一种富集丹参中二萜醌类有效成分的泡腾片及其富集方法

摘要

本发明公开了一种富集丹参中二萜醌类有效成分的泡腾片：按质量比2∶1分别取NaH

说明书

技术领域

本发明属于天然药物提取制备领域。它涉及一种中药提取富集方法，具体地说，它涉及 由杂化介孔材料作为吸附剂，与NaH₂PO₄和Na₂CO₃一同研磨混匀后压制成泡腾片，用于提 取、富集中药丹参及其制剂中二萜醌类有效成分的新方法。

背景技术

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎。丹参味苦，气微寒，无 毒。根据中医上的表述，丹参入心、脾二经，专调经脉，理骨筋酸痛，可活血通经、排脓生 肌，去恶血，生新血。现代研究表明，丹参对高血压、冠心病、高血脂有非常好的疗效，用 于心、血管疾病的治疗，同时对糖尿病也有一定的疗效。

目前市场上丹参制剂种类繁多，应用广泛，常见的制剂包括丹参酮胶囊、复方丹参滴丸、 复方丹参片等。

丹参药材本身可通经止痛，活血祛瘀，凉血消痛，清心除烦。可用于月经不调，痛经经 闭，疮疡肿痛，胸痹心痛，脘腹胁痛，症瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠。其常见的药材制剂 丹参酮胶囊可抗菌消炎，用于外伤感染，烧伤感染，乳腺炎，蜂窝组织炎，骨髓炎，座疮， 外耳道炎、疖、痈等。而复方丹参滴丸和复方丹参片则可活血化瘀，理气止痛，用于冠心病、 心绞痛，气滞血瘀所致的胸痹，心前区刺痛、症见胸闷等。

丹参中除了水溶性的酚酸成分和脂溶性的二萜类成分，还包括二萜醌类，三萜类，甾醇 等。二萜醌类成分包括一些代表性成分诸如二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮II_A等。

天然产物的分析，其样品预处理环节占有举足轻重的地位。分析结果的灵敏度和准确度 将很大程度上受到样品预处理好坏的影响。在传统领域，溶剂萃取法仍然是样品分离富集最 常用的方法，这类分离富集方法存在用量多、溶剂毒性大、费时、环境污染严重等缺点。为 了符合绿色环保概念，提倡绿色化学并同时提高分离富集效率，新的分离富集技术也就应运 而生，层出不穷。

目前较为先进的中药分离富集方法包括超临界流体萃取法、分子印迹技术、膜富集技术、 顶空萃取法、固相微萃取法、分子蒸馏及其耦合技术等。但这类分离富集方法大多需要一定 的仪器来支持，这就使得这些方法很难得以普及，难以走进寻常实验室的大门，而且对操作 人员的要求也较高，不但需要具备相关的专业知识背景，更需要对仪器有熟练的掌握应用经 验。

泡腾富集技术，是指将两种在固体状态下不发生化学反应的无机盐研磨压成片状，在水 溶液中二者通过酸碱离子反应释放出气体，气体在溶液中的冒泡行为成为溶液搅动的动力源， 无需外加任何搅拌混合仪器，只需静置等候泡腾过程结束，即可使吸附剂在稀释液中分散并 且完成样品吸附过程。目前，泡腾富集技术在中药及天然产物的分离富集领域中尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于寻求一种比以往富集方法更加高效便捷无毒害的技术，用于提取富集 天然产物中的活性成分。发明要点在于将无机盐混合物压成片，巧妙地结合了泡腾技术和介 孔材料的高效吸附性。无机盐酸碱反应生成的二氧化碳作为泡腾富集的动力源，使样品溶液 产生回流，使得介孔材料与稀释液中的丹参二萜醌类有效成分得以充分接触并吸附，最终可 达到上百倍的富集效果。该技术可提取天然产物中的二萜醌类有效成分，可以取得显著的富 集效果。泡腾过程的化学方程式为：

本发明具体提供了一种由杂化介孔材料永久密闭胶束阵列-60（Permanent Confined Micell  Arrays-60，本文以下简称PCMA-60）或永久密闭胶束阵列-30（Permanent Confined Micell  Arrays-30，本文以下简称PCMA-30）、NaH₂PO₄和Na₂CO₃制成的富集泡腾片，可用于泡腾富 集丹参药材以及制剂中的二萜醌类有效成分。

本发明采用的技术方案是：

一种富集丹参中二萜醌类有效成分的泡腾片，所述二萜醌类有效成分为二氢丹参酮I、丹 参酮I、隐丹参酮或丹参酮II_A中的一种或两种以上，所述泡腾片按以下方法制得：按质量比 2：1分别取NaH₂PO₄和Na₂CO₃，干燥后混合碾碎得混合盐粉末；称取介孔材料和混合盐粉 末按质量比1：7～90混合研磨，所得混合粉末放入压片机压片，制得所述泡腾片；所述介孔 材料为PCMA-30或PCMA-60。

所述NaH₂PO₄和Na₂CO₃干燥通常可在90℃烘箱中干燥2h。

所述介孔材料为PCMA-30或PCMA-60，优选为PCMA-60。

进一步，介孔材料和混合盐粉末的质量比优选为1：11～60，最优选为1：23。

所述泡腾片可用于富集丹参中二萜醌类有效成分，本发明还提供利用所述泡腾片富集丹 参中二萜醌类有效成分的方法，所述方法为：向待富集的含有丹参的稀释液中放入泡腾片， 所述泡腾片的用量是使泡腾片中的介孔材料在稀释液中的质量浓度为0.65mg/mL；泡腾片在 稀释液中反应完全，停止冒泡后，将得到的混合液过滤，滤饼用洗脱剂洗脱，所述洗脱剂为 甲醇、乙腈、乙醇、乙酸乙酯或正己烷，所得洗脱液即为富集了丹参中二萜醌类有效成分的 富集液。

所述方法中，所述混合液过滤可用一次性注射器将混合液吸干，再取一个0.22μm规格的 有机膜过滤器，将注射器内的液体过滤。

所述洗脱剂的pH值可以为5～9，优选为7。

所述洗脱剂优选为乙酸乙酯。

所述洗脱剂的体积用量为以泡腾片中介孔材料的质量计为5～40μL/mg，优选7～10μL/mg， 更优选7.7μL/mg。

所述含有丹参的稀释液包括但不限于含有丹参药材或丹参制剂的稀释液。任何含有丹参 成分的稀释液均可用于本发明，稀释液的pH值可以为3～11，优选为7。

具体的，本发明实施例中，每20mL稀释液按以下方法制得：20μL丹参提取液加水配 成20mL稀释液，pH值3～11，优选为7。但本发明应用不局限于此类稀释液的，其他含有 丹参的稀释液均可用于本发明。

本发明实施例中的丹参提取液可由丹参药材或丹参制剂参照药典2010版进行提取，所述 丹参制剂一般为丹参酮胶囊、复方丹参滴丸或复方丹参片；进一步，所述丹参提取液可按以 下方法之一制得：

（一）丹参药材制备丹参提取液，其制备方法参照药典2010版，具体步骤为：本品粉末 （过三号筛）约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇50mL，称定重量，加热回 流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得丹参 药材提取液。

（二）丹参酮胶囊制备丹参提取液，其制备方法参照药典2010版，具体步骤为：本品粉 末（过三号筛）约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇50mL，称定重量，加 热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得 丹参酮胶囊提取液。

（三）复方丹参滴丸制备丹参提取液，其制备方法参照药典2010版，具体步骤为：本品 20丸（约0.5g），精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇10mL，超声处理（功率120W，频率 40kHz）60分钟使溶解，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得复方丹参滴丸提 取液。

（四）复方丹参片制备丹参提取液，其制备方法参照药典2010版，具体步骤为：本品7 片，研细，精密称定，取约2.0g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞， 称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）60分钟，放冷，再称定重量用甲醇补足减 失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得复方丹参片提取液。

本发明所述介孔材料可按以下方法制得：

28.0g去离子水中加入1.0g3-（三甲氧基硅基）丙基-十八烷基二甲基-氯化铵（TPODAC）， 4.1g正硅酸乙酯（TEOS）和0.60g1，3，5-三甲基苯（TMB）室温下剧烈搅拌15min；再往 其中加入3.0g NaOH溶液（2.0M）；15–30s后，即可看见大量白色沉淀析出。将混合物在25℃ 下继续搅拌2h，后转入水热釜中，保持110℃持续24h。过滤得到的白色沉淀，依次用 150–200mL乙醇和50mL丙酮洗涤，再在60℃真空干燥箱中过夜除去TMB，即得PCMA-60。 PCMA-30的制备方法与PCMA-60操作步骤完全一致，只是在投料时TEOS为3.30g，TMB 为0.30g。上述方法已经在《Yifeng Shi,Bin Li,Peng Wang,Rubal Dua,Dongyuan Zhao, Microporous and Mesoporous Materials155（2012）Pages252-257》中公开。

这是本领域技术人员公知的方法。

所述的富集效果，通过Waters Acquity Uplc H-Class测定丹参药材或制剂中有效成分的含 量来表征该富集方法的有效性。

本发明还提供一种利用泡腾片富集丹参中二萜醌类有效成分的方法，所述二萜醌类有效 成分为二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮或丹参酮II_A中的一种或两种以上，其特征在于所 述方法为：向待富集的含有丹参的稀释液中放入泡腾片，所述泡腾片的用量是使泡腾片中的 介孔材料在稀释液中的质量浓度为0.65mg/mL；泡腾片在稀释液中反应完全，停止冒泡后， 将得到的混合液过滤，滤饼用乙酸乙酯洗脱，所得洗脱液即为富集了丹参中二萜醌类有效成 分的富集液；所述洗脱剂的体积用量为以泡腾片中介孔材料的质量计7～10μL/mg；所述泡腾 片按以下方法制得：按质量比2：1分别取NaH₂PO₄和Na₂CO₃，干燥后混合碾碎得混合盐粉 末；称取介孔材料和混合盐粉末按质量比1：23混合研磨，所得混合粉末放入压片机压片， 制得所述泡腾片；所述介孔材料为PCMA-60。

本发明的优点在于：

1.本发明方法富集环节创意新颖，思路巧妙。首次采用无机盐与介孔材料研磨，后压成 片，用于泡腾富集的技术，将原先主要用于红外测定的压片环节创造性地转移到样品的分离 富集环节，并且应用在天然产物提取富集领域。所采用的无机盐为廉价易得的NaH₂PO₄和 Na₂CO₃，本发明技术的检测限（LOD）和定量限（LOQ）与富集前相比，富集倍数高了130～310 倍。

2.本方法在富集环节无需任何混合、搅拌仪器，无需专业知识背景，更不必需要对专业 设备有熟练的应用经验，只需简单的溶液配制和压片操作，从而大大节约了实验成本，降低 了实验的操作难度，使得该技术能够得到充分的推广应用，真正进入“寻常百姓家”。只要符 合实验操作条件，不论是实验室还是其他场所，都可以开展本发明技术的应用。一片小小的 压片，以极低的成本价格，以极其简单的操作步骤，就能实现上百倍的富集效果。更为巧妙 的是，泡腾过程动力来自生成的气体CO₂，而整个酸碱反应中，CO₂释放过程平缓不剧烈， 却又刚好达到泡腾动力要求，泡腾片全部溶解、停止冒泡即表示富集环节结束，此时介孔材 料已经通过泡腾搅动，已经在稀释液中充分分散，并将目标化合物吸附，可见该富集方法的 便捷与高效。

3.本方法应用范围广泛，无论是丹参的原料药材还是丹参的药物制剂诸如丹参酮胶囊、 复方丹参滴丸、复方丹参片，均能用本发明方法进行分离富集。且本发明所述的测定丹参药 材和丹参制剂这两方面的应用亦属首例。

4.本发明采用的无机盐，以及PCMA-60介孔材料，不仅廉价易得，而且它们均具备一 系列优异突出的的物理化学性质：化学稳定性和热稳定性良好，对人体无毒、不污染环境， 不易燃。这就使得所压成的泡腾片，只要保证外部环境的干燥，可大量压制后用于长期保存， 其性状基本不会改变，符合工业化生产的要求，具有良好的经济效益。

5.本发明提供的实验富集效果高效显著，且操作环境安全，操作步骤简洁明了。

即本发明提供了一种新技术，该技术将无机盐的泡腾技术与介孔材料的特性通过压片技 术巧妙结合起来，能便捷高效地分离富集天然产物中的二萜醌类有效成分。

附图说明

图1为本发明泡腾富集方法的工艺流程图。

图2为考察无机盐不同加入量下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中 不同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

图3为考察介孔材料不同加入量下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参 中不同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

图4为考察不同介孔材料的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的 有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

图5为考察稀释液的不同pH值下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参 中不同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

图6为考察洗脱剂的不同pH值下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参 中不同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

图7为考察不同洗脱剂种类的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同 的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

图8为考察洗脱液不同体积下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不 同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

图9为丹参酮对照品的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成分， 分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B、C图分别代 表不同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集后过滤的滤液；C：富集液。

图10为丹参药材的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成分， 分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B图分别代表不 同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集液。

图11为丹参酮胶囊的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成分， 分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B图分别代表不 同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集液。

图12为复方丹参滴丸的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成 分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B图分别代 表不同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集液。

图13为复方丹参片的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成分， 分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B图分别代表不 同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集液。

具体实施方式

通过以下实例来对本发明所提供的泡腾富集技术进行更为详细的描述。由于其应用范围 广，故具体实施方案也多，下面将结合几个实例的讨论对本发明的内容作进一步的阐述。

本发明实施例中的介孔材料按以下方法制得：

28.0g去离子水中加入1.0g3-（三甲氧基硅基）丙基-十八烷基二甲基-氯化铵（TPODAC）， 4.1g正硅酸乙酯（TEOS）和0.60g1，3，5-三甲基苯（TMB）室温下剧烈搅拌15min。再往 其中加入3.0g NaOH溶液（2.0M）。15–30s后，即可看见大量白色沉淀析出。将混合物在25℃ 下继续搅拌2h，后转入水热釜中，保持110℃持续24h。过滤得到的白色沉淀，依次用 150–200mL乙醇和50mL丙酮洗涤，再在60℃真空干燥箱中过夜除去TMB，即得PCMA-60。 PCMA-30的制备方法与PCMA-60操作步骤完全一致，只是在投料时TEOS为3.30g，TMB 为0.30g。

丹参酮对照品溶液的制备方法参照药典2010版，具体步骤为：分别取二氢丹参酮I、丹 参酮I、隐丹参酮、丹参酮II_A的对照品适量，精密称定，混合置棕色量瓶中，加甲醇制成每 lml含二氢丹参酮I500μg、含丹参酮I500μg、含隐丹参酮500μg、含丹参酮II_A500μg的溶液， 即得丹参酮对照品溶液。

实施例1.考察无机盐不同加入量下的富集效果

1.1取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于 90℃烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

1.2另取5只干净的玻璃研钵，编号1、2、3、4、5，其中1号研钵中加入150mg混合盐 粉末，2号研钵中加入225mg混合盐粉末，3号研钵中加入300mg混合盐粉末，4号研钵中 加入375mg混合盐粉末，5号研钵中加入450mg混合盐粉末。1-5号研钵中均加入称取好的 13mg PCMA-60，后将1-5号研钵内混合物再次研磨均匀，分别将1-5号研钵内研磨后的混合 粉末放入压片机压成片，即得富集所用泡腾片，对应研钵将泡腾片编号为1、2、3、4、5。

1.3取5个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2、3、4、5，每个锥形瓶中加入 20mLpH=7的水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

1.4往1-5号锥形瓶中根据对应的编号放入1-5号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡。取5个20mL规格的一次性注射器，对应锥形瓶编号1、2、3、4、5，并且根据对 应的编号完全吸取锥形瓶内液体。

1.5取5个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-5号注射器编号为1、2、3、4、5，并根 据对应的编号，用过滤器将注射器内的液体过滤，后用500μL甲醇对每个过滤器的滤饼经行 洗脱，取5个1.5mL规格的离心管，对应过滤器编号1、2、3、4、5，将洗脱液根据对应的 编号转入1-5号离心管中。

1.6将1-5号离心管在13000rpm下离心5min，取5个进样瓶，对应离心管编号1、2、3、 4、5，并根据编号，对应离心管的编号将上清液装入5个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析。

UPLC色谱条件为：

色谱柱：BEH C18，1.7μm，2.1×50mm（Waters），检测波长：270nm， 柱温：30℃，进样量：1.0μL，流速0.4mL/min，流动相：A：水，B：甲醇。梯度洗脱：0～1min， 50%～72%B；1～7min，72%～75%B；7～8min，75%～100%B；8～9min，100%～100%B；9～10min， 100%～50%B。

实验结果如下表1，表1中的数据为峰面积。

表1

图2显示了无机盐不同加入量下的富集效果折线图。图2中，1、2、3、4分别代表丹参 中不同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

从上述数据可以发现，随着混合盐用量增加，峰面积增大，从150mg增加到225mg再到 300mg时，峰面积达到最大值，之后随着混合盐用量增加，峰面积减小，如375mg开始变小， 在375mg之后数据开始趋于平稳。可能原因为，随着盐用量的增加，二氧化碳产生量增多， 稀释液的动力源增加，而到了一定程度，再多的气泡已经达到所需的动力，故而趋向平稳。 故对13mg介孔材料用量，300mg混合盐（200mg NaH₂PO₄和100mgNa₂CO₃）为最佳条件。 实施例2.考察介孔材料不同加入量下的富集效果

2.1取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于 90℃烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

2.2取5只干净的玻璃研钵，编号1、2、3、4、5，其中1号研钵中加入5mg PCMA-60，2 号研钵中加入9mg PCMA-60，3号研钵中加入13mg PCMA-60，4号研钵中加入17mg PCMA-60，5号研钵中加入21mg PCMA-60。1-5号研钵中均加入研磨好的300mg混合盐粉 末（200mg NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将1-5号研钵内混合物再次研磨均匀，分别将1-5 号研钵内研磨后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用泡腾片，对应研钵将泡腾片编 号为1、2、3、4、5。

2.3取5个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2、3、4、5，每个锥形瓶中加入 20mLpH=7的水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

2.4往1-5号锥形瓶中根据对应的编号放入1-5号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡，此时介孔材料浓度分别为0.25mg/mL、0.45mg/mL、0.65mg/mL、0.85mg/mL、 1.05mg/mL。取5个20mL规格的一次性注射器，对应锥形瓶编号1、2、3、4、5，并且根据 对应的编号吸干锥形瓶内液体。

2.5取5个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-5号注射器编号为1、2、3、4、5，并根 据对应的编号，用过滤器将注射器内的液体过滤，后用500μL甲醇对每个过滤器的滤饼经行 洗脱，取5个1.5mL规格的离心管，对应过滤器编号1、2、3、4、5，将洗脱液根据对应的 编号转入1-5号离心管中。

2.6将1-5号离心管在13000rpm下离心5min，取5个进样瓶，对应离心管编号1、2、3、 4、5，并根据编号，对应离心管的编号将上清液装入5个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析。

实验结果如下表2，表2中的数据为峰面积。

表2.

图3显示了介孔材料不同加入量下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参 中不同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

从上述数据可知，随着介孔材料用量的增加，富集效果呈现上升趋势，并且在13mg达 到最大值，随后再增加介孔材料之后，趋势趋向平稳。可能的原因，随着介孔材料用量的增 加，更多的活性成分被吸附，而等达到要吸附绝大部分活性成分所需求的介孔材料量的时候， 再增加介孔材料量则显得浪费，因为加入量已经满足吸附绝大多数活性成分的需求，此时加 入介孔材料显得多余，故最优组为加入13mg介孔材料PCMA-60，即介孔材料浓度为 0.65mg/mL。

实施例3.考察不同介孔材料的富集效果

3.1取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于 90℃烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

3.2取2个干净的玻璃研钵，编号1、2，其中1号研钵中加入13mg PCMA-60，2号研钵 中加入13mg PCMA-30。1-2号研钵中均加入研磨好的300mg混合盐粉末（200mg NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将1-2号研钵内混合物再次研磨均匀，分别将1-2号研钵内研磨后的混 合粉末放入压片机压成片，即得富集所用泡腾片，对应研钵将泡腾片编号为1、2。

3.3取5个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2，每个锥形瓶中加入20mLpH=7 的水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

3.4往1-2号锥形瓶中根据对应的编号放入1-2号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡，此时介孔材料浓度均为0.65mg/mL。取2个20mL规格的一次性注射器，对应锥 形瓶编号1、2，并且根据对应的编号吸干锥形瓶内液体。

3.5取2个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-2号注射器编号为1、2，并根据对应的编 号，用过滤器将注射器内的液体过滤，后用500μL甲醇对每个过滤器的滤饼经行洗脱，取2 个1.5mL规格的离心管，对应过滤器编号1、2，将洗脱液根据对应的编号转入1-2号离心管 中。

3.6将1-2号离心管在13000rpm下离心5min，取2个进样瓶，对应离心管编号1、2，并 根据编号，对应离心管的编号将上清液装入2个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC）进样分 析。

实验结果如下表3，表3中的数据为峰面积。

表3.

柱状图图4所示：

图4显示了不同介孔材料的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的 有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

上述数据说明，PCMA-60的富集效果比PCMA-30的富集效果好，而且反应在色谱图上， PCMA-60的峰宽更加纤细，峰高更高。

实施例4.考察稀释液不同pH值下的富集效果

4.1取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于 90℃烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

4.2取5只干净的玻璃研钵，编号1、2、3、4、5，1-5号研钵中均加入13mg PCMA-60 和研磨好的300mg混合盐粉末（200mg NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将1-5号研钵内混合 物再次研磨均匀，分别将1-5号研钵内研磨后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用 泡腾片，对应研钵将泡腾片编号为1、2、3、4、5。

4.3取5个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2、3、4、5，1号锥形瓶中加入 20mL pH=3的水，2号锥形瓶中加入20mL pH=5的水，3号锥形瓶中加入20mL pH=7的水， 4号锥形瓶中加入20mL pH=9的水，5号锥形瓶中加入20mL pH=11的水，1-5号锥形瓶中均 扣除20μL水，再加入丹参酮对照品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

4.4往1-5号锥形瓶中根据对应的编号放入1-5号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡，此时介孔材料浓度均为0.65mg/mL。取5个20mL规格的一次性注射器，对应锥 形瓶编号1、2、3、4、5，并且根据对应的编号吸干锥形瓶内液体。

4.5取5个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-5号注射器编号为1、2、3、4、5，并根 据对应的编号，用过滤器将注射器内的液体过滤，后用500μL甲醇对每个过滤器的滤饼经行 洗脱，取5个1.5mL规格的离心管，对应过滤器编号1、2、3、4、5，将洗脱液根据对应的 编号转入1-5号离心管中。

4.6将1-5号离心管在13000rpm下离心5min，取5个进样瓶，对应离心管编号1、2、3、 4、5，并根据编号，对应离心管的编号将上清液装入5个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析。

实验结果如下表4，表4中的数据为峰面积。

表4.

图5显示了稀释液中不同pH下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中 不同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

上述数据说明，稀释液在碱性环境会导致富集效果下降，而且反应在色谱图中，隐丹参 酮的色谱峰，峰高较低，峰形难看，故稀释液首先应该排除加碱。其次，稀释液在酸性环境 中的富集效果，相比中性环境，其富集效果并没有显著的提升，反而富集效果比中性环境稍 显逊色，结合色谱图的情况，色谱图与中性环境区别不大，故稀释液在中性环境中更适合， 是最优条件。

实施例5.考察洗脱剂不同pH值下的富集效果

5.1取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于 90℃烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

5.2取5只干净的玻璃研钵，编号1、2、3、4、5，1-5号研钵中均加入13mg PCMA-60 和研磨好的300mg混合盐粉末（200mg NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将1-5号研钵内混合 物再次研磨均匀，分别将1-5号研钵内研磨后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用 泡腾片，对应研钵将泡腾片编号为1、2、3、4、5。

5.3取5个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2、3、4、5，每个锥形瓶中加入 20mLpH=7的水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

5.4往1-5号锥形瓶中根据对应的编号放入1-5号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡，此时介孔材料浓度均为0.65mg/mL。取5个20mL规格的一次性注射器，对应锥 形瓶编号1、2、3、4、5，并且根据对应的编号吸干锥形瓶内液体。

5.5取5个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-5号注射器编号为1、2、3、4、5，并根 据对应的编号，用过滤器将注射器内的液体过滤。1号过滤器用500μL pH=3的甲醇洗脱，2 号过滤器用500μL pH=5的甲醇洗脱，3号过滤器用500μL pH=7的甲醇洗脱，4号过滤器用 500μL pH=9的甲醇洗脱，5号过滤器用500μL pH=11的甲醇洗脱。取5个1.5mL规格的离心 管，对应过滤器编号1、2、3、4、5，将洗脱液根据对应的编号转入1-5号离心管中。

5.6将1-5号离心管在13000rpm下离心5min，取5个进样瓶，对应离心管编号1、2、3、 4、5，并根据编号，对应离心管的编号将上清液装入5个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析。

实验结果如下表5，表5中的数据为峰面积。

表5.

图6显示了洗脱剂不同pH值下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中 不同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

上述数据表明，洗脱剂若在碱性范围内，则富集倍数明显有下降趋势，而且结合色谱图 情况，碱性环境下的色谱图出峰紊乱，保留时间偏移严重，杂峰较多，对照品的出峰响应很 低甚至不出峰，故首先应该排除洗脱剂在碱性范围内的富集情况。其次在酸性环境，富集效 果并没有增大反而有减小的趋势。故中性环境的洗脱剂是最佳条件。

实施例6.考察不同洗脱剂种类的富集效果

6.1取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于 90℃烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

6.2取5只干净的玻璃研钵，编号1、2、3、4、5，1-5号研钵中均加入13mg PCMA-60 和研磨好的300mg混合盐粉末（200mg NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将1-5号研钵内混合 物再次研磨均匀，分别将1-5号研钵内研磨后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用 泡腾片，对应研钵将泡腾片编号为1、2、3、4、5。

6.3取5个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2、3、4、5，每个锥形瓶中加入 20mLpH=7的水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

6.4往1-5号锥形瓶中根据对应的编号放入1-5号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡，此时介孔材料浓度均为0.65mg/mL。取5个20mL规格的一次性注射器，对应锥 形瓶编号1、2、3、4、5，并且根据对应的编号吸干锥形瓶内液体。

6.5取5个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-5号注射器编号为1、2、3、4、5，并根 据对应的编号，用过滤器将注射器内的液体过滤。1号过滤器用500μL甲醇洗脱，2号过滤器 用500μL乙腈洗脱，3号过滤器用500μL乙醇洗脱，4号过滤器用500μL乙酸乙酯洗脱，5 号过滤器用500μL正己烷洗脱。取5个1.5mL规格的离心管，对应过滤器编号1、2、3、4、 5，将洗脱液根据对应的编号转入1-5号离心管中。

6.6将1-5号离心管在13000rpm下离心5min，取5个进样瓶，对应离心管编号1、2、3、 4、5，并根据编号，对应离心管的编号将上清液装入5个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析。

实验结果如下表6，表6中的数据为峰面积。

表6.

图7显示了不同洗脱剂种类的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同 的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

上述数据可知，乙酸乙酯为最佳洗脱剂。在洗脱时候，用20mL的针筒和1mL的针筒， 对于乙酸乙酯区别不大，可能原因是乙酸乙酯性质活泼，挥发性大，宏观表现为：在老远就 能闻到乙酸乙酯的气味，而在远处几乎闻不到甲醇的气味。鉴于乙酸乙酯这活泼的物理性质， 使其在微观行为上也具有特性：在接触到滤头中的滤膜时能够迅速扩散，能迅速在滤膜上面 展开并接触到膜上的标准品，最终将膜上的物质洗脱下来。同样的换成甲醇后，甲醇的扩散 性能不如乙酸乙酯，而是表现为绝大部分随着重力影响直接渗透下去，使得滤头内有些膜面 并未接触到甲醇，标准品依旧残留在滤头中。这一微观推测也反映在宏观事实中：即用甲醇 洗脱之后的滤头，即使换成1mL的针筒去洗脱，仍旧有部分黄色物质残留，而乙酸乙酯残留 情况相比甲醇要好得多。综上所述，用乙酸乙酯洗脱，可以省去再用1mL的针筒洗脱的步骤， 直接在20mL针筒上洗脱就行，节约了试验成本。

之所以乙酸乙酯效果好是因为过滤之后的滤头残留水分，甲醇、乙腈、乙醇能与水混溶， 残留的水分对富集液产生稀释效果，而不溶于水的乙酸乙酯和正己烷，在洗脱液中都可看见 分层现象，即洗脱时不会因为水分的存在而将富集液稀释，但是正己烷属于非极性溶剂，乙 酸乙酯属于极性溶剂，4个丹参酮标准品都容易溶解在乙酸乙酯中，故乙酸乙酯是最佳洗脱 剂。

实施例7.考察洗脱剂不同体积下的富集效果

7.1取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于 90℃烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

7.2取6只干净的玻璃研钵，编号1、2、3、4、5、6，1-6号研钵中均加入13mg PCMA-60 和研磨好的300mg混合盐粉末（200mg NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将1-6号研钵内混合 物再次研磨均匀，分别将1-6号研钵内研磨后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用 泡腾片，对应研钵将泡腾片编号为1、2、3、4、5、6。

7.3取6个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2、3、4、5、6，每个锥形瓶中 加入20mLpH=7的水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

7.4往1-6号锥形瓶中根据对应的编号放入1-6号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡，此时介孔材料浓度均为0.65mg/mL。取6个20mL规格的一次性注射器，对应锥 形瓶编号1、2、3、4、5、6，并且根据对应的编号吸干锥形瓶内液体。

7.5取6个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-6号注射器编号为1、2、3、4、5、6，并 根据对应的编号，用过滤器将注射器内的液体过滤。1号过滤器用100μL乙酸乙酯洗脱，2 号过滤器用200μL乙酸乙酯洗脱，3号过滤器用300μL乙酸乙酯洗脱，4号过滤器用500μL 乙酸乙酯洗脱，5号过滤器用700μL乙酸乙酯洗脱，6号过滤器用900μL乙酸乙酯洗脱。取6 个1.5mL规格的离心管，对应过滤器编号1、2、3、4、5、6，将洗脱液根据对应的编号转入 1-6号离心管中。

7.6将1-6号离心管在13000rpm下离心5min，取6个进样瓶，对应离心管编号1、2、3、 4、5、6，并根据编号，对应离心管的编号将上清液装入6个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析。

实验结果如下表7，表7中的数据为峰面积。

表7.

图8显示了洗脱剂不同体积下的富集效果折线图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不 同的有效成分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。

从图中可知，随着洗脱剂体积从50μL增大到100μL，富集效果增大，从100μL逐步增 大到900μL，富集效果下降。在理论上，洗脱剂体积越小，富集效果越好，因为浓度随着体 积缩小而变大，但是50μL富集效果不如100μL，可能原因是50μL洗脱时候由于加入量过少， 使得洗脱液未能将过滤器上的活性成分充分洗脱下来，故对13mg介孔材料，洗脱剂用量 100μL是最佳条件。

实施例8.测定丹参药材、丹参酮胶囊、复方丹参滴丸、复方丹参片中的活性成分含量

8.1取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于 90℃烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

8.2取5只干净的玻璃研钵，编号1、2、3、4、5，1-5号研钵中均加入13mg PCMA-60 和研磨好的300mg混合盐粉末（200mg NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将1-5号研钵内混合 物再次研磨均匀，分别将1-4号研钵内研磨后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用 泡腾片，对应研钵将泡腾片编号为1、2、3、4、5。

8.3取5个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2、3、4、5，1号锥形瓶中加入 20mL pH=7的水并扣除20μL，后再加入20μL丹参药材提取液，2号锥形瓶中加入20mL pH=7 的水并扣除20μL，后再加入20μL丹参酮胶囊提取液，3号锥形瓶中加入20mL pH=7的水并 扣除20μL，后再加入20μL复方丹参滴丸提取液，4号锥形瓶中加入20mL pH=7的水并扣除 20μL，后再加入20μL复方丹参片提取液，5号锥形瓶中加入20mL pH=7的水并扣除20μL， 后再加入20μL丹参酮对照品溶液摇匀，即得1-5号稀释液，取1-5号稀释液试样用超高效液 相色谱（UPLC）进样分析，所得液相色谱图分别见图10的A图、图11的A图、图12的A 图、图13的A图、图9的A图。

丹参药材提取液的制备方法参照药典2010版，具体步骤为：本品粉末（过三号筛）约 2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷， 再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得丹参药材提取液。

丹参酮胶囊提取液的制备方法参照药典2010版，具体步骤为：本品粉末（过三号筛）约 0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇50mL，称定重量，加热回流1小时，放 冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得丹参酮胶囊提取液。

复方丹参滴丸提取液的制备方法参照药典2010版，具体步骤为：本品20丸（约0.5g）， 精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇10mL，超声处理（功率120W，频率40kHz）60分钟使 溶解，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得复方丹参滴丸提取液。

复方丹参片提取液的制备方法参照药典2010版，具体步骤为：本品7片，研细，精密称 定，取约2.0g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处 理（功率250W，频率33kHz）60分钟，放冷，再称定重量用甲醇补足减失的重量，摇匀， 滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得复方丹参片提取液。

8.4往1-5号锥形瓶中根据对应的编号放入1-5号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡，此时介孔材料浓度均为0.65mg/mL。取5个20mL规格的一次性注射器，对应锥 形瓶编号1、2、3、4、5，并且根据对应的编号吸干锥形瓶内液体。

8.5取5个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-5号注射器编号为1、2、3、4、5，并根 据对应的编号，用过滤器将注射器内的液体过滤，后用100μL乙酸乙酯对每个过滤器的滤饼 经行洗脱，取5个1.5mL规格的离心管，对应过滤器编号1、2、3、4、5，将洗脱液根据对 应的编号转入1-5号离心管中，即为富集液。取5号注射器过滤后的滤液的试样用超高效液 相色谱（UPLC）进样分析，所得液相色谱图见图9的B图。

8.6将1-5号离心管在13000rpm下离心5min，取5个进样瓶，对应离心管编号1、2、3、 4、5，并根据编号，对应离心管的编号将上清液装入5个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析，即得到富集液的液相色谱图，1-5号试样的液相色谱图分别为图10的B图、图11 的B图、图12的B图、图13的B图、图9的C图。

图9为丹参酮对照品的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成分， 分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B、C图分别代 表不同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集后过滤的滤液；C：富集液。滤液色谱图表明， 滤液中没有检测到有效成分，可见泡腾片对稀释液的富集效果很好，有效成分均被富集到固 态滤饼中，几乎不存在于滤液中。

图10为丹参药材的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成分， 分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B图分别代表不 同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集液。

图11为丹参酮胶囊的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成分， 分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B图分别代表不 同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集液。

图12为复方丹参滴丸的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成 分，分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B图分别代 表不同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集液。

图13为复方丹参片的液相色谱图。图中，1、2、3、4分别代表丹参中不同的有效成分， 分别为：1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4：丹参酮II_A。A、B图分别代表不 同的试样，分别为：A：稀释液；B：富集液。

UPLC的色谱条件为：

色谱柱：BEH C18，1.7μm，2.1×50mm（Waters），检测波长：270nm， 柱温：30℃，进样量：1.0μL，流速0.4mL/min，流动相：A：水，B：甲醇。梯度洗脱：0～1min， 50%～72%B；1～7min，72%～75%B；7～8min，75%～100%B；8～9min，100%～100%B；9～10min， 100%～50%B。

图9中丹参酮对照品混合液的组分为1：二氢丹参酮I；2：丹参酮I；3：隐丹参酮；4： 丹参酮II_A。配制不同浓度的对照品混合液，分别以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘 制不同成分的标准曲线。丹参药材提取液、丹参酮胶囊提取液、复方丹参滴丸提取液、复方 丹参片提取液经富集后，富集液测定液相色谱，根据不同成分的峰面积，对照标准曲线，计 算得到药材中有效成分含量。

实验结果如下表8。

表8.

本方法的富集效果（用检测限/定量限表示）见下表9。

表9.

富集前是指丹参酮对照品20μL加水稀释到20mL所得的稀释液进行色谱检测的检测限和 定量限。富集后是指富集后所得富集液进行色谱检测的检测限和定量限。可明显看出，经过 富集后检测限和定量限降低，灵敏度显著提高。

本发明中的丹参酮对照品的稀释液中各有效成分的浓度，即二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹 参酮、丹参酮II_A四者在稀释液中浓度均为：0.5μg/mL。

为了进一步验证本方法的可行性，进行了方法学的考察包括日内精密度、隔天精密度、 重复性以及加样回收率。

日内精密度

1.取2个干净玻璃表面皿，称取200mg NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入100mg Na₂CO₃，两个表面皿均置于90℃烘箱中干燥2h。

2.称取13mg PCMA-60，与200mgNaH₂PO₄和100mgNa₂CO₃一同放入研钵中研磨，将研磨 后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用泡腾片。

3.取一个50mL规格的具塞锥形瓶，加入20mL水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照 品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

4.往稀释液中放入泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、停止冒泡，此时介孔材料浓 度为0.65mg/mL。用20mL规格一次性注射器将锥形瓶内液体吸干。

5.取一个0.22μm规格的有机膜过滤器，将注射器内的液体过滤，后用100μL乙酸乙酯对 过滤器经行洗脱，洗脱液转入1.5mL规格的离心管。

6.将离心管在13000rpm下离心5min，取上清液装入进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析，在同一天内不同的时间段进样6次。

日间精密度

1.取2个干净玻璃表面皿，称取200mg NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中 加入100mg Na₂CO₃，两个表面皿均置于90℃烘箱中干燥2h。

2.称取13mg PCMA-60，与200mgNaH₂PO₄和100mgNa₂CO₃一同放入研钵中研磨，将研磨 后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用泡腾片。

3.取一个50mL规格的具塞锥形瓶，加入20mL水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照 品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

4.往稀释液中放入泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、停止冒泡，此时介孔材料浓 度为0.65mg/mL。用20mL规格一次性注射器将锥形瓶内液体吸干。

5.取一个0.22μm规格的有机膜过滤器，将注射器内的液体过滤，后用100μL乙酸乙酯对 过滤器经行洗脱，洗脱液转入1.5mL规格的离心管。

6.将离心管在13000rpm下离心5min，取上清液装入进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析，在三天内相同的时间点进样，每天进2次。

重复性

1.取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中加 入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于90℃ 烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

2.取5只干净的玻璃研钵，编号1、2、3、4、5，1-5号研钵中均加入13mg PCMA-60和 研磨好的300mg混合盐粉末（200mg NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将1-5号研钵内混合物 再次研磨均匀，分别将1-5号研钵内研磨后的混合粉末放入压片机压成片，即得富集所用泡 腾片，对应研钵将泡腾片编号为1、2、3、4、5。

3.取5个50mL规格的具塞锥形瓶，对应泡腾片编号1、2、3、4、5，每个锥形瓶中加入 20mL水，并扣除20μL水，加入丹参酮对照品溶液20μL，摇匀，即得稀释液。

4.往1-5号锥形瓶中根据对应的编号放入1-5号泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、 停止冒泡，此时介孔材料浓度均为0.65mg/mL。取5个20mL规格的一次性注射器，对应锥 形瓶编号1、2、3、4、5，并且根据对应的编号吸取锥形瓶内液体。

5.取5个0.22μm规格的有机膜过滤器，对应1-5号注射器编号为1、2、3、4、5，并根据 对应的编号，用过滤器将注射器内的液体过滤。1-5号过滤器均用100μL乙酸乙酯洗脱。取5 个1.5mL规格的离心管，对应过滤器编号1、2、3、4、5，将洗脱液根据对应的编号转入1-5 号离心管中。

6.将1-5号离心管在13000rpm下离心5min，取5个进样瓶，对应离心管编号1、2、3、4、 5，并根据编号，对应离心管的编号将上清液装入5个进样瓶，用超高效液相色谱（UPLC） 进样分析。

加样回收率

1.取2个干净玻璃表面皿，称取适量NaH₂PO₄加入其中一个表面皿中，另一个表面皿中加 入适量Na₂CO₃，使两者质量比为m（NaH₂PO₄）：m（Na₂CO₃）=2：1。两个表面皿均置于90℃ 烘箱中干燥2h。干燥结束后将两者混合研磨成细粉状，即得混合盐粉末。

2.取1只干净的玻璃研钵，加入13mg PCMA-60和研磨好的300mg混合盐粉末（200mg  NaH₂PO₄加100mgNa₂CO₃），后将研钵内混合物再次研磨均匀，将研钵内研磨后的混合粉末 放入压片机压成片，即得富集所用泡腾片。

3.取1个50mL规格的具塞锥形瓶，加入20mL水，并扣除20μL水，再加入丹参酮对照 品溶液10μL和丹参酮胶囊提取液10μL，摇匀，即得稀释液。

4.往锥形瓶中放入泡腾片，使其冒泡富集至泡腾片全部溶解、停止冒泡，此时介孔材料浓 度为0.65mg/mL。取1个20mL规格的一次性注射器，吸取锥形瓶内液体。

5.取1个0.22μm规格的有机膜过滤器，将注射器内的液体过滤，后用100μL乙酸乙酯对 过滤器经行洗脱，取1个1.5mL规格的离心管，将洗脱液转入离心管中。

6.将离心管在13000rpm下离心5min，取1个进样瓶，将上清液装入进样瓶，用超高效液 相色谱（UPLC）进样分析。

实验结果汇总如下表10：

表10.

结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性高。