，只有新杨褐鸡中存在C⁺C⁺、C⁺C^-和C^-C^-三种基因型，且三种基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡，海兰褐和文昌鸡中都缺少了C^-C^-基因型。另外，海兰褐和文昌鸡中C⁺C⁺基因型频率均高于C⁺C^-基因型。 

表2 新杨褐、海兰褐和文昌鸡中-1954位点的基因型和等位基因频率 

3.2 MMP-9 5′调控区-1954bp位点多态性与产蛋性能的关联分析 

在280只新杨褐群体中，MMP-9 5′调控区-1954位点突变对28w（E28）产蛋数的效应，达到p<0.05的统计显著水平，C^-C^-和C⁺C^-基因型产蛋数均显著高于C⁺C⁺基因型。但对开产日龄（AFE），均未达到显著水平。表明此突变位点与产蛋高的性状有关联，具体见表3。 

表3 新杨褐鸡MMP-9 5′调控区-1954位点基因型与开产日龄（AFE）、28w产蛋数（E28）的关联分析 

注：表中数值为开产日龄（AFE）和28W产蛋数（E28）的最小二乘均值±标准误，不含相同字母最小二乘均值间差异显著（P＜0.05）。 

实施例3 鸡MMP-9 5′调控区突变位点对基因表达的影响 

1 试验材料 

29w高峰产蛋期海兰褐母鸡6只，采自泰安赵家庄海兰褐蛋鸡养殖厂，用于卵泡颗粒细胞的培养。 

2 试验方法 

2.1 MMP-9 5′调控区C插入/缺失突变型荧光素酶表达载体的构建 

1)选一只MMP-9 5′调控区-1954位点基因型为C⁺C⁺基因型的新杨褐母鸡个体，以其DNA作为模板来获得C⁺C⁺型序列，扩增片段长度为-3809bp,引物见表4（Seq ID No:3和4）。 

2)PCR扩增使用高保真酶pfuUltra，反应体系(20μL)包括：10×pfuUltra PCR buffer 2.0μL，加KpnⅠ和BglⅡ酶切位点的引物bdP-868-F(10μmol/L)和bdP-868-R(10μmol/L)各0.5μL，dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL，pfuUltra DNA Polymerase(2.5U/μL)0.2μL，DNA模板0.5μL，ddH2O 14.7μL。 

表4 MMP-9-3809长度启动子扩增引物 

3)PCR反应条件为95℃3min；95℃30s，65℃30s，72℃4min，35个循环；72℃延伸5min，得到PCR产物用0.8%TBE琼脂糖凝胶电泳检测。 

4)将pGL3-basic载体37℃水浴锅反应3h进行SmaI位点平末段酶切，然后去磷酸化， 得到的MMP-9启动子-3809bp片段磷酸化，用Fermentas的快速连接酶进行连接，克隆转化感受态细胞，然后提取质粒，用MluI和HindIII限制性内切酶各5U对质粒进行双酶切鉴定。选择正向插入克隆进行测序，测序由济南铂尚生物工程技术服务有限公司完成。 

5）以载体PGL-3-MMP-9promoter为模板，以“GGCCAGAGTGGGGGCCAGGGCTG CAGC”和“GGCTGCAGCCCTGGCCCCCACTCTGGC”为突变引物（Seq ID No:6和7），构建-1954位点的缺失突变载体。PCR反应总体积为50μl，包括2×PrimeSTARTM Buffer 20μl，上下游引物（均为10μM）各1μl，dNTPs（2.5mM each）4μl，pIRES2-DsRed1质粒DNA（0.1ng/μl）2μl，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase（5U/μl）0.4μl。反应条件为94℃3min；95℃40s，65℃15s，72℃7min，16循环，72℃8min。扩增完的产物，跑0.8%的琼脂糖胶进行检测，然后用Axegen回收试剂盒进行回收。扩增回收后的产物，用DpnI内切酶处理，然后进行转化克隆，提取质粒后，经过酶切验证，送阳性克隆到济南铂尚生物公司进行测序分析，分析突变是否成功。 

2.2 去内毒素质粒制备 

用Qiagen公司EndoFree Plasmid Purification去内毒素质粒提取试剂盒，按说明书进行。 

将构建好的C+C+和C-C-两种基因型载体质粒，重新转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆，摇菌，用QIAGEN公司去内毒素试剂盒提取重组荧光素酶真核表达载体质粒，用于原代细胞的转染。 

2.3 鸡卵巢颗粒细胞的分离培养 

1)产蛋高峰期母鸡，颈静脉放血处死，剖开腹腔，用灭菌剪刀完整取下整个卵巢，投入盛添加了3×双抗的PBS液的无菌烧杯中，带入无菌间进行分离。注意取卵巢时不要将卵泡弄破。 

2)分离方法根据Gilbert（1977）的文献进行。对直径6mm以上的各级卵泡，逐个取下放到盛有3×双抗的PBS的灭菌的平皿中，左手用尖头的眼科镊子夹住卵泡最外边的膜层，右手用解剖针或尖头镊子将膜层与颗粒层进行剥离，确保外层膜剥离干净后，用小剪刀剪破卵泡放出卵黄，剩余组织于PBS中洗2-3次，放入灭菌1.5mL离心管中，用眼科剪剪碎。 

3)剪完后，加入1mL0.1%Ⅱ型胶原酶，放入38℃CO2培养箱中消化7-8min。 

4)在超净台中，用灭菌200目铜网过滤至新离心管中，4000rpm离心5min。收集细胞沉淀，每管加500μL M199工作液轻轻吹打重悬细胞沉淀，暂时放入38℃CO2培养箱中。 

5)待所有的细胞沉淀消化完毕后，统一收集到15mL离心管中，吹匀细胞，吸出10μL加990μL M199工作液稀释混匀进行细胞计数。 

6)按所需的细胞量接种24孔培养板，没孔细胞数1-2×106为宜。 

7)接种好的板放入CO2培养箱中38℃静置培养，CO2浓度5%。 

8)接种的细胞12h后进行部分换液，一般24孔培养基每孔加500μL培养液，部分换液时吸出200μL培养基，加入200μL新培养基，24h后可全部换液。 

9)培养至细胞贴壁80-90%时进行脂质体转染实验。 

2.4 质粒DNA转染试验 

Invitrogen公司Lipofectmine TM2000脂质体转染试剂盒，按说明书进行。 

1)对于培养贴壁良好的细胞，转染前24h，将含双抗的M199培养液换成不含抗生素的M199培养液，每孔加500μL。 

2)对每个转染模板，按以下步骤准备合成物： 

a.将构建好的两种基因型真核表达载体质粒DNA（0.8μg/孔）及内对照载体质粒PGL4.74(0.04μg/孔)分别稀释到50μL不含抗生素的Opti-MEM I Reduced Serum Medium中，轻轻混匀。 

b．Lipofectamine 2000在用之前要先混匀，然后取2.0μL，稀释到50μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium中。室温下孵育5min（25min之内必须进行下一步操作）。 

c．孵育5min后，将稀释的质粒DNA和稀释的Lipofectamine 2000混合（总体积为100μL。轻轻混匀，在室温放置20min（溶解可能出现浑浊现象）。 

3)向待转染的细胞培养孔中加入100μL混合物，加入后轻轻摇动将其混匀（来回摇动培养板）。每种基因型质粒重复转染3个细胞孔，即做3个重复。 

4)将培养板放入38℃CO2培养箱中培养继续培养，培养液在转染后6h换掉，继续用不含双抗的培养液培养。 

5)转染后24h，吸净细胞培养孔中培养液，用PBS洗2-3次，然后加入100μL1×Passive Lysis Buffer裂解液收集细胞，保证孔壁上无残留细胞，低温避光，以备检测。 

6)相同的转染共做了两次，颗粒细胞来自不同的鸡个体卵泡，即做了两个独立实验。 

2.5 双荧光素酶活性测定 

用Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System双荧光素酶报告基因检测系统，严格按说明书进行操作。 

萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性测定在一个反应管中进行。以下是手动luminometer和单个加样操作过程： 

1)根据要检测的样品个数，向所用到的luminometer管中加入100μL LARⅡ/管。 

2)将luminometer设定到测前延迟2s，然后每个样品设定10s的测量时间。 

3)小心地将20μL溶胞产物转移到含有LARⅡ的luminometer管中；混匀（通过反复吸打2-3次混匀，不要旋涡震荡），将管放入luminometer中开始读数。 

4)luminometer和电脑相连，记录下萤火虫萤光素酶(Firefly Luciferase)的活性值M1。 

5)将样品从luminometer中移出来，加入100μL的stop&Glo Reagent，然后旋涡混合。将样品管重新放入luminometer中，然后测定海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)的活性，记录下海肾萤光素酶的活性值M2。 

6)每组重复3孔，每组细胞的荧光素酶活性以3孔测得值的平均数表示。 

7)计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性比值（M1/M2）为报告基因的相对表达水平，即不同单倍型的启动效率。 

2.6 统计分析 

数据统计采用t检验，进行两两比较。试验数据用均值±标准误表示（Means±SEM），显著差异水平设定为P<0.05。 

3 结果与分析 

3.1 定点突变测序 

采用定点突变的方法，PCR扩增中使用高保真酶，有力保证了不同等位基因间除突变位点外其它序列的一致性，突变结果如图3。 

3.2 鸡卵泡颗粒细胞分离培养 

通过手工剥离可有效将鸡卵泡的膜层去掉，用0.1%Ⅱ型胶原酶消化7-8min是最佳消化时间，培养的鸡卵泡颗粒细胞在24h左右可贴壁良好，第一次换液时以换掉50%为宜，彻底换液会造成颗粒细胞数量减少和生长状态不好，转染时间以颗粒细胞培养到72h，达到铺板80-90%时为宜，转后细胞状态较好，结果如图4。 

3.3 不同等位基因型报告基因的启动活性 

双荧光素酶报告基因检测结果如图5和表5所示，基因型C+C+的启动效率最高，与C-C-基因型间存在极显著性差异（P＜0.01）。 

表5 -1954区不同基因型对MMP-9基因启动活性的影响 

综合以上结果： 

通过3个鸡品种比较，表明MMP-9基因-1954位点存在碱基突变，有C⁺C⁺、C⁺C^-和C^-C^-三种等位基因型。三种基因型在新杨褐鸡中都有，而在文昌鸡和海兰褐鸡中，却只检测到了C⁺C⁺和C⁺C^-两种基因型。新杨褐鸡中,C⁺C^-和C^-C^-基因型与高产性状相关，28W产蛋数显著高于C^-C^-基因型（P＜0.05）。荧光素酶的分析结果表明，C⁺C⁺型的启动效率最高，显著高于C^-C^-型（P＜0.01）。 

由此，通过这种标记方法选择的C^-C^-基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有目的地增加C^-C^-基因型的频率对提高产蛋数是一个有效措施，而对于开产较晚的群体，这样的措施会使其开产适当提前，从而实现早期选种。具体示例如下： 

新杨褐是中国优质家禽品种之一，开产日龄（50%产蛋率）154-161天，72周龄入舍母鸡产蛋数为287-296枚。表2新杨褐的数据分析结果显示：C^-C^-基因型的个体开产日龄平均为161天，28周龄产蛋数平均为26.1枚;C⁺C^-基因型的个体开产日龄平均为158天，28周龄产蛋数平均为29.2枚;C^-C^-基因型体开产日龄平均为158天，28周龄产蛋数平均为31.2枚。所以，可以选择C^-C^-基因型作为父母代，将来得到的商品代蛋鸡的基因型则全为C^-C^-型。 

通过以上育种得到的C^-C^-基因型能兼顾开产日龄和产蛋数，可以进一步提高整个鸡群的产蛋性能。