抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物及其制备

摘要

本发明涉及一种抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组合物含有猪支气管败血波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、副猪嗜血杆菌抗原等成分，各抗原成分的菌液均采用发酵培养法获得，并采用超滤浓缩技术浓缩，疫苗中抗原含量高且全面，可以为动物提供全面有效保护。本发明采用水佐剂gel佐剂，具有吸收好，免疫局部没有不良反应，免疫应答快，可以提高猪的免疫保护。本发明的疫苗组合物有效解决了混合感染时对猪只的有效全面保护的问题，简化了免疫程序，达到了一针多防，降低了多次免疫造成的副反应，降低了防疫成本，经济实用。

说明书

技术领域

本发明属于畜牧类生物制药技术领域，涉及一种抗猪萎缩性鼻炎 和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物及其制备方法。

背景技术

猪萎缩性鼻炎(atrophic rhinitis，AR)是猪群的一种重要的呼吸 系统传染病，它会引起猪的慢性鼻炎、打喷嚏、流眼泪、颜部变性和 鼻甲骨萎缩等症状，严重的还可以导致鼻吻变形并影响全身骨骼发 育，从而导致猪生长迟缓，使猪容易感染继发性复合性肺炎，给养猪 业造成巨大的损失。该病可感染任何年龄阶段的猪，其中4周龄以内 的猪感染率最高，症状一般出现在8～12周龄。猪萎缩性鼻炎可分为 进行性猪萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)和非进行性 猪萎缩性鼻炎(nonprogressive atrophic rhinitis，NPAR)。进行性猪萎 缩性鼻炎主要由产毒素多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida)引起，病原通常为荚膜D型(Pm-D)或A型(Pm-A)， 或与支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)共同感染引 起。非进行性猪萎缩性鼻炎则单纯由支气管败血波氏杆菌引起，其通 常只引起轻微的鼻甲骨萎缩，往往观察不到鼻吻部的典型病变。进行 性猪萎缩性鼻炎给养猪业带来的危害十分巨大。

当前，我国所用的猪萎缩性鼻炎疫苗还主要是支气管败血波氏杆 菌灭活苗或支气管败血波氏杆菌加有产毒素多杀性巴氏杆菌的灭活 苗，所使用的疫苗佐剂常常为铝胶佐剂、弗氏佐剂、油包水型佐剂， 存在着保护性抗原成分少，不能提供完全的保护，注射后吸收不完全， 副反应大等缺点。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPs)是猪Glasser’S病的病 原体，猪上呼吸道的一种共栖菌，它可在特定条件下侵入机体而引起 以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。目 前，我国很多省市患病猪群中均可分离获得副猪嗜血杆菌，该菌可影 响从2周龄的哺乳仔猪到4月龄的育肥猪，主要在断奶后和保育阶段 发病，多见于5～8周龄的猪，发病率在10％～15％，严重时死亡率高 达50％，已成为保育猪死亡的主要原因之一，给我国养猪业带来了巨 大的经济损失。

猪萎缩性鼻炎感染不仅会造成猪只生产性能的影响，而且感染后 会引起免疫机能的下降，继发感染副猪嗜血杆菌，会造成病情加重乃 至死亡的危险！猪传染性萎缩性鼻炎虽然有两种病原，而支气管败血 波氏杆菌是原发性主要的病原菌，它还是多杀性巴氏杆菌建立感染的 重要前导因子。它的致病变特点是传染主要来自怀孕母猪，新生仔猪 感染的越早产生的病变越严重，因此，为了杜绝生产母猪把病原菌传 给所生仔猪，在免疫程序上需要在母猪产前4周及2周各免疫一次。 而对于副猪嗜血杆菌的免疫程序则是在母猪产前7周及5周各免疫一 次。二者免疫的不同步，造成了混合感染时，不能有效的对猪只进行 全面有效的保护！

因此，目前存在的问题是研究开发一种制备方法简单、可有效预 防猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病的灭活疫苗，副反应小，且抗原成 分含量较高的抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物及其制 备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗 猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组 合物含有猪支气管败血波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、副猪 嗜血杆菌抗原等成分。该疫苗组合物中抗原含量高且全面，毒力强， 免疫原性好，可以为动物提供全面有效的保护；该疫苗组合物免疫程 序简单，防疫成本低廉，吸收好，免疫局部没有不良反应，免疫应答 快，实用性强。

为此，本发明提供了一种抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗 组合物，其包括：猪支气管败血波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗 原、副猪嗜血杆菌抗原。

在本发明中，所述猪支气管败血波氏杆菌抗原包含至少一种在对 猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪支气管败血波氏杆菌感染的免疫应 答的猪支气管败血波氏杆菌抗原。

根据本发明，所述猪支气管败血波氏杆菌抗原为猪支气管败血波 氏杆菌全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪支 气管败血波氏杆菌，或者含有猪支气管败血波氏杆菌的免疫原性氨基 酸序列的多肽成分中一种或几种。优选所述猪支气管败血波氏杆菌抗 原为灭活形式的全菌体。进一步优选所述猪支气管败血波氏杆菌抗原 为灭活形式的支气管败血波氏杆菌HN8株。并且，在所述的疫苗组合 物中，所述支气管败血波氏杆菌HN8株灭活前含量为 10⁸～10¹⁰CFU/ml。

本发明中所述用语“猪支气管败血波氏杆菌全菌体”，是指猪支 气管败血波氏杆菌的完整细胞体。

在本发明的一个具体实施例中，所述的猪支气管败血波氏杆菌抗 原可以是选自(西班牙海博莱猪萎缩性鼻炎灭活疫苗(883株)，武 汉科前静鼻(JB5株)，勃林格猪萎缩性鼻炎灭活疫苗(I相77～14 株、540株))中的一种或几种。

在本发明的一个优选的具体实施例中，所述猪支气管败血波氏杆 菌抗原为灭活形式的HN8株。所述支气管败血波氏杆菌HN8株 (Bordetella bronchiseptica HN8)的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011223，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址： 湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期为2011 年06月28日。

本发明中所述用语“支气管败血波氏杆菌HN8株”，也称为“猪 支气管败血波氏杆菌HN8株。

正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列 上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要 作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之 百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。但是同源性比较如果针 对全部的基因来进行比对，实际上是非常巨大的工程，不太可行，目 前国际上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)来进行细菌型的分 辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同 源性。所以本发明所使用的猪支气管败血波氏杆菌抗原并不限定于本 发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA 相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA 具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功 能域)。

因此，本发明中，所述猪支气管败血波氏杆菌抗原为与支气管败 血波氏杆菌HN8株的16S rRNA的同源性至少为80％的菌株。优选所 述猪支气管败血波氏杆菌抗原为与支气管败血波氏杆菌HN8株的16S rRNA的同源性至少为90％的菌株。进一步优选的是，所述猪支气管 败血波氏杆菌抗原为与支气管败血波氏杆菌HN8株的16S rRNA的同 源性至少为95％～99％的菌株。更为优选的是，所述猪支气管败血波氏 杆菌抗原为与支气管败血波氏杆菌HN8株的16S rRNA的同源性为 98％～99％的菌株。即在不改变猪支气管败血波氏杆菌16S rRNA的前 提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪支气管 败血波氏杆菌，获得与本发明猪支气管败血波氏杆菌16S rRNA高度 同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。

同样，在本发明中，所述猪多杀性巴氏杆菌抗原包含至少一种在 对猪给药后能诱导、刺激或增强抗多杀性巴氏杆菌的免疫应答的多杀 性巴氏杆菌抗原。

根据本发明，所述猪多杀性巴氏杆菌抗原为猪多杀性巴氏杆菌全 菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪多杀性巴氏 杆菌，或者含有猪多杀性巴氏杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合细 菌，或者含有猪多杀性巴氏杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中 一种或几种。优选所述猪多杀性巴氏杆菌抗原为灭活形式的全菌体。 进一步优选所述猪多杀性巴氏杆菌抗原为灭活形式的多杀性巴氏杆 菌A型HN5株和/或多杀性巴氏杆菌D型HB4株。并且，在所述的 疫苗组合物中，所述多杀性巴氏杆菌A型HN5株灭活前含量为 10⁸～10¹⁰CFU/ml，多杀性巴氏杆菌D型HB4株灭活前含量为 10⁸～10¹⁰CFU/ml。

本发明中所述用语“猪多杀性巴氏杆菌全菌体”，是指猪多杀性 巴氏杆菌的完整细胞体。

在本发明的一个具体实施例中，所述的猪多杀性巴氏杆菌抗原可 以是选自(勃林格猪萎缩性鼻炎灭活疫苗(D型B3669株)，西班牙 海博莱喜必安(D型637株))中的一种或几种。

在本发明的一个优选的具体实施例中，所述猪多杀性巴氏杆菌抗 原为灭活形式的A型HN5株、D型HB4株。所述多杀性巴氏杆菌A 型HN5株(Pasteurella multocida A Type HN5)的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011222；所述多杀性巴氏杆菌D型HB4株(Pasteurella multocida D Type HB4)的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011221；上 述菌种均保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖 北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期均为2011 年06月28日。

本发明中所述用语“多杀性巴氏杆菌A型HN5株”，也称为“猪 多杀性巴氏杆菌A型HN5株”。

本发明中所述用语“多杀性巴氏杆菌D型HB4株”，也称为“猪 多杀性巴氏杆菌D型HB4株”。

本发明中，所述猪多杀性巴氏杆菌抗原为与多杀性巴氏杆菌A型 HN5株的16S rRNA的同源性至少为80％的菌株或/和多杀性巴氏杆菌 D型HB4株的16S rRNA的同源性至少为80％的菌株。优选所述猪多 杀性巴氏杆菌抗原为与多杀性巴氏杆菌A型HN5株的16S rRNA的同 源性至少为90％的菌株和/或多杀性巴氏杆菌D型HB4株的16S rRNA 的同源性至少为90％的菌株。进一步优选的是，所述猪多杀性巴氏杆 菌抗原为与多杀性巴氏杆菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少为 95％～99％的菌株和/或多杀性巴氏杆菌D型HB4株的16S rRNA的同 源性至少为95％～99％的菌株。更为优选的是，所述猪多杀性巴氏杆菌 抗原为与多杀性巴氏杆菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少为 98％～99％的菌株和/或多杀性巴氏杆菌D型HB4株的16S rRNA的同 源性至少为98％～99％的菌株。

同样，在本发明中，所述副猪嗜血杆菌抗原包含至少一种在对猪 给药后能诱导、刺激或增强抗副猪嗜血杆菌的免疫应答的副猪嗜血杆 菌抗原。

根据本发明，所述副猪嗜血杆菌抗原为副猪嗜血杆菌全菌体，其 选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的副猪嗜血杆菌，或者含 有副猪嗜血杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合细菌，或者含有副猪嗜 血杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一种或几种。优选所述副 猪嗜血杆菌抗原为灭活形式的全菌体。进一步优选所述副猪嗜血杆菌 抗原为灭活形式的副猪嗜血杆菌4型JS株和/或副猪嗜血杆菌5型ZJ 株。并且，在所述的疫苗组合物中，所述副猪嗜血杆菌4型JS株灭活 前含量为10⁸～10¹⁰CFU/ml，副猪嗜血杆菌5型ZJ株灭活前含量为 10⁸～10¹⁰CFU/ml。

本发明中所述用语“副猪嗜血杆菌全菌体”，是指副猪嗜血杆菌 的完整细胞体。

在本发明的一个具体实施例中，所述的副猪嗜血杆菌抗原可以是 选自(武汉科前副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清4型MD0322+血清 5型SH0165)，勃林格茵格发副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(Z-1517株)， 西班牙海博莱猪副猪嗜血杆菌灭活疫苗(血清1型SV1+血清6型 SV6)中的一种或几种。

在本发明的一个优选的具体实施例中，所述副猪嗜血杆菌抗原为 灭活形式的血清4型JS株、血清5型ZJ株。所述副猪嗜血杆菌血清 4型JS株(Haemophilus Parasuis Serotype 4，Strain JS)的保藏编号为： CCTCC NO：M 2011172；所述副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株 (Haemophilus Parasuis Serotype 5，Strain ZJ)的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011173；上述菌种均保藏于中国典型培养物保藏中心(简称： CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保 藏日期均为2011年05月18日。

本发明中，所述副猪嗜血杆菌抗原为与副猪嗜血杆菌4型JS株的 16S rRNA的同源性至少为80％的菌株或/和副猪嗜血杆菌5型ZJ株的 16S rRNA的同源性至少为80％的菌株。优选所述副猪嗜血杆菌抗原 为与副猪嗜血杆菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少为90％的菌株 和/或副猪嗜血杆菌5型ZJ株的16S rRNA的同源性至少为90％的菌 株。进一步优选的是，所述副猪嗜血杆菌抗原为与副猪嗜血杆菌4型 JS株的16S rRNA的同源性至少为95％～99％的菌株和/或副猪嗜血杆 菌5型ZJ株的16S rRNA的同源性至少为95％～99％的菌株。更为优 选的是，所述副猪嗜血杆菌抗原为与副猪嗜血杆菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少为98％～99％的菌株和/或副猪嗜血杆菌5型ZJ株 的16S rRNA的同源性至少为98％～99％的菌株。

在本发明中，所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体的附加抗 原，其选自猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原、猪瘟病毒抗 原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪圆环病毒抗原(PCV)、猪肺炎支 原体抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、猪流感病毒(SIV)抗 原中的一种或几种。

根据本发明，所述疫苗组合物还包括兽医学上可接受的疫苗佐 剂，并且，在所述疫苗组合物中，所述疫苗佐剂含量为10wt％～15wt％。 所述疫苗佐剂选自Gel佐剂、氢氧化铝胶、蜂胶、矿物油、ISA206、 ISA760VG、ISA15A、CP934、CP940。

本发明还提供了一种制备抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫 苗组合物的方法，所述方法包括分别将所述猪支气管败血波氏杆菌 株、所述猪多杀性巴氏杆菌株及所述副猪嗜血杆菌株进行增殖后，再 分别进行浓缩、灭活，并加入疫苗佐剂，乳化或搅拌均匀制备。所述 猪支气管败血波氏杆菌株、所述猪多杀性巴氏杆菌株及所述副猪嗜血 杆菌株在上述增殖过程中获得大量增殖。

在本发明的一个具体实施方式中，所述制备抗猪萎缩性鼻炎和副 猪嗜血杆菌病疫苗组合物的方法包括：

步骤A，采用超滤浓缩技术分别将支气管败血波氏杆菌HN8株、 多杀性巴氏杆菌A型HN5株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株菌种、副 猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血杆菌5型ZJ株的灭活菌液进行浓缩， 分别获得其各自的灭活浓缩液；

步骤B，将支气管败血波氏杆菌HN8株、多杀性巴氏杆菌A型 HN5株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株菌种、副猪嗜血杆菌4型JS株 和副猪嗜血杆菌5型ZJ株的灭活浓缩液混合，并加入疫苗佐剂，乳 化，制得抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物。

根据本发明方法，在步骤A中，所述灭活支气管败血波氏杆菌 HN8株、多杀性巴氏杆菌A型HN5株和多杀性巴氏杆菌D型HB4 株菌种、副猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血杆菌5型ZJ株的菌液经 过浓缩后所获得的灭活浓缩液中灭活前各抗原含量均为1× 10¹¹CFU/ml。

在本发明的一个具体实施例中，在步骤B中，将各组分抗原按 1∶1∶1∶1的体积比混合，再加入抗原量10wt％或15wt％的Gel佐剂进 行乳化，制得抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物。

在本发明的一个优选实施例中，在步骤A之前还包括：

步骤(1)，分别将支气管败血波氏杆菌菌种、多杀性巴氏杆菌A 型和D型菌种、副猪嗜血杆菌4型和5型菌种接种于固体培养基进行 活化，培养24h，分别作为其各自的一级种子；

步骤(2)分别挑取支气管败血波氏杆菌菌种、多杀性巴氏杆菌A 型和D型菌种、副猪嗜血杆菌4型和5型菌种平板单克隆接种于适宜 液体培养基培养12～16h，以1％的接种量扩大培养12～16h作为其各 自的二级种子；

步骤(3)分别将支气管败血波氏杆菌菌种、多杀性巴氏杆菌A 型和D型菌种、副猪嗜血杆菌4型和5型菌种二级种子转接发酵罐发 酵培养基培养16～24h，收获其各自的菌液，灭活后获得其各自的灭 活菌液。

在上述步骤(3)中，灭活过程，是按菌液总量加入0.2％～0.4％ 的甲醛水溶液，灭活时间为24～48小时。

根据本发明的疫苗组合物含有猪支气管败血波氏杆菌抗原、猪多 杀性巴氏杆菌抗原、副猪嗜血杆菌抗原。这些菌株由普莱柯生物工程 股份有限公司分离鉴定，具有毒力强，免疫原性好的特点。该疫苗组 合物中各抗原成分的菌液均采用发酵培养法获得，并采用超滤浓缩技 术进行浓缩，疫苗中抗原含量高且全面，从而可以为动物提供全面的 有效保护。尤其是，本发明采用水佐剂gel佐剂，具有吸收好，免疫 局部没有不良反应，免疫应答快，可以提高猪的免疫保护等优点。

与现有技术相比，根据本发明的疫苗组合物具有以下优点：

1)解决了现有技术的困难，改变了人们对猪萎缩性鼻炎和副猪 嗜血杆菌同时感染时的认识偏见，首次将猪支气管败血波氏杆菌抗 原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、副猪嗜血杆菌抗原按照合适的比例联合 使用，而在本发明之前，一直没有人认为两种病可以同时进行预防进 而这两种疫苗可以联合使用；

2)本发明中含有猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、 副猪嗜血杆菌抗原的预防和治疗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌感染 的疫苗组合物，不仅不会产生几种抗原成份的相互免疫干扰或影响， 而且意外发现猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血 杆菌的抗原混合后，猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副 猪嗜血杆菌的抗原组合物不仅能产生的保护性免疫应答的同时，还意 外发现猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌抗 原有相互增强免疫效果的作用，而且如本发明后续实施例所证明的， 特别是存在其中一种抗原的情况下，另一种抗原量减半仍能维持本抗 原的免疫效果，而这出乎本领域普通技术人员预料的。

3)上述预防和治疗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组 合物与猪萎缩性鼻炎或副猪嗜血杆菌的单疫苗的效力相比，在对猪注 射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此，本发明的二联 疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。

4)含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的 疫苗组合物以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与 单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不 能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至 全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环 相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗， 则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

5)此外，本发明预防和治疗猪萎缩性鼻炎相关疾病和副猪嗜血 杆菌相关疾病的疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免 疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能 防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫1次就能 够预防猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌几种病原感染，降低了免疫成 本，节约了免疫程序，更加经济可靠。

根据本发明的疫苗组合物不仅方便、多效、低成本，与单一疫苗 相比，还可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫； 另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部使用过 程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链 运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大 大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

因此，根据本发明的疫苗组合物有效解决了混合感染时对猪只的 有效全面保护的问题，简化了免疫程序，达到了一针多防，并降低了 多次免疫造成的副反应，降低了防疫成本，经济实用。

菌种保藏

支气管败血波氏杆菌HN8株(Bordetella bronchiseptica HN8)， 由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保 藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武 汉大学)进行保藏。保藏日期为2011年06月28日。保藏编号为： CCTCC NO：M 2011223。

多杀性巴氏杆菌D型HB4株(Pasteurella multocida D Type HB4)， 由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保 藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武 汉大学)进行保藏。保藏日期为2011年06月28日。保藏编号为： CCTCC NO：M 2011221。

多杀性巴氏杆菌A型HN5株(Pasteurella multocida A Type HN5)， 由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保 藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武 汉大学)进行保藏。保藏日期为2011年06月28日。保藏编号为： CCTCC NO：M 2011222。

副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus Parasuis Serotype 4， Strain JS)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国 典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞 珈山路16号武汉大学)进行保藏。保藏日期为2011年05月18日。 的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011172。

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株(Haemophilus Parasuis Serotype 5， Strain ZJ)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国 典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞 珈山路16号武汉大学)进行保藏。保藏日期为2011年05月18日。 的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011173。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发 明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下 列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：猪支气管败血波氏杆菌抗原、多杀性巴氏杆菌抗原和副猪 嗜血杆菌抗原的制备

1.菌株来源

制造及检验本品用的支气管败血波氏杆菌HN8株(CCTCC NO： M2011223)、多杀性巴氏杆菌A型HN5株(CCTCC NO：M2011222) 和D型HB4株(CCTCC NO：M2011221)、副猪嗜血杆菌4型JS 株(CCTCC M 2011172)和5型ZJ株(CCTCC M 2011173)，均由 普莱柯生物工程股份有限公司从河南发病猪场分离鉴定，在湖北省武 汉市中国典型培养物保藏中心保藏。

制造及检验本品用的菌种为支气管败血波氏杆菌HN8株、多杀性 巴氏杆菌A型HN5株和D型HB4株、副猪嗜血杆菌4型JS株和5 型ZJ株，均为冻干保存。

2.疫苗半成品的制备及检验

(1)生产用种子的制备

①支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌

一级种子的繁殖

将支气管败血波氏杆菌HN8株接种于改良鲍姜氏血平板，与37 ℃培养48h，作为一级种子；将多杀性巴氏杆菌A型HN5株，多杀性 巴氏杆菌D型HB4株的菌种分别接种于TSA(大豆酪蛋白琼脂)培 养基平板，与37℃培养24h作为一级种子。在2～8℃保存，保存期不 超过5天。在培养基上传代，不超过5代。

二级种子繁殖

挑取支气管败血波氏杆菌HN8株平板上溶血环明显的菌落于含 5ml BHI(脑心浸液)的试管中，于150～220rpm，37℃振荡培养16h； 分别挑取多杀性巴氏杆菌A型HN5株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株 平板菌落于含5mlBHI的试管中，于150～220rpm，37℃振荡培养16h。 以上菌液分别以1％的接种量接种于100ml相应培养基，于 150～220rpm，37℃振荡培养12h，按《中国兽药典》附录进行纯粹检 验，合格后作为二级种子，在2～8℃保存，不超过8h。

②副猪嗜血杆菌

一级种子的繁殖

将副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株的菌种分别接种于TSA平 板，与37℃培养24h作为一级种子。在2～8℃保存，保存期不超过5 天。在培养基上传代，不超过5代。

二级种子繁殖

分别挑取副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌落于5ml含NAD (氧化型辅酶I)的TSB(胰胨大豆胨肉汤)试管中，于150～220rpm， 37℃振荡培养16h。以上菌液分别以1％的接种量接种于100ml相应培 养基，于150～220rpm，37℃振荡培养12h，按《中国兽药典》附录进 行纯粹检验，合格后作为二级种子，在2～8℃保存，不超过8h。

(2)制苗用菌液制备

①支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌

采用生物发酵罐分别进行支气管败血波氏杆菌HN8株、多杀性巴 氏杆菌A型HN5株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株菌液的制备。将鉴 定合格的二级种子以1％的接种量接种于发酵罐发酵培养基，37℃， 200rpm，通过不断增大通气量和流加补料的方式发酵培养16～24h，收 获菌液。取样进行活菌计数，并按现行《中国兽药典》附录进行纯粹 检验，应纯粹。

②副猪嗜血杆菌

采用生物发酵罐分别进行副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌 液的制备。将鉴定合格的二级种子以1％的接种量接种于发酵罐发酵 培养基，37℃，200rpm，通过不断增大通气量和流加补料的方式发酵 培养16-24h，收获菌液。取样进行活菌计数，并按现行《中国兽药典》 附录进行纯粹检验，应纯粹。

(3)菌液的灭活

纯粹检验合格的支气管败血波氏杆菌HN8株、多杀性巴氏杆菌A 型HN5株和D型HB4株、副猪嗜血杆菌4型和5型菌液，按菌液总 量的0.2～0.5％加入甲醛溶液(v/v)，37℃灭活48h，其间不断摇动。 然后取样按现行《中国兽药典》附录进行灭活检验，应无菌落生长。

(4)菌液的浓缩

将灭活检验合格的菌液采用超滤浓缩技术分别进行浓缩，浓缩后 各抗原含量见表1。取样做无菌检验，应无细菌生长。

表1抗原浓缩后含量

实施例2：抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物的制备

1.防腐剂的配制

1％(w/v)的硫柳汞水溶液：1g硫柳汞溶解于100ml纯化水，121 ℃高压灭菌30min备用。

2.稀释剂的配制

无菌的PBS缓冲溶液：在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0.25g 氯化钾、3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，然后定容至1L，121 ℃高压灭菌30min备用。

3.疫苗佐剂处理

Gel佐剂灭菌：将Gel佐剂转入可灭菌容器内，121℃高压灭菌 30min备用。

4.配苗

将上述成分按一定比例进行混合，即通过无菌操作，将实施例1 制备的支气管败血波氏杆菌浓缩抗原、多杀性巴氏杆菌浓缩抗原和副 猪嗜血杆菌浓缩抗原与疫苗佐剂、防腐剂、稀释剂混合后，用乳化机 低速搅拌15min。所制备不同疫苗组合物如下：

表2疫苗配比具体实施案例

实施例3：不同抗原含量的抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组 合物效力检验

1.试验材料

按照实施例2实验室配制抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗 组合物，疫苗1(猪支气管败血波氏杆菌抗原含量10¹⁰CFU/ml，多杀 性巴氏杆菌A型抗原含量10¹⁰CFU/ml，多杀性巴氏杆菌D型抗原含 量10¹⁰CFU/ml，副猪嗜血杆菌4型抗原含量10¹⁰CFU/ml，副猪嗜血杆 菌5型抗原含量10¹⁰CFU/ml)和疫苗2(猪支气管败血波氏杆菌抗原 含量10⁸CFU/ml，多杀性巴氏杆菌A型抗原含量10⁸CFU/ml，多杀性 巴氏杆菌D型抗原含量10⁸CFU/ml，副猪嗜血杆菌4型抗原含量 10⁸CFU/ml，副猪嗜血杆菌5型抗原含量10⁸CFU/ml)。

3～4周龄，无支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血 杆菌抗体的断奶仔猪。

2.试验方法

(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录的方法对两批批疫苗进行 无菌检验。

(2)安全试验

选取30日龄以内仔猪15头，随机分为3组，其中2组分别颈部 肌肉注射两倍剂量(4ml)疫苗1和疫苗2，剩余做为对照，观察两周， 疫苗接种猪应无明显体温变化，食欲精神正常，无其他可见临床反应 出现。

(3)效力检验

选取3周龄断奶仔猪60头，分为8个免疫组和4个对照组。第 一次免疫，第1-4免疫组免疫2ml疫苗1，第5～8免疫组免疫2ml疫 苗2，9～12组为对照组。免疫间隔2周，进行加强免疫，二免后14 天进行攻毒。第1、5和9组采取Bb/Pm-A联合攻毒的方法；第2、6 和10组采取Bb/Pm-D联合攻毒的方法。攻毒观察30～45天后，处 理免疫组和对照组，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。第3、7和11组用副 猪嗜血杆菌4型进行攻毒；第4、8和12组用副猪嗜血杆菌5型进行 攻毒。攻毒后观察14天，观察其临床症状和死亡情况，计算每批疫 苗的保护率。

3.实验结果

(1)无菌检验：按“规程”附录50页地方法对3批疫苗进行无菌检 验，结果均无菌生长，如表3所示。

表3疫苗无菌检验结果

批次 T.G培养 G.A培养 G.P培养 判定 疫苗1   -   -   -       无菌生长 疫苗2   -   -   -       无菌生长

(2)安全试验结果

对30日龄以内仔猪双倍剂量注射疫苗1和疫苗2，注射后观察两 周，体温无明显变化，食欲、精神状态良好，无可见临床反应和死亡 情况，疫苗注射局部无肿胀等炎症反应。三周后剖杀，所有脏器未见 异常变化。

(3)效力检验结果

仔猪二免后14天，分别用Bb/Pm-A、Bb/Pm-D、Hps-4和Hps-5 进行攻毒，Bb/Pm-A和Bb/Pm-D攻毒后观察30～45天后，处理免疫 猪和对照猪，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。Hps-4和Hps-5攻毒后观察 14天，观察发病数(包括死亡数)。免疫保护结果见表4。

表4疫苗效力检验结果(攻毒)

注：Bb攻1×10¹¹CFU，Pm-A攻1×10¹⁰CFU，Pm-D攻1×10¹⁰CFU， 攻毒方式为气管注射；Hps-4攻8×10⁹CFU，Hps-5攻6×10⁹CFU，攻 毒方式为静脉注射。

效力检验结果显示，疫苗1和疫苗2对败血波氏杆菌，多杀性巴 氏杆菌A型和D型，副猪嗜血杆菌4型和5型均有保护作用，前者保 护率达100％，后者保护率达80％以上。结果表明，猪萎缩性鼻炎和 副猪嗜血杆菌病组合疫苗在一定抗原含量范围内，均能产生对相应病 原产生较好的保护作用，且抗原含量越大，保护作用越强。

实施例4：抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物与单苗联合， 使用于母猪的对比试验

1.材料

按照实施例2实验室配制抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗 组合物，疫苗3(猪支气管败血波氏杆菌抗原含量10⁹CFU/ml，多杀 性巴氏杆菌A型抗原含量10⁹CFU/ml，多杀性巴氏杆菌D型抗原含量 10⁹CFU/ml，副猪嗜血杆菌4型抗原含量109CFU/ml，副猪嗜血杆菌5 型抗原含量10⁹CFU/ml)，猪萎缩性鼻炎单苗，疫苗5(猪支气管败 血波氏杆菌抗原含量10⁹CFU/ml，多杀性巴氏杆菌A型抗原含量 10⁹CFU/ml，多杀性巴氏杆菌D型抗原含量10⁹CFU/ml)，副猪嗜血 杆菌单苗，疫苗6(副猪嗜血杆菌4型抗原含量10⁹CFU/ml，副猪嗜 血杆菌5型抗原含量10⁹CFU/ml)。

无支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌抗体的 妊娠母猪。

2.试验方法

妊娠母猪10头，随机分为2组，分娩前6周第1组免疫2ml疫 苗3，第2组免疫疫苗5和疫苗6各2ml，分娩前3周进行加强免疫。 分别于一免前、一免后14天和二免后14天采血，分离血清，采用微 量凝集反应分别测定血清中支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌A 型和D型、副猪嗜血杆菌4型和5型抗体水平，并记录母猪产仔情况。

3.试验结果

(1)疫苗组合物与单苗联合使用的抗体水平比较结果

采用微量凝集方法测定一免前、一免后14天(二免前)和二免 后14天血清中各种抗体水平见表5。

表5疫苗组合物和单苗联合使用所产生抗体水平

疫苗组合物同单苗联合使用产生的抗体水平显示：疫苗组合物产 生的抗体水平高于单苗联合使用产生的抗体水平，或者与其相当。

(2)疫苗组合物与单苗联合使用对生产性能的影响

疫苗组合物和单苗联合使用分别免疫妊娠母猪后所产仔猪数结 果见表6。

表6疫苗组合物和单苗联合使用免疫妊娠母猪所产仔猪数

疫苗组合物免疫组母猪产仔数高于单苗联合免疫组母猪产仔数， 说明疫苗组合物对母猪的生产性能的影响比单苗联合使用的影响小。

实施例4结果显示，疫苗组合物可以达到单苗联合使用所产生抗 体水平，甚至高于其产生抗体水平，且疫苗组合物的使用降低了多次 注射对母猪产生的副反应，降低劳动强度，降低防疫成本。

实施例5：抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物与单苗联合， 使用于仔猪的对比试验

1.材料

实施例4所制备疫苗3、疫苗5和疫苗6。

3～4周龄，无支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血 杆菌抗体的断奶仔猪。

2.试验方法

选取3周龄断奶仔猪60头，分为8个免疫组和4个对照组。第 一次免疫，第1～4免疫组免疫2ml疫苗3，第5～8免疫组免疫2ml疫 苗5和疫苗6，第9～12组为对照组。免疫间隔2周，进行加强免疫。 二免后14天进行攻毒。第1、5和9组采取Bb/Pm-A联合攻毒的方 法；第2、6和10组采取Bb/Pm-D联合攻毒的方法。攻毒观察30～ 45天后，处理免疫组和对照组，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。第3、7 和11组用副猪嗜血杆菌4型进行攻毒；第4、8和12组用副猪嗜血 杆菌5型进行攻毒。攻毒后观察14天，观察其临床症状和死亡情况， 统计发病数(包括死亡数)，计算每批疫苗的保护率。

3.试验结果

(1)疫苗组合物和单苗联合分别免疫仔猪后，猪败血波氏杆菌和巴 氏杆菌联合攻毒，攻毒保护结果见表7。

表7猪败血波氏杆菌和多杀性巴士杆菌攻毒保护结果

鼻甲骨萎缩评分结果显示：免疫组的鼻甲骨萎缩评分均显著低于 对照组的评分，说明疫苗组合物和单苗联合使用均能提供很好的免疫 保护；疫苗组合物和单苗联合使用鼻甲骨萎缩评分差异不显著。

(2)疫苗组合物和单苗联合分别免疫仔猪后，副猪嗜血杆菌攻毒， 攻毒保护结果见表8。

表8副猪嗜血杆菌攻毒保护结果

副猪嗜血杆菌攻毒保护结果显示：疫苗组合物和单苗联合使用均 能对副猪嗜血杆菌提供很好的免疫保护；疫苗组合物对2个血清型菌 株均能提高完全保护；单苗联合使用提供的保护率也达到80％及以上。

实施例5的结果显示：疫苗组合物对支气管败血波氏杆菌、多杀 性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌所提供的保护与单苗联合使用所提供的 保护相当，甚至高于单苗联合使用所提供的保护。

实施例6：抗猪萎缩性鼻炎和副猪嗜血杆菌病疫苗组合物与单苗相比， 副猪嗜血杆菌部分的免疫效力

1.材料

实施例4中制备疫苗3和疫苗6。

3～4周龄，无支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血 杆菌抗体的断奶仔猪。

2.试验方法

选取3周龄断奶仔猪40头，分为6个免疫组和2个对照组。第 一次免疫，第1、2免疫组免疫1/2剂量(1ml)疫苗3，第3、4免疫 组免疫2ml疫苗3，第5、6免疫组免疫2ml疫苗6，第7、8组为对 照组。免疫间隔2周，进行加强免疫。分别于一免前、一免后14天 和二免后14天采血，分离血清，采用微量凝集反应分别测定血清中 支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌A型和D型、副猪嗜血杆菌4 型和5型抗体水平。二免后14天进行攻毒。第1、3、5和7组用副 猪嗜血杆菌4型进行攻毒；第2、4、6和8组用副猪嗜血杆菌5型进 行攻毒。攻毒后观察14天，观察其临床症状和死亡情况，统计发病 数(包括死亡数)，计算每批疫苗的保护率。

3.试验结果

(1)攻毒保护结果见表9。

表9不同疫苗副猪嗜血杆菌攻毒保护结果

注：Hps-4攻8×10⁹CFU，Hps-5攻6×10⁹CFU，攻毒方式为静脉注射。

发病的判断标准：发病猪出现发热(体温40℃以上，持续1～5日)、 精神萎靡，咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对 濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节 炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现 浆液性或纤维素性渗出物。

攻毒保护结果显示，疫苗6对副猪嗜血杆菌4型和5型均有保护 效果，保护率均为80％；疫苗3采用1/2的免疫剂量对副猪嗜血杆菌 4型保护率为80％，对5型保护率为100％；疫苗3的一个免疫剂量对 副猪嗜血杆菌4型和5型均完全保护。结果令人意外，组合疫苗对副 猪嗜血杆菌的保护力比单苗效果好，或者效果相当；甚至1/2副猪嗜 血杆菌抗原含量的组合疫苗保护效果也比单苗好；而全副猪嗜血杆菌 抗原含量的组合疫苗保护效果最佳。

(2)抗体水平检测结果见表10。

表10不同疫苗副猪嗜血杆菌抗体水平检测结果

抗体水平检测结果令人意外，组合疫苗单剂量和1/2剂量免疫后 副猪嗜血杆菌各血清型抗体水平都明显高于单苗各血清型抗体水平。

实施例6的结果显示：单苗和疫苗组合物均能产生对副猪嗜血杆 菌的免疫保护，疫苗组合物的保护效力不仅仅存在，而且保护效力和 抗体水平均高于单苗产生的；1/2副猪嗜血杆菌抗原含量的疫苗组合 物其保护水平高于全抗原含量的单苗，但低于全抗原含量的疫苗组合 物。这可能是败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌抗原与副猪嗜血杆菌抗 原产生了协同作用，而且协同作用随抗原含量的增加而加强。 实施例7：不同疫苗佐剂免疫吸收效果比较

1.材料

按照实施例2配制的疫苗3和疫苗4，疫苗A与疫苗3抗原含量 相同，疫苗佐剂为白油含量为50％，疫苗B与疫苗3抗原含量也相同， 疫苗佐剂为氢氧化铝胶，含量10％。

3～4周龄，无支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血 杆菌抗体的断奶仔猪。

2.试验方法

选取3周龄断奶仔猪20头，随机分为4组，分别免疫疫苗3、疫 苗4、疫苗A和疫苗B，间隔2周，进行加强免疫，观察免疫后不良 反应，1个月后对注射部位进行剖检观察。

3.试验结果

不同疫苗佐剂疫苗免疫后，不良反应及剖检结果见表11。

表11不同疫苗佐剂疫苗免疫后不良反应及剖检结果

实施例7的结果显示，本发明中采用的Gel水佐剂，具有吸收好， 不良反应少等优点。Gel佐剂含量从10wt％～15wt％均不影响疫苗的 吸收效果和安全性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均 应包含在本发明的保护范围之内。