人抗凝血酶Ⅲ肝素结合比例检测方法

摘要

本发明公开了一种人抗凝血酶Ⅲ肝素结合比例检测方法，采用高效体积排阻色谱柱，流动相为pH6.0-7.5的异丙醇和磷酸的钠盐缓冲液，通过特征峰面积的比例和相应的标准曲线计算人抗凝血酶Ⅲ与肝素的结合比例；向人抗凝血酶Ⅲ标准品中按比例添加失活的人抗凝血酶Ⅲ，根据特征峰面积比的变化制作标准曲线。本发明方法排除了人为因素，结果的准确度和精确度高；实验操作步骤简单，缩短了检测时间，降低了实验成本，极大地提高了检测人员的工作效率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药检测分析技术领域，特别是涉及一种人抗凝血酶Ⅲ肝素结合比例检测方法。 

背景技术

人抗凝血酶Ⅲ（Human AntithrombinⅢ，AT-Ⅲ）由肝细胞和血管内皮细胞分泌，是一种含糖10%的单链α2糖蛋白，相对分子量为58-64 kD，等电点4.8~5.3，由432个氨基酸残基组成，正常人血浆中抗凝血酶Ⅲ含量为0.12~0.3g/L。它通过抑制凝血酶、FIXa、FXa、FXIa、FXⅡa等活化凝血因子的活性来调节凝血活性，维持血液正常生理平衡。人抗凝血酶Ⅲ制品是一种由健康人血浆纯化得到的血浆蛋白药物，纯度高并保持其天然的生理活性，主要用于治疗先天性或获得性抗凝血酶缺乏症。其临床适应症广泛，是极具潜力的抗凝血药。抗凝血酶Ⅲ的抗凝作用弱且慢，但与肝素结合后，抗凝活性和抗凝作用显著增强。因此抗凝血酶Ⅲ与肝素的结合能力直接影响其生物活性。

人抗凝血酶Ⅲ的分离纯化及病毒灭活工艺（如热处理）会导致少部分人抗凝血酶Ⅲ分子结构发生变化，失去与肝素结合的能力，从而失去活性。因此欧洲药典要求定量检测人抗凝血酶Ⅲ制品中能与肝素结合的分子所占的比例，不能低于60%。欧洲药典提供的检测方法为交联免疫电泳检测法，该方法具有以下缺点：①需要制备或购买兔抗人抗凝血酶Ⅲ抗血清，价格贵，耗时长，操作繁琐困难；②电泳时间长，约20小时；③电泳时温度全程要求控制4℃；④电泳完成后染色脱色困难；⑤琼脂糖电泳凝胶易碎，不易操作；⑥需要手动测量基线、峰高、计算峰面积，主观因素明显，计算结果精度较低；⑦没有相关的试剂盒产品，标准很难实现统一。 

发明内容

本发明目的在于提供一种测定人抗凝血酶Ⅲ与肝素结合比例的方法，克服现有技术中人抗凝血酶Ⅲ与肝素结合比例检测方法和试剂的缺点。

经过纯化的人抗凝血酶Ⅲ制剂是一种纯度较高的蛋白质药物，通过高效体积排阻色谱可以检测到单一的色谱峰；当人抗凝血酶Ⅲ制剂中加入过量肝素时，保持生物活性（与肝素结合的能力）的人抗凝血酶Ⅲ分子会与肝素分子发生可逆的非共价结合，分子量变大，会形成一个保留时间更短的一个色谱峰（峰1），而无法与肝素结合的人抗凝血酶Ⅲ分子（失去生物活性的分子）由于分子量未发生变化而在原位置形成一个色谱峰（峰2）。采用经过优化的色谱条件，包括流动相的选择、缓冲液的调整，可以实现两个色谱峰的基线分离。分别计算两个色谱峰的面积，峰1面积与两峰面积之和的比值代入相应的标准曲线即可计算得到肝素结合比例值（以百分数表示）。

本发明的人抗凝血酶Ⅲ肝素结合比例检测方法技术方案，包括以下步骤：

（1）溶液配制，分别配制缓冲液、流动相、肝素溶液、人抗凝血酶Ⅲ溶液、失活的人抗凝血酶Ⅲ和标准溶液；

（2）向人抗凝血酶Ⅲ标准品中按比例添加失活的人抗凝血酶Ⅲ制备标准溶液，采用高效液相色谱，根据特征峰面积比的变化制作标准曲线； 

（3）将供试品溶液采用高效液相色谱，通过特征峰面积的比例和相应的标准曲线计算人抗凝血酶Ⅲ与肝素的结合比例。

本发明的具体方案为：

①溶液配制

磷酸盐缓冲液：磷酸盐溶液0.1~0.3mol/L，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至6.0~7.5，待用。

流动相：异丙醇:磷酸盐缓冲液=1:99。

肝素溶液：用上述流动相稀释或者溶解肝素钠至一定的浓度，每毫升所含的肝素单位数（IU）应为每毫升待测样品中人抗凝血酶Ⅲ单位数（IU）的30~150倍。

人抗凝血酶Ⅲ溶液：将人抗凝血酶Ⅲ的标准品或供试品用上述流动相稀释或溶解至1~50 mg/ml。人抗凝血酶Ⅲ标准品的肝素结合比例为已知，且不低于90%。取稀释后的供试品溶液与上述配制好的肝素溶液等体积混匀。

失活的人抗凝血酶Ⅲ：将人抗凝血酶Ⅲ标准品中加入Bicine溶液（50mmol/L的Bicine（N-二（羟乙基）甘氨酸），100mmol/L的NaHCO₃，pH 8.3）；再加入10~30mmol/L的三硝基苯磺酸，25℃恒温处理30min；加入20倍体积的Tris缓冲液（50mmol/L Tris–HCl，100mmol/L NaCl，pH7.4）混匀。超滤浓缩后，经过HiPrep Sephacryl S-200 HR分子筛层析柱纯化得到失去活性的单体蛋白。经过HPLC检测单体含量＞95%，不与肝素结合，保留时间与人抗凝血酶Ⅲ标准品一致。

标准溶液：将人抗凝血酶Ⅲ的标准品与已知蛋白浓度的失活人抗凝血酶Ⅲ分别按照不同比例配制（配制后总蛋白含量与待测样品一致）。人抗凝血酶Ⅲ的标准品所占比例在0~100%之间，至少应当有3种不同比例的标准溶液；供试品的肝素结合比例应在标准溶液所覆盖的比例范围之内。将上述配制好的溶液分别与等体积的上述肝素溶液混合均匀。

②高效液相色谱条件

色谱柱：高效体积排阻色谱柱，如TOSOH BIOSCIENCE TSK-GEL G3000SW、TSKgel G3000SWXL、TSK gel SuperSW 3000，或者类似孔径、粒度和柱床高度的产品。

流速：0.2~0.8ml/min。

检测器：UV280nm。

进样量：5~20μL

③高效液相色谱实验

将标准溶液以及供试品溶液依次按照上述色谱条件进行色谱实验。

④图谱处理与结果计算

峰面积积分：采用常规的峰面积积分方法，如HPLC系统软件自动积分的方法，计算峰面积。计算峰面积比A=峰1面积/（峰1面积+峰2面积）。

标准曲线：将准溶液色谱图的峰面积比A值与对应的肝素结合比例（记为B）分别作为X轴与Y轴进行线性回归，得到B=aA+b的回归方程，R²≥0.95。

将供试品的A值代入标准曲线回归方程，即可计算得到供试品的肝素结合比例。

本发明相对于现有技术的优点为：采用HPLC法代替了交联免疫电泳法，方法更为简单、易行、标准化。 

本发明的检测方法有益效果具体如下：

1、制备失活人抗凝血酶Ⅲ单体较兔抗人抗凝血酶Ⅲ血清简单。免去长时间的免疫检测工作。

2、溶液配制及样品处理简单。

3、HPLC检测便捷，短时间内即可得到检测结果。

4、通过HPLC仪器进行自动积分，结果精确度和准确度更高，排除了人为干扰。

5、符合GMP的要求，结果易于保存，不易修改，并实现了检测结果的可追溯性。

附图说明

图1所示为本发明高效体积排阻色谱图。

其中，色谱图a为人抗凝血酶Ⅲ标准品；

色谱图b为失活的人抗凝血酶Ⅲ；

色谱图c为肝素；

色谱图d为人抗凝血酶Ⅲ标准品:失活的人抗凝血酶Ⅲ蛋白浓度比为50:50；

峰1为肝素人抗凝血酶Ⅲ结合体峰；

峰2为人抗凝血酶Ⅲ峰；

峰3为肝素峰。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例１

1. 试剂与样品请见表1所示：

表1

2. 溶液配制：

磷酸盐缓冲液：称量磷酸二氢钠12.0g，溶于950ml纯化水中，用0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH到7.4，用纯化水定容到1L，混匀。

流动相：取上述磷酸盐缓冲液495ml，加入5ml异丙醇，混匀超声波处理30min进行脱气。

肝素溶液：用上述流动相稀释肝素钠注射液至5000IU/ml。

失活的人抗凝血酶Ⅲ：将人抗凝血酶Ⅲ标准品中加入Bicine溶液（50mmol/L的Bicine（N-二（羟乙基）甘氨酸），100mmol/L的NaHCO3，pH 8.3）；再加入10~30mmol/L的三硝基苯磺酸，25℃恒温处理30min；加入20倍体积的Tris缓冲液（50mmol/LTris–HCl，100mmol/L NaCl，pH7.4）混匀。超滤浓缩后，经过HiPrep Sephacryl S-200 HR分子筛层析柱纯化得到失去活性的单体蛋白。经过HPLC检测单体含量＞95%，不与肝素结合，保留时间与人抗凝血酶Ⅲ标准品一致。

标准溶液：将人抗凝血酶Ⅲ的标准品与已知蛋白浓度的失活人抗凝血酶Ⅲ分别按照如表2所示的蛋白含量的比例配制（总蛋白含量与待测样品一致）：

表2

。

3. 样品处理

将供试品用流动相稀释至9mg/ml。稀释后的供试品和上述5种标准溶液分别与上述肝素溶液等体积混合均匀（人抗凝血酶Ⅲ：肝素活性比为1：100），37℃孵育10分钟。

4. 高效液相色谱条件

使用高效体积排阻色谱柱，TOSOH BIOSCIENCE TSK-GEL G3000SW，流速：0.6ml/min用流动相预平衡1h。检测器波长设定为UV280nm。处理好的供试品与标准溶液依次进样，每次进样量10μL。每次进样后设定洗脱时间1h。供试品进样5次，作为平行试验。

5. 结果计算：

峰面积积分：采用Waters HPLC系统的Breeze2.0软件，自动积分计算峰面积。计算峰面积比A=峰1面积/（峰1面积+峰2面积）。

标准曲线：将5种标准溶液色谱图的峰面积比A值与对应的理论肝素结合比例（记为B）分别作为X轴与Y轴进行线性回归，得到B=aA+b的回归方程。将供试品的A值代入标准曲线回归方程，即可计算得到供试品的肝素结合比例。

具体结果如表3所示：

表3

6. 交联免疫电泳检测法检测供试品：

按照《欧洲药典》（EP7.5）规定的交联免疫电泳方法具体步骤测定供试品，平行测定5次：

交联免疫电泳：用巴比妥电泳缓冲液（pH8.4，含有15IU/ml的肝素）配制10g/L的琼脂糖凝胶，在5cm×5cm的玻璃板上倾倒5ml融化的凝胶，4℃冷却30min。在凝胶的相邻两个角距离边缘各1cm的地方分别打一个洞，直径2mm。一个孔加入稀释到1IU/ml的待测人抗凝血酶Ⅲ供试品5μL，另一个孔加入5μL溴酚蓝作为指示剂，在7v/cm电压下，电泳直至指示剂迁移至末端，电泳过程中温度保持4℃以下。保留供试品1.5cm×5cm的电泳区域，切除其余的凝胶，余下的空间倾倒3.5ml新配制的含有5%的兔抗人抗凝血酶Ⅲ抗血清的凝胶（10g/L琼脂糖，pH8.4的巴比妥电泳缓冲液），冷却凝固后与原来余下的凝胶完全接合，将凝胶调转90°，设定2v/cm的电压进行第二维电泳，约16h。

染色：将凝胶用浸透生理氯化钠溶液的滤纸包裹，压紧2h，不断更换新滤纸，使凝胶中未反应的抗血清完全扩散出来，用酸性蓝92染色并脱色，凝胶上出现两个沉淀峰。

结果计算：计算靠近阳极的峰面积占所有沉淀峰面积之和的比例（手动积分），即为供试品的肝素结合比例。结果统计如表4所示：

表4

。

7. 两种测定方法的比较：

两种测定方法（本发明提供的方法与欧洲药典提供的方法）的测定结果经过单因素方差分析，结果表明两种检测方法对同一供试品的检测结果没有显著差异（89.16%±1.37% VS 90.26%±9.21%），这说明本发明提供的方法测定结果与欧洲药典提供的交联免疫电泳法结果一致。但本发明提供的方法多次检测结果的变异系数（CV）远小于欧洲药典提供的交联免疫电泳法（1.54% VS10.20%），有更好的精确度。

实施例2：

1. 试剂与样品如表5所示：

表5

2. 溶液配制：

磷酸盐缓冲液：称量磷酸二氢钠20.0g，溶于950ml纯化水中，用0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH到6.4，用纯化水定容到1L，混匀。

流动相：取上述磷酸盐缓冲液495ml，加入5ml异丙醇，混匀超声波处理30min进行脱气。

肝素溶液：用上述流动相稀释肝素钠注射液至2000IU/ml。

失活的人抗凝血酶Ⅲ：将人抗凝血酶Ⅲ标准品中加入Bicine溶液（50mmol/L的Bicine（N-二（羟乙基）甘氨酸），100mmol/L的NaHCO₃，pH 8.3）；再加入10~30mmol/L的三硝基苯磺酸，25℃恒温处理30min；加入20倍体积的Tris缓冲液（50mmol/LTris–HCl，100mmol/L NaCl，pH7.4）混匀。超滤浓缩后，经过HiPrep Sephacryl S-200 HR分子筛层析柱纯化得到失去活性的单体蛋白。经过HPLC检测单体含量＞95%，不与肝素结合，保留时间与人抗凝血酶Ⅲ标准品一致。

标准溶液：将人抗凝血酶Ⅲ的标准品与已知蛋白浓度的失活人抗凝血酶Ⅲ分别按照表6所示蛋白含量的比例配制（总蛋白含量与待测样品一致）：

表6

。

3. 样品处理

将供试品用流动相稀释至9mg/ml。稀释后的供试品和上述5种标准溶液分别与上述肝素溶液等体积混合均匀（人抗凝血酶Ⅲ：肝素活性比为1：40），37℃孵育10分钟。

4. 高效液相色谱条件

使用高效体积排阻色谱柱，TOSOH BIOSCIENCE TSK-GEL G3000SW，流速：0.6ml/min用流动相预平衡1h。检测器波长设定为UV280nm。处理好的供试品与标准溶液依次进样，每次进样量10μL。每次进样后设定洗脱时间1h。供试品进样5次，作为平行试验。

5. 结果计算：

峰面积积分：采用Waters HPLC系统的Breeze2.0软件，自动积分计算峰面积。计算峰面积比A=峰1面积/（峰1面积+峰2面积）。

标准曲线：将5种标准溶液色谱图的峰面积比A值与对应的理论肝素结合比例（记为B）分别作为X轴与Y轴进行线性回归，得到B=aA+b的回归方程。将供试品的A值代入标准曲线回归方程，即可计算得到供试品的肝素结合比例。

具体结果如表7所示：

表7

6. 交联免疫电泳检测法检测供试品：

按照《欧洲药典》（EP7.5）规定的交联免疫电泳方法具体步骤测定供试品，平行测定5次：

交联免疫电泳：用巴比妥电泳缓冲液（pH8.4，含有15IU/ml的肝素）配制10g/L的琼脂糖凝胶，在5cm×5cm的玻璃板上倾倒5ml融化的凝胶，4℃冷却30min。在凝胶的相邻两个角距离边缘各1cm的地方分别打一个洞，直径2mm。一个孔加入稀释到1IU/ml的待测人抗凝血酶Ⅲ供试品5μL，另一个孔加入5μL溴酚蓝作为指示剂，在7v/cm电压下，电泳直至指示剂迁移至末端，电泳过程中温度保持4℃以下。保留供试品1.5cm×5cm的电泳区域，切除其余的凝胶，余下的空间倾倒3.5ml新配制的含有5%的兔抗人抗凝血酶Ⅲ抗血清的凝胶（10g/L琼脂糖，pH8.4的巴比妥电泳缓冲液），冷却凝固后与原来余下的凝胶完全接合，将凝胶调转90°，设定2v/cm的电压进行第二维电泳，约16h。

染色：将凝胶用浸透生理氯化钠溶液的滤纸包裹，压紧2h，不断更换新滤纸，使凝胶中未反应的抗血清完全扩散出来，用酸性蓝92染色并脱色，凝胶上出现两个沉淀峰。

结果计算：计算靠近阳极的峰面积占所有沉淀峰面积之和的比例（手动积分），即为供试品的肝素结合比例。结果统计如表8所示：

表8

。

7. 两种测定方法的比较：

两种测定方法（本发明提供的方法与欧洲药典提供的方法）的测定结果经过单因素方差分析，结果表明两种检测方法对同意供试品的检测结果没有显著差异（91.49%±0.61% VS 90.26%±9.21%），这说明本发明提供的方法的测定结果与欧洲药典提供的交联免疫电泳法结果一致。但本发明提供的方法多次检测结果的变异系数（CV）远小于欧洲药典提供的交联免疫电泳法（0.67% VS10.20%），有更好的精确度。