一种建立类风湿性关节炎动物模型的诱导剂及其制备与应用

摘要

本发明公开了一种建立类风湿性关节炎动物模型的诱导剂及其制备与应用。所述诱导剂包括II型胶原、氢氧化铝、冰乙酸和完全弗氏佐剂，可以成功构建类风湿性关节炎动物模型，且可显著加强免疫反应，还可以使关节炎症状维持更长的时间，使动物模型的临床症状和病理学改变更接近真实的类风湿性关节炎。所述诱导剂的制备方法操作简单，便于推广应用。所述诱导剂用于建立类风湿性关节炎动物模型，简单易行，安全，稳定可靠性好，造模成功率高，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种建立类风湿性关节炎动物模型的诱导剂及其制备与应用。

技术背景

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以对称性多关节炎为主要临床表现的慢性自身免疫性疾病，我国的患病率为0.32%-0.36%，是造成劳动力丧失与残疾的主要疾病之一。

RA是一种侵犯全身多个关节，病理学特征是关节内滑膜炎，早期为滑膜充血，滑膜疏松，慢性炎症新生纤维血管组织大量增加，导致滑膜不规则增厚，绒毛肥厚突入关节腔内形成血管翳，进而侵蚀破坏关节骨皮质和软骨组织，终致关节强直、畸形和功能丧失；病程呈慢性、进行性、侵袭性,不及时治疗，病情进展迅速，并且关节畸形是一种不可逆性的损害。其发病机制十分复杂，迄今尚未完全阐明。

国内外对RA进行了大量的动物实验研究，并形成了一些较为成熟的动物模型：

（1）佐剂性关节炎（AA）模型，该法属于急性应激反应，缺乏慢性病理过程，病变具有一定的自限性。

（2）胶原性（CIA）关节炎模型，具有典型的关节炎体征，发病率比单独使用弗氏完全佐剂注射显著提高，且CIA模型临床症状、病理学改变等类似RA。

（3）卵蛋白诱导的关节炎模型，该模型成功率虽高，但在免疫学指标及病程特点与RA具有一定差异。

（4）病症结合模型，该模型尚不完善，症候属性评价困难，稳定性、可靠性差等问题，而不被临床基础研究采纳。

综上，CIA模型是研究和筛选治疗RA药物的理想模型，也是美国食品药品监督管理局用于治疗RA药物筛选的动物模型。

II型胶原（CII）是目前较为公认的关节软骨特异性抗原，与软骨破坏相关的单核因子白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌异常，是骨关节发病的中心环节。

由于实验条件的限制，以往研究CIA模型的动物实验对象一般限于大鼠、小鼠等，而灵长类动物相对较少，但大鼠等动物毕竟与人类差别巨大。小动物模型不能很好模拟人RA的发病过程和病变程度，不能描述病情的加重和缓解。另外，现有的在构建CIA模型中使用的诱导剂由于免疫反应程度有限，且炎症反应维持时间较短，尚不能很好的模拟类风湿性关节炎的临床症状和病理学改变。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种全新的建立类风湿性关节炎动物模型的诱导剂。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种建立类风湿性关节炎动物模型的诱导剂，所述诱导剂为混合乳剂，包括II型胶原、氢氧化铝、冰乙酸和完全弗氏佐剂。其中II型胶原作为关节软骨特异性抗原，可以诱导类风湿性关节炎相关症状；冰乙酸作为溶剂便于各组分形成均匀的混合乳剂；氢氧化铝和完全弗氏佐剂相互协同，可显著加强免疫反应，同时氢氧化铝还可以使关节炎症状维持更长的时间，使动物模型的临床症状和病理学改变更接近真实的类风湿性关节炎。

作为可选方式，在上述诱导剂中，所述Ⅱ型胶原为牛Ⅱ型胶原。牛Ⅱ型胶原容易获得，且在以恒河猴作为模型动物构建动物模型时采用牛Ⅱ型胶原症状的相似程度更高。

作为可选方式，在上述诱导剂中，所述Ⅱ型胶原终浓度为2-4 mg/ml，氢氧化铝终浓度为0.5-1.5 mg/ml。采用该浓度范围既可以诱导产生足够明显的症状，又避免向模型动物体内引入大量的诱导剂，降低引入诱导剂时动物的痛苦，提高动物福利。

作为可选方式，在上述诱导剂中，所述Ⅱ型胶原终浓度为3 mg/ml，氢氧化铝终浓度为1mg/ml。

本发明还提供了一种制备上述的诱导剂的方法，包括以下步骤：

1）冰乙酸溶液的配制：取冰乙酸，加入双蒸水，稀释成浓度为0.1mol/L的冰乙酸溶液；

2）胶原溶液的配制：将II型胶原加入到步骤1）制得的冰乙酸溶液中，吹打均匀后，4℃冰箱中保存8小时以上，制得II型胶原溶液；

3）胶原乳剂的配制：将步骤2）中制得的Ⅱ型胶原溶液滴加至同等体积完全弗氏佐剂（作为可选方式，所述完全弗氏佐剂的温度控制在4-8℃）中，同时加入氢氧化铝，快速搅拌使其充分乳化， 4℃冰箱保存备用。

作为可选方式，在上述诱导剂的制备方法中，所述步骤2）中II型胶原溶液的浓度为4-8 mg/ml。

本发明还提供了一种建立类风湿性关节炎动物模型的方法，包括以下步骤：

1）背部皮内致敏：选取健康的模型动物，沿其背部皮肤皮下注射本发明所述的诱导剂，每只模型动物中Ⅱ型胶原的注射剂量为1-2mg；

2）饲养和观察40天；

3）获得类风湿性关节炎阳性的动物模型。

作为可选方式，在上述建立类风湿性关节炎动物模型的方法中，所述步骤1）中Ⅱ型胶原的注射剂量为1.5mg。

作为可选方式，在上述建立类风湿性关节炎动物模型的方法中，在所述步骤1）中分多个不同位置的点进行注射，每个点的注射量均在0.2mL以下。一方面使诱导剂多点均匀分布，有利于症状产生，另一方面，降低单个点的注射量，降低动物痛苦，提高动物福利。

作为可选方式，在上述建立类风湿性关节炎动物模型的方法中，选取非人灵长类恒河猴作为模型动物，2-5岁，使用时体重范围：2.5-4.0kg。恒河猴与人类同属灵长类，其生物学特性与人类相近，根据本发明的模型验证试验，恒河猴CIA模型临床表现，病理等与人RA相似，表现出慢性关节炎症和骨破坏，可同时评价抗炎、骨保护方面的调控作用。采用本发明所述的方法建立的类风湿性关节炎动物模型，实验猴表现出胶原性关节炎（CIA）模型的主要病变特征：注射诱导剂后D12-D15,出现炎症反应, 背部注射部位皮肤溃烂出血，临床表现为采食速度减慢，体重降低、双足行为异常D15-D25，病程发展迅速，行动迟缓且不喜攀爬继而指关节红肿，血清学指标异常（CPR、NEUT显著升高； ALB显著降低）；D20-D40，关节严重肿胀，行动迟缓僵硬，不能自主采食,需人工喂食等症状出现。采用本方法构建的恒河猴胶原性关节炎（CIA）模型的Ｘ线征象与临床RA相似，双手和双足掌指关节（MCP）/跖趾关节和近段指关节（PIP）/近段趾关节出现初期或中期病变特征，表现受累关节周围软组织肿胀、局限性骨质疏松、关节间隙狭窄和骨质侵蚀以关节边缘骨质侵蚀最具有特异性，病变以手或足远端、近端指间关节为主，其中足关节破坏先于手关节。随后继续观察至D40，关节严重肿胀，类风湿性关节炎模型成功建立。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1. 本发明所述诱导剂可以成功构建类风湿性关节炎动物模型，且可显著加强免疫反应，还可以使关节炎症状维持更长的时间，使动物模型的临床症状和病理学改变更接近真实的类风湿性关节炎。

2. 所述诱导剂的制备方法操作简单，便于推广应用。

3. 所述建立类风湿性关节炎动物模型的方法,简单易行，安全，稳定可靠性好，造模成功率高，具有良好的应用前景，对动物伤害小，且症状与真实的类风湿性关节炎相似程度高，表现出慢性关节炎症和骨破坏，所得模型可同时评价抗炎、骨保护方面的调控作用。

4. 通过建立类风湿性关节炎灵长类动物模型，可以用来研究RA的发病机制，筛选骨保护药物，探索药物作用原理，甚至评价相关药物对该种疾病的调控作用和作用机制，具有十分重要的意义。

附图说明：

图1为实施例5中实验组3对应动物与炎症相关的血液学及生化指标分析结果。

图2为实施例5中实验组3对应动物手指关节免疫前后检查结果，A、B为免疫前后手指形貌图;C、D分别为免疫前后手指X射线图。

图3为实施例5中实验组3对应动物足部关节免疫前后检查结果，A、B为免疫前后足部形貌图;C、D分别为免疫前后足部X射线图。

图4为实施例5中实验组3对应动物关节病变切片图，其中（A，HE染色，放大倍数为10）表征滑膜细胞绒毛状增生，伴炎细胞浸润（←）；（B, HE染色，放大倍数为10）表征关节软骨表面损伤和局部纤维化（→）。（C, HE染色，放大倍数为5）表征皮下炎症病变：软骨表面和骨组织糜烂。（D, HE染色，放大倍数为20）表征软骨炎症病变：软骨表面被破坏，为成纤维细胞所替代。。

图5为本发明所述诱导剂的制备流程图。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。以下实施例中所用原料均可以从市场上购得。

实施例1 制备诱导剂（制备流程如图5所示）

1）配制冰乙酸溶液：取冰乙酸，加入双蒸水，稀释成浓度为0.1mol/L的冰乙酸溶液；

2）配制胶原溶液：将II型胶原加入到步骤1）制得的冰乙酸溶液中，吹打均匀后，4℃冰箱中保存8小时以上，制得II型胶原溶液，所述II型胶原可以是牛、猪、人等常用的II型胶原；

3）配制胶原乳剂：将步骤2）中制得的Ⅱ型胶原溶液滴加至同等体积完全弗氏佐剂（作为可选方式，所述完全弗氏佐剂的温度控制在4-8℃）中，同时加入氢氧化铝，快速搅拌使其充分乳化， 获得含有II型胶原、氢氧化铝、冰乙酸和完全弗氏佐剂的混合乳剂，4℃冰箱保存备用。

实施例2制备诱导剂

1）配制冰乙酸溶液：取冰乙酸，加入双蒸水，稀释成浓度为0.1mol/L的冰乙酸溶液；

2）配制胶原溶液：将II型胶原加入到步骤1）制得的冰乙酸溶液中，配制成胶原溶液的浓度为4mg/ml的 II型胶原溶液，吹打均匀后，4℃冰箱中保存8小时；

3）配制胶原乳剂：将步骤2）中制得的Ⅱ型胶原溶液滴加至同等体积完全弗氏佐剂（作为可选方式，所述完全弗氏佐剂的温度控制在4℃左右）中，同时加入氢氧化铝，快速搅拌使其充分乳化， 获得含有II型胶原、氢氧化铝、冰乙酸和完全弗氏佐剂的混合乳剂，其中Ⅱ型胶原终浓度为2 mg/ml，氢氧化铝终浓度为0.5 mg/ml，4℃冰箱保存备用。

实施例3 制备诱导剂

1）配制冰乙酸溶液：取冰乙酸，加入双蒸水，稀释成浓度为0.1mol/L的冰乙酸溶液；

2）配制胶原溶液：将II型胶原加入到步骤1）制得的冰乙酸溶液中，配制成胶原溶液的浓度为8mg/ml的 II型胶原溶液，吹打均匀后，4℃冰箱中保存12小时；

3）配制胶原乳剂：将步骤2）中制得的Ⅱ型胶原溶液滴加至同等体积完全弗氏佐剂（作为可选方式，所述完全弗氏佐剂的温度控制在4℃左右）中，同时加入氢氧化铝，快速搅拌使其充分乳化， 获得含有II型胶原、氢氧化铝、冰乙酸和完全弗氏佐剂的混合乳剂，其中Ⅱ型胶原终浓度为4 mg/ml，氢氧化铝终浓度为1.5 mg/ml，4℃冰箱保存备用。

实施例4 制备诱导剂

1）配制冰乙酸溶液：取冰乙酸，加入双蒸水，稀释成浓度为0.1mol/L的冰乙酸溶液；

2）配制胶原溶液：将牛II型胶原加入到步骤1）制得的冰乙酸溶液中，配制成胶原溶液的浓度为6mg/ml的 II型胶原溶液，吹打均匀后，4℃冰箱中保存12小时；

3）配制胶原乳剂：将步骤2）中制得的Ⅱ型胶原溶液滴加至同等体积完全弗氏佐剂（作为可选方式，所述完全弗氏佐剂的温度控制在4℃左右）中，同时加入氢氧化铝，快速搅拌使其充分乳化， 获得含有II型胶原、氢氧化铝、冰乙酸和完全弗氏佐剂的混合乳剂，其中Ⅱ型胶原终浓度为3 mg/ml，氢氧化铝终浓度为1 mg/ml，4℃冰箱保存备用。

实施例5 类风湿性关节炎动物模型的建立

动物的选取

选取非人灵长类恒河猴作为模型动物，3-5岁，使用时体重范围：2.5-4.0kg。同时采用项圈挂牌标号和个体动物编号。

（1）动物入选前以下项目检查：二次结核杆菌试验、粪便寄生虫检查和体检等，剔除不适合进行试验的动物。检查报告包括临床检查和实验室检查内容，均参照国家标准执行。

（2）动物入选后的检疫驯化，共1周，内容如下：

i. 动物外观健康检查，内容主要包括：观察动物的外表、体形、行动、体温、呼吸、被毛、鼻、口、眼、耳、生殖器、尿、粪便等。

ii.对动物的寄生虫、细菌和微生物进行检测：包括动物体内病原菌、病毒检查，体内外寄生虫检查。

iii. 检疫驯化期间每天上、下午共两次对检疫动物进行观察，内容主要包括：动物外观、粪便、摄食情况等。

模型的建立 

选取符合要求的健康恒河猴作为模型动物，按表1进行实验分组，每组5只，沿其背部皮肤皮下分10个不同位置注射本发明所述的诱导剂，每个位置的注射量均控制在0.2mL以下；

 表1 实验分组情况表

组别实验组1实验组2实验组3实验组4实验组5对比组1对比组2胶原剂量（mg）1.51.51.5121.51.5诱导剂实施例2制备实施例3制备实施例4制备实施例4制备实施例4制备CII+完全弗氏佐剂CII

饲养观察

在非屏障系统环境饲养与观察40天，饲料常规营养成分测定：饲料供应商提供，确定在规定的标准范围之内（参照中华人民共和国国家标准GB14924.8-2001）。

诊断模式评价方法及结果

包括血清生化标志物及血液学检查、X线影像诊断、病理学检查等。其中第3实验组的各项测试结果最佳，症状最接近RA，且维持时间最长。以下仅以第3实验组的观察结果进行说明。

1、血清生化标志物及血液学检查因子主要包括中性粒细胞百分率（NEUT）、C反应蛋白（CRP）、白蛋白（ALB）等。

血液学检查和血清生化标志物检查时间为在检疫期1次，注射胶原后每周1次。血液学检查使用仪器为，Sysmex XT-2000i型五分类血液细胞分析仪。血清生化标志物使用仪器为：贝克曼库尔勒全自动生化分析仪model：SYNCHRON CX4 PRO。

测试结果显示：

组胶原诱导前（D0）CRP、ALB、NEUT均为恒河猴正常值范围；（见图1）胶原诱导前（D0） CRP 为处于正常水平（＜1mg/L），D7时CRP显著升高（69mg/L），D 21-D40时，CPR急剧升高（＞160 mg/L）；同时可见注射胶原D7-D40，ALB持续下降，中性粒细胞百分率显著升高；注射胶原D35，ALB仅为12.2 g/L、中性粒细胞百分率上升至79.9%。

2、X射线影像诊断

注射胶原后23-25天照射X光；。使用设备为Philips全方位多功能单板数字化成像系统，型号为Digital Diagnost VM 。

影像诊断要点：1关节软组织肿胀；2关节间隙变窄、关节面边缘骨侵蚀；3骨性关节面下骨质小囊状破坏；4骨质疏松；5关节畸形和关节强直。骨侵蚀开始于关节软骨的边缘，即边缘性侵蚀，为RA早期重要征象。

RA基本Ｘ线征象：关节周围软组织肿胀、局限性骨质疏松、关节间隙狭窄和骨质侵蚀，以关节边缘骨质侵蚀最具有特异性。

手1-5近端指间关节骨质增生、硬化，关节面骨质破坏，关节间隙显示模糊，明显狭窄，周围软组织阴影轻度肿胀增厚，关节间隙未见明显狭窄（见图2）。足2-5近趾关节骨质增生、硬化，关节面骨质破坏，关节间隙明显狭窄，周围软组织轻度肿胀，2-5远趾关节关节间隙显示模糊，关节面骨质可疑破坏，关节间隙未见明显狭窄（见图3）。

 3、病理组织学分析

根据X射线和其他项目检查结果,胶原诱导D40，处于安乐死，取动物病变四肢关节完成病理学检查。

组织经4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定，然后用甲酸盐酸脱钙液脱钙完全后，病理取材、脱水、石蜡包埋、切5um薄片、HE染色，显微镜观察并拍照。

关节炎病理病变：关节可见关节浅层透明软骨被破坏，为纤维结缔组织替代；关节囊下组织大量炎细胞浸润。

滑膜炎病变：（图4-A和4-B, HE×10）滑膜细胞绒毛状增生，伴炎细胞浸润（                                                ）。关节软骨表面损伤，局部纤维化（）。

皮下炎症病变：（图4-C,HE×5）软骨表面和骨组织糜烂。

软骨炎症病变：（图4-D,HE×20）软骨表面被破坏，为成纤维细胞所替代。

综上所述，本发明制备的类风湿性关节炎动物模型建模成功，稳定性好，可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价。

在本实施例中，实验组1-5的造模成功率均为100%，各实验组组内差异极小，组间在症状持续时间上有不同程度的差异，实验组1、2、4、5的症状持续时间在1个月左右，实验组3的症状持续时间能够达到2个月。但各实验组的均能成功地模拟类风湿性关节炎的临床症状和表型。其中以实验组3的综合效果最佳。对比组1、2与各实验组相比症状相似程度明显较差，免疫反应较弱，症状持续时间短，且造模成功率较低约为30%以下。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。