抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备和竞争ELISA方法的建立

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是猪Glasser's病的病原菌，临床上以纤维蛋白性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。Hps是属于巴斯德菌科嗜血杆菌属的一种不运动、NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。近年来，随着我国规模化养猪场的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，并给养猪业造成重大经济损失。本文研制了抗副猪嗜血杆菌的单克隆抗体，并根据单抗建立了间接竞争ELISA的检测方法，对副猪嗜血杆菌的诊断和防制具有重要意义。
　　 本文分为两部分。第一部分是抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定，第二部分是应用单抗建立间接竞争ELISA的试验方法并对其反应条件进行优化。
　　 以纯化的SW124全菌体免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，将提纯的外膜蛋白作为筛选抗原包被酶标板，经间接ELISA筛选，有限稀释法3次克隆，获得了3株稳定分泌Ups单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2C6、4F10和5B9。3株单抗经亚类鉴定试剂盒测定，所产生抗体均为IgG2b型，腹水ELISA效价分别为1∶3200，1∶12800和1∶5120。通过Western-blot证明2C6、4F10和5B9这三株单克隆抗体均是针对37kDa外膜蛋白的单抗，这些单抗的获得为Hps的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。
　　 选择一株针对外膜蛋白且腹水效价较高的单抗(4F10)来建立快速检测Ups抗体的间接竞争ELISA方法。腹水单抗经PEG沉淀法纯化后，蛋白含量为4.16mg/mL。以SW124外膜蛋白为包被抗原，利用针对SW124外膜蛋白的单克隆抗体与Hps猪血清竞争该抗原，建立间接竞争ELISA方法检测Hps抗体，优化的反应条件为:将SW124外膜蛋白作500倍稀释后包被酶标板，单克隆抗体作1∶600稀释，竞争反应时间为1h，酶标抗体的工作浓度为1∶5000且作用时间也为1h，底物作用时间为10min，建立的间接竞争ELISA的方法检测Hps抗体样品具有较高特异性、稳定性和重复性。与正向间接血凝试剂盒的检测结果相比，符合率达到89.3％，从而为Hps抗体检测提供了一种有用的实验室诊断方法。

目录

摘要

英文缩写词表

前言

文献综述

1 病原学

2 临床表现及病理变化

3 感染动物模型

4 诊断

5 协同感染

6 防制

7 小结

试验一 副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备与生物学特性的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

试验二 单抗竞争ELISA检测Hps抗体方法的建立

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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