一种同时快速筛查鉴定乳制品中多种有机酸的离子色谱-高分辨质谱联用方法

摘要

本发明公开了一种同时快速筛查鉴定乳制品中多种有机酸的离子色谱-高分辨质谱联用方法，包括将待测样品用氢氧化钾溶液提取，提取液用反相填料前处理小柱净化，使用IonPac AS19色谱柱分离，KOH淋洗液洗脱，之后在负离子模式下用Orbitrap高分辨检测器全扫描模式检测，测得的数据与现有数据对比进行筛查和鉴定；该方法降低了对样品前处理的要求，有效的节省了样品前处理时间，极大的缩短了测出被测物的保留时间，可排除假阳性，采集的数据可根据检测需求反复调用。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时快速筛查鉴定乳制品中多种 有机酸的离子色谱-高分辨质谱联用方法。

背景技术

乳制品中的有机酸具有抑制有害菌的繁殖、提供不同风味的作用，在乳制 品产品中广泛存在。其主要来源分为生产添加和天然产物两种途径：生产加工 过程常使用苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、磷酸等作为酸度调节剂；天然 有机酸主要是由乳脂肪水解产生自由脂肪酸如乙酸、丁酸，牛的生理代谢产生 柠檬酸、乳清酸、尿酸，细菌及乳酸菌的分解代谢产生乳酸、乙酸、丙酮酸、 丙酸、甲酸，同型乳酸发酵将几乎全部的碳源经丙酮酸代谢转化为乳酸，也可 以产生其它有机酸及风味代谢产物。

由于其相对较高的安全性，除富马酸外，我国的国家标准中对这些有机酸 的使用并没有限量规定，最大使用量为“根据生产需要”而定。但实验研究表 明，长期食用或食入过量有机酸同样会对人体产生损害，秦淑贞等在小鼠中进 行的急性毒性试验结果显示：柠檬酸本身毒性轻微，但与重金属螯合后会导致 肝细胞弥漫性坏死，肝小叶消失。

为避免在食品生产过程中不法商贩无限制、无量的使用有机酸，世界上很 多组织和国家都对有机酸的使用范围和限量都作了相应规定：国际食品法典委 员会（ACA）规定水果汁中柠檬酸限量3000mg/kg，酒石酸限量4000mg/kg， 婴幼儿的补充食品中乳酸限量2000mg/kg，乙酸限量5000mg/kg，生面制品、 面条中富马酸限量700mg/kg；欧盟规定干制粉状甜品混合物中富马酸限量 4000g/kg，饼干和面包干中酒石酸限量5000g/kg；我国台湾尤其单独规定婴儿 食品中不得使用苹果酸。

目前，食品、环境、化工、医学等领域的检测技术中，针对阴离子、阳离 子、水溶性和极性小分子化合物常采用离子色谱分析技术。但是，离子色谱仪 检测时间较长，通常为40-60min，且仅凭保留时间作为定性定量依据，无法提 供结构信息，对于保留时间相同的物质无法进一步进行结构上的确认，从而易 导致假阳性结果。

质谱技术可以在分析过程中提供更准确的定性定量检测，近年来有关离子 色谱质谱联用技术已有报道，法芸等利用毛细管离子色谱质谱联用分析装置进 行有机酸、糖、醇等水溶性组分的分析，但其采用的低分辨质谱仅能对已提供 标准品的既定化合物进行分析，无法对难以获取标准物质的、或无法规要求的 非既定化合物进行筛查，难以满足当今世界各地法律法规频繁更新的检测要 求；且低分辨质谱在采集开始前即已设定参数，一旦采集无法反复调用多层数 据。

高分辨质谱具有质量分辨率高和精确分子量的功能，因此对样品前处理的 要求降低，有效的节省了样品前处理时间；且由于其高分辨的优势，无需在色 谱分离上进行分段分离即可将待测组分识别，色谱分离时间由此由原来的 50-60min缩短为30min左右；高分辨质谱在全扫描模式下采集的数据可以根据 检测需求反复调用，在不提供标准物质的情况下仍然能够进行筛查分析，由此 弥补传统低分辨质谱方法的不足；其数据依赖性扫描可以在筛查的同时，通过 碎片离子进行定性确证。近年来通过与液相色谱串联的方式在食品检测、蛋白 质组学等方面已开始逐渐应用，但在与离子色谱串联应用的检测领域尚属空 白。

发明内容

本发明提供一种同时快速筛查鉴定乳制品中多种有机酸的离子色谱-高分 辨质谱联用方法。

一种同时快速筛查鉴定乳制品中多种有机酸的离子色谱-高分辨质谱联用 方法，包括以下步骤：

将待测样品用氢氧化钾溶液提取，提取液用反相填料前处理小柱净化，使 用IonPac AS19色谱柱分离，KOH淋洗液洗脱，之后在负离子模式下用Orbitrap 高分辨检测器全扫描模式检测，根据测得的数据进行筛查和鉴定；

优选地，色谱条件为：

柱温：35℃；

流速：0.25mL/min；

流动相：30mM KOH；

质谱条件为：

电喷雾离子源；

喷雾电压：5.00kV

质荷比范围：50-300

毛细管电压：-21.00V

管透镜电压：-128.70V

毛细管温度：350℃；

鞘气(N2)流速：17L/min(即30arb)；

辅助气(N2)流速：8L/min(即10arb)；

分辨率R=60000。

进一步地，氢氧化钾溶液的质量浓度为1％。

进一步地，所述反相填料前处理小柱是RP前处理小柱。

RP前处理小柱为Thermo RP前处理小柱。进一步地，RP前处理小柱使用 前依次用10mL水、10mL甲醇、10mL水活化，之后再将提取液上样。实际操 作中，弃去前5mL液体后，收集过滤液，过滤液用色谱柱分离。

进一步地，色谱柱采用IonPac AS19，250mm×2.1mm，2.5μm。

进一步地，色谱条件中，样品室温度：10℃；进样量：10μL；分析时间： 30min。

KOH淋洗液梯度洗脱是自动发生器在线自动产生KOH淋洗液进行梯度洗 脱。

可采用Xcalibar软件对样品中各化合物的分子式、保留时间、一级质谱质 荷比、天然同位素分布等信息进行采集。

使用的仪器为：离子色谱系统：Dionex ICS-2000；高分辨质谱系统：Thermo  LTQ-Orbitrap XL。

本发明的有益效果如下：

1、本发明建立了一种同时快速筛查鉴定乳制品中多种有机酸的离子色谱- 高分辨质谱联用方法，应用的离子色谱-高分辨质谱新型分析装置具有高分辨 率、高灵敏性的特征，降低了对样品前处理的要求，有效的节省了样品前处理 时间。

2、本发明无需在色谱分离上进行分段分离即可将待测组分识别，极大的 缩短了测出被测物的保留时间，从原有的离子色谱仪40-60min缩短为30min 左右。

3、本发明能在提供保留时间的同时提供精确分子量，将此双向信息结合 应用分析，可利用其结构信息排除假阳性，利用其保留时间分辨同分异构体。

4、本发明在全扫描模式下采集的数据可以根据检测需求反复调用，由此 弥补传统低分辨质谱采集开始前即已设定参数，一旦采集无法反复调用多层数 据的不足。

5、本发明可以在不提供标准物质的情况下进行非既定目标物的筛查分析， 是应对当今世界各地法律法规频繁更新的检测要求的极为有效的应用。

6、本发明的数据依赖性扫描可以在筛查的同时实现通过碎片离子进行定 性确证的目的。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明；

图1为实例1中样品的全扫描高分辨质谱图；

图2为硫酸的XIC（a）和高分辨质谱鉴定图示（b）；

图3为磷酸的XIC（a）和高分辨质谱鉴定图示（b）；

图4为乳酸的XIC（a）和高分辨质谱鉴定图示（b）；

图5是实例2中的多个样品的样品全扫描高分辨质谱图（a）和酒石酸（b）、 乳酸（c）、柠檬酸（d）和苹果酸（e）的XIC图；

图6是实例2中酒石酸的高分辨质谱图；

图7是实例2中乳酸的高分辨质谱图；

图8是实例2中酒柠檬酸的高分辨质谱图；

图9是实例2中苹果酸的高分辨质谱图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方 案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。

实施例1

一种同时快速筛查鉴定乳制品中多种有机酸的离子色谱-高分辨质谱联用 方法，包括以下步骤：

样品提取：待测乳制品1mL用10mL1％氢氧化钾溶液提取充分混合，在 4℃、12000r/min离心10min。取上清液，待净化；

前处理柱净化：Thermo RP前处理小柱，使用前RP前处理小柱依次用10mL 水、10mL甲醇、10mL水活化；之后再将上清液上样；

收集：弃去RP柱流出的前5mL过滤液，收集后端清液，待测；

上机检测：通过离子色谱-高分辨质谱联用仪对样品进行筛查和鉴定；

色谱条件为：

离子色谱系统：Dionex ICS2000

色谱柱：Dionex IonPac AS19，250mm×2.1mm，2.5μm；

柱温：35℃；

样品室温度：10℃；

进样量：10μL；

流速：0.25mL/min；

流动相：30mMKOH；

分析时间：30min。

质谱条件：

高分辨质谱系统：Thermo LTQ-Orbitrap XL

电喷雾离子源；负离子模式；

喷雾电压：5.00kV

质荷比范围：50-300

毛细管电压：-21.00V

管透镜电压：-128.70V

毛细管温度：350℃；

鞘气(N2)流速：17L/min(即30arb)；

辅助气(N2)流速：8L/min(即10arb)；

扫描模式：Orbitrap检测器全扫描(Full Scan)模式检测；

全扫描的分辨率R=60000。

由Xcalibar软件的XIC manager对样品中各化合物的分子式、保留时间、 一级质谱质荷比和天然同位素分布等信息进行采集。可通过用本方法对几个已 知的具有某种酸的样品做阳性对照，测得数据与该数据进行比对，来进行筛查 和鉴定。或者，用该数据与现有的数据库资源，如中国科学院化合物参考型数 据库等，中的数据来比对。经比对，实施例1得到三种有机酸：硫酸、磷酸、 乳酸。实验结果如图1、图2、图3和图4所示。

图1为实例1中样品的全扫描高分辨质谱图；

图2为硫酸的XIC（a）和高分辨质谱鉴定图示（b）；

图3为磷酸的XIC（a）和高分辨质谱鉴定图示（b）；

图4为乳酸的XIC（a）和高分辨质谱鉴定图示（b）。

实施例2

将28个市购乳制品使用同实施例1的方法进行样品处理、仪器测量、数 据分析，得到4种有机酸：酒石酸、乳酸、柠檬酸和苹果酸的筛查结果。实验 结果如图5～9所示。

图5是实例2中的多个样品的样品全扫描高分辨质谱图（a）和酒石酸（b）、 乳酸（c）、柠檬酸（d）和苹果酸（e）的XIC图；

图6是实例2中酒石酸的高分辨质谱图；

图7是实例2中乳酸的高分辨质谱图；

图8是实例2中酒柠檬酸的高分辨质谱图；

图9是实例2中苹果酸的高分辨质谱图。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并 非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述 说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施 方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动 仍处于本发明的保护范围之列。