可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶及其制备方法和使用方法

摘要

可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶，包括溶液A蚕丝素蛋白溶液和溶液B改性海藻酸盐溶液，其中溶液A中：各组份的重量份为：蚕丝素蛋白：1.0ⅹ10-1～3.0份，二价金属离子交联剂：1.4ⅹ10-3～2.0x10-3份，其余为水，含蚕丝素蛋白1～5wt%；溶液B中：各组份的重量份为：海藻酸盐：5.0ⅹ10-1～4.0份，羧基活化交联剂：2.5ⅹ10-3～4.0x10-1份，其余为水，含海藻酸盐1～5wt%。该双交联水凝胶，采用共价交联和离子交联的双交联方法，原位快速聚合，在组织工程支架、药物控释、再生医学等领域有应用前景。本发明还提供该双交联水凝胶的制备方法和使用方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料，具体涉及蚕丝蛋白的加工利用技术，更具体是可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶及其制备方法和使用方法。

背景技术

组织器官缺失及机能障碍是影响人类生存质量、导致人类疾病和死亡的最主要原因之一。受损器官修复和重建是生物学和临床医学面临的重大难题。组织工程利用支架材料、种子细胞、生长因子在体外的生物反应器内或生物体内进行组织器官再生。用于组织修复的支架材料是组织工程与再生医学的中心内容之一。在物理特性上，它是种子细胞赖以依附和生存的空间，为组织再生提供空间架构、力学需求和几何形状；在化学特性上，可以协调生物活性因子和细胞之间的相互作用。

按制作特征，组织工程支架可分为：预制固体支架和可注射水凝胶支架两类。体外预制固体支架适用于修复面积大、非包含性缺损。相比之下，可注射水凝胶作为组织工程支架，突出的优势在于：（1）可通过微小侵入技术对分散性、包含性的缺损进行修复；（2）细胞接种较均一，其凝胶网状结构可为细胞提供充分的附着面，使细胞生长在类似生理状态的环境中，这有利于保持细胞活性，并促进细胞分泌大量基质，构建组织；（3）可以保护移植细胞，避免受到机体免疫细胞攻击；（4）可作为生长因子、药物的缓释载体，利于生长因子和药物的定点、持续释放，发挥生物学作用。

甄选基质材料，采取合适的原位交联方法，是目前构筑适用于组织工程支架、缓释药物载体的可注射水凝胶的关键所在。

蚕丝素蛋白是蚕茧脱胶后获得的天然蛋白质，用于临床外科缝线已经数十年。蚕丝蛋白作为组织工程支架材料具有强度高、多孔、易于加工处理、生物相容性好的优点。研究表明，蚕丝素蛋白膜有利于纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、胶质细胞等人类细胞的粘附和生长，无细胞毒性、无致敏性和刺激性，更无致癌性和遗传毒性，适合用作生物材料。

海藻酸盐为D-甘露糖和α-葡萄糖组成的天然多糖，主要来源于海藻产品，广泛用于食品添加剂和创面辅料、药物载体。海藻酸盐溶液可与二价阳离子，如：钙离子（Ca²⁺），形成交联网状结构的凝胶，该过程不受温度影响。该凝胶可载运药物和细胞，控制释放生长因子。但海藻酸盐本身不具有生物信号识别区域，对细胞粘附性不理想，对其进行改性是近年的研究热点。

在生物组织中，细胞外基质以蛋白质和多糖为主要成分，故组织工程支架的趋向采用复合材料。通过蛋白质和多糖基质的交联，形成复合支架材料具有仿生的意义，可以保留单基质材料的性质，且可以改进单组分的不足。

采用冻干法(还称为：相分离法)，可制备蚕丝素蛋白-海藻酸盐复合固体支架，具体步骤包括：

第一，蚕丝素蛋白水溶液的制备：将蚕茧在Na₂CO₃溶液中溶解，用去离子水冲洗过滤，脱去丝胶。然后将脱胶好的蚕丝素蛋白在70℃溶解在LiBr/C₂H₅OH/H₂O的混合溶液中。将此溶液透析脱去盐，得到蚕丝素蛋白水溶液。

第二，蚕丝素蛋白-海藻酸钠支架材料的制备：将2wt%海藻酸钠水溶液和丝素蛋白水溶液按一定比例混合，得到2wt%的丝素蛋白/海藻酸钠混合溶液。然后将混合溶液在零下20℃冷冻24 h，得到冻干的支架材料。随后将该材料浸入含有乙醇和10 wt%氯化钙的凝固浴中48 h，用离子水除去材料中残留的盐离子，将材料冷冻干燥就得到蚕丝素蛋白-海藻酸钠固体支架材料。

组织工程用丝素-海藻酸钠复合纤维固体支架材料，制备方法有: 热致相分离法和静电纺丝方法。

采用上述方法，均不能制备可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐水凝胶。

发明内容

本发明的一个目的是提供可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶。

本发明的可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶，包括溶液A蚕丝素蛋白溶液和溶液B改性海藻酸盐溶液，其中溶液A中：各组份的重量份为：蚕丝素蛋白：1.0ⅹ10^-1～3.0份，二价金属离子交联剂：1.4ⅹ10^-3～2.0 x10^-3份，其余为水，含蚕丝素蛋白1～5 wt%；溶液B中：各组份的重量份为：海藻酸盐：5.0ⅹ10^-1～4.0份，羧基活化交联剂：2.5ⅹ10^-3～4.0x10^-1份，其余为水，含海藻酸盐1～5 wt%。 

所述二价金属离子交联剂选自Ca²⁺、Ba ²⁺、Mg ²⁺、Li ²⁺、Fe ²⁺的Cl^—盐或Br^—盐。

作为优选，所述二价金属离子交联剂选自Ca²⁺、Ba ²⁺的Cl^—盐。

所述羧基活化交联剂选自1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐、二环己基碳二亚胺、N, N-二异丙基碳二亚胺。

其中，所述羧基活化交联剂1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺中二者的重量比为1:1～4:1；所述羧基活化交联剂1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐中二者的重量比为1:1～4:1。

为了确保产品质量，本发明中所述水为去离子水。

本发明中所述蚕丝素蛋白为蚕茧脱胶后的干燥品。

本发明的另一个目的是提供一种可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶的制备方法。

该制备方法包括下述步骤：

（1）将蚕茧脱胶后的蚕丝素蛋白溶解，去醇去盐，定量加入二价金属盐，加水配制成含蚕丝素蛋白为1～5 wt%的溶液A；

（2）将海藻酸盐溶解，加入羧基活化交联剂，在pH5.5～7.4搅拌，加水配制成含海藻酸盐为1～5 wt%的溶液，陈化30～120 min得溶液B。

上述步骤（1）的过程为：将蚕茧剪碎，加入0.05 mol/L Na₂CO₃水溶液，浴比为1:200，加热至沸，保持60 min，经清洗和干燥后，将所得丝素蛋白溶解在CaCl₂/EtOH/H₂O=1 mol:2 mol:8 mol的溶解体系中，然后置于流水中透析2～5天，加水配制，搅拌下加入二价金属盐。

本发明的第三个目的是提供一种可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶的使用方法。

该使用方法是：将溶液A和溶液B分别超声分散60 ～ 180 s，按1:1～5体积比例平行注入体内混合；其中分别超声分散的时间可以相同也可以不同。

本发明的可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶中，蚕丝素蛋白和海藻酸盐均为主活性成份，交联剂为次活性成份，去离子水为溶剂。

本发明采取化学固化法，在交联剂、交联方法上对已有技术进行改进，通过原位双交联的交联机理，制备可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶。该方法以蚕丝素蛋白和改性的海藻酸盐为基质材料，采用共价交联和离子交联的双交联方法，原位快速聚合。所制备可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶在组织工程支架、药物控释、再生医学等领域有应用前景。

本发明提供的可注射水凝胶具有以下优点：

（1）生物兼容性好。采用天然蚕丝和海藻酸盐为原料，无细胞和组织毒害性，并具有良好的生物降解性，能应用到生物体内。

（2）工艺简单。采用离子交联或离子交联和共价交联联用的方法制备水凝胶体系，工艺简单，无需特殊复杂设备，操作性强。

（3）成胶速度快。通过原位双交联的交联机理，对蚕丝素蛋白溶液和改性的海藻酸盐溶液按一定比例混合，可在30~800 s 时间内可快速交联，均匀形成固化水凝胶，适用于细胞移植和药物。

（4）性能可调。通过改变组分含量和羧基活化剂的用量，可以调控该水凝胶的凝胶时间为30~800 s；调控该水凝胶的机械性能，其弹性模量值为50~5000 Pa ；调控该水凝胶的多孔结构，孔径尺寸为10～300 μm；以适配其在不同软组织中的应用需要。因而本发明的可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶可以通过改变两种交联剂的浓度，改变蚕丝素蛋白与海藻酸盐的组成配比，实现调控水凝胶的成胶速度，弹性模量，微观结构，降解速度和吸水溶胀率。

（5）吸水率高。制备的水凝胶吸水溶胀率高达3500~35000%。

（6）细胞粘附性好。具有良好的细胞粘附性，解决了海藻酸盐水凝胶细胞粘附性差的问题。

附图说明

图1为本发明的可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶交联后的扫描电子图。

具体实施方式

实施例1 

溶液A蚕丝素蛋白溶液的制备：将蚕茧剪碎，加入0.05 mol/L Na₂CO₃水溶液，浴比为1:200，加热至沸，保持60 min，以除去蚕丝表面上丝胶。经清洗和干燥后，将丝素蛋白溶解在CaCl₂/EtOH/H₂O （物质的量比：1 mol:2 mol:8 mol）溶解体系中，置于流水中透析3天，去除溶液中乙醇和游离的Ca²⁺，用去离子水配制质量浓度为1 wt%的蚕丝丝素蛋白溶液10 mL, 搅拌加入0.0451克CaCl₂。

溶液B改性海藻酸盐溶液的制备：将海藻酸盐溶解，用去离子水配制质量浓度为2 wt%的海藻酸盐溶液10 mL，加入对羧基具有活化性能的交联剂1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）0.0052克，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）0.0016克，溶液pH7.0，搅拌，陈化100 min。

交联：用注射器分别取溶液A和溶液B 各1 mL，分别超声分散60 s，按1:4比例混合，在200 s 时间内快速交联成胶，获得氨基与羧基共价交联、金属离子交联的双交联水凝胶。其微观结构如图1所示。

实施例2  

溶液A的制备：按实施例1所述的方法配制质量浓度为1 wt%的蚕丝素蛋白溶液10 mL, 搅拌加入0.0618克CaCl₂。

溶液B的制备：按实施例1所述步骤配制。

交联：按实施例1所述步骤制得氨基与羧基共价交联、金属离子交联的双交联水凝胶。由于钙离子的浓度增加，得到的水凝胶的成胶时间减小到100 s；水凝胶的泡孔尺寸减小，泡孔分布均匀；弹性模量增加到700~900Pa，吸水溶胀率减小，降解速率降低。

 实施例3

溶液A的制备：按实施例1所述步骤。

溶液B的制备：按实施例1所述配制质量浓度为2 wt%的海藻酸盐溶液10 mL，加入对羧基具有活化性能的交联剂1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）0.0104克，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）0.0031克，溶液pH7.0，搅拌，陈化100 min。

交联：按实施例1所述进行。

增加羧基活化的交联剂浓度，所得水凝胶的成胶时间增加到240 s，弹性模量增加，水凝胶的吸水溶胀率减小，降解速率降低。

实施例4

溶液A的制备：按实施例1所述步骤。

溶液B的制备：按实施例1所述步骤。

交联：用注射器取溶液A 1 mL，用注射器溶液B 5 mL，均超声分散60 s，混合，在300s 时间内快速交联成胶，获得氨基与羧基共价交联、金属离子交联的双交联水凝胶。

增加改性海藻酸盐用量，水凝胶的成胶时间增大，成胶速率减慢；弹性模量减小，微观泡孔结构尺寸变小；降解速度加快，水凝胶的吸水溶胀率增加。

实施例5

溶液A的制备：按实施例1所述步骤配制质量浓度为1 wt%的蚕丝素蛋白溶液10 mL, 搅拌加入0.0841克BaCl₂。

溶液B的制备：按实施例1所述步骤。

交联：按实施例1所述步骤，获得氨基与羧基共价交联、金属离子交联的双交联水凝胶，成胶时间减小到50 s。