幽门螺杆菌活菌的定量测定、药敏测定试剂盒及测定方法

摘要

本发明公开了幽门螺杆菌活菌的定量测定、药敏测定试剂盒及测定方法，该方法采用活的幽门螺杆菌作为待测样本，利用活的幽门螺杆菌能够产生尿素酶这一特性，借助幽门螺杆菌菌落计数标准方法（CFU/ml，即每ml菌液中的细菌个体数量，菌落数标准曲线）能够快速准确读取幽门螺杆菌的数量，检测结果准确、灵敏、可信度高，解决了现有幽门螺杆菌临床微生物学鉴定因培养难，操作繁杂的计数难题，并且本发明扩展的药敏测定试剂盒和制备方法，能够同时进行多种药敏试验，临床医生能快速方便筛选出合适的抗幽门螺杆菌药物，省时省力，节约成本，为临床科学治疗提供了有益的技术解决方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种幽门螺杆菌的测量方法及其试剂盒的制备方法，具体涉及一种方法简单、快速、灵敏的幽门螺杆菌定量测量方法、其试剂盒以及改进的抗幽门螺杆菌敏感药物的快速筛选方法及其试剂盒。

背景技术

1983年幽门螺杆菌（Helicobacter pylori 简称Hp）被澳大利亚的Warren和Warshail发现，已被确认为最常见的慢性感染性疾病的病原之一。现阶段临床检测 Hp主要分为侵人性和非侵人性两大类，前者有胃镜检测、血清抗体检测；后者有“C—UBT”检测和幽门螺杆菌抗原的检测，但是都存在检测不方便、检测有一定创伤和检测滞后性等缺点。

幽门螺杆菌感染的检查方法很多，主要包括细菌的直接检查、尿素酶活性测定，但是上述方法均以定性检测为主，并且采用的是死去的幽门螺杆菌，这样就可能会出现假阳性等不准确的检测结果，后果严重。

尿素酶活性测定的原理：Hp是人胃内定植的唯一含尿素酶的细菌，因而可通过检测尿素酶来诊断Hp感染，尿素酶分解胃内尿素生成氨气和二氧化碳，基于此原理发展了多种检测方法：胃活检组织尿素酶实验、呼吸试验、胃液尿素或尿素氮测定和¹⁵N-尿素试验。

胃活检组织尿素酶试验虽然有效又经济，但是病人需承受胃镜检查或者胃插管的痛苦。

酶呼吸试验简便易行，需要用¹³C或者¹⁴C同位素标记尿素，让病人口服标记后的尿素，从而定性检测Hp，但是¹³C为无放射性元素，测试仪器昂贵、收费高，检验程序复杂，¹⁴C相较而言更经济、更灵敏，但却具有放射性，危害性大。

综上，尿素酶活性测定现有检测方法因为会造成病人痛苦或者太贵或者伤害性高，并且还只能定性检测Hp，可能存在假阳性的诊断结果。

并且之前的检测都是利用的是破坏幽门螺杆菌细胞，直接进行DNA检测，这种利用死去的幽门螺杆菌测试方法较为复杂繁琐，也容易漏检幽门螺杆菌。

发明内容

基于现在的检测情况，本发明提供了一种采用活的幽门螺杆菌定量检测方法，该方法采用活的幽门螺杆菌作为检测样本，利用活的幽门螺杆菌能够产生尿素酶这一特性，结合标准曲线能够快速准确读取幽门螺杆菌的数量而不用破坏幽门螺杆菌，检测结果准确、灵敏、可信度高，解决了现有技术只能定性、操作繁琐，并且费用昂贵、给病人带来高伤害和痛苦、耗时费力等问题。并且本发明提供的药敏试剂盒检测方法，能够同时进行多种药敏试验，快速方便，省时省力，节约成本，适宜临床医学的科学个性化治疗。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种幽门螺杆菌活菌定量测定试剂盒，其制备方法为配置幽门螺杆菌活菌定量测定试剂盒：配置无菌尿素酶试剂；绘制OD值对应的CFU/ml值即每ml菌液中的幽门螺杆菌菌体数量的标准曲线；用高分子材料的板孔或者玻璃材料的瓶子中加入或不加入幽门螺杆菌培养基，封口作为反应板孔；并配装有OD值对应的CFU/ml值标准曲线图卡和无菌尿素酶试剂。

一种幽门螺杆菌活菌定量测定方法，包括以下步骤：配置幽门螺杆菌活菌定量测定试剂盒，将待检样本加入幽门螺杆菌活菌定量测定试剂盒的板孔，或者加入幽门螺杆菌活菌定量测定试剂盒的含幽门螺杆菌培养基的板孔并按幽门螺杆菌培养条件培养后，同时设置空白对照，再在含待检验本和空白对照板孔中加入等体积的上述（1）所述无菌尿素酶试剂，在相同的孵育条件下孵育，在酶标仪578-630nm处读数，得到OD值，对照标准曲线，读取活的Hp具体的CFU/ml数。空白对照一般设置PBS溶液。

所述步骤（3）的幽门螺杆菌培养基为哥伦比亚培养基或布什肉汤等适宜幽门螺杆菌生长的营养基质中添加家畜血液成分；所述步骤（3）的待检样本为疑似幽门螺杆菌的食品、物品以及病人粪便、血液、分泌物；所述步骤（3）加入尿素酶试剂孵育的条件为温度36-38℃，时间10-60min；所述步骤（3）的幽门螺杆菌培养条件为：温度36-38℃的微需氧环境下培养72-96 h，微需氧环境为5%氧气、85%氮气、10%二氧化碳。

所述待检样本和无菌尿素酶试剂体积均相同为10-1000微升。 

所述无菌尿素酶试剂体积配比为：wt2%的尿素8-10份、wt 0.04%酚红0.1-0.5份、wt 0.04%NaH₂PO₄﹒H₂O 3-5份， wt 的0.1%Na₂HPO₄ 2-3份。

一种幽门螺杆菌药敏测定试剂盒，将所述幽门螺杆菌活菌测定试剂盒中的幽门螺杆菌培养基添加抗生素，按配置幽门螺杆菌活菌定量测定试剂盒的方法配置幽门螺杆菌药敏测定试剂盒。

幽门螺杆菌药敏测定方法,如幽门螺杆菌活菌测定方法进行药敏测定。每次加入不同抗生素的量均相等且为临床上常用的添加的抗生素剂量。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）    本发明采用活的幽门螺杆菌进行检测，利用活的幽门螺杆菌能产生尿

素酶的特性，通过检测尿素酶的量来定量检测幽门螺杆菌，解决了现有技术仅能定性检测幽门螺杆菌的不足；

（2）    本发明具体的是基于尿素酶分解胃内尿素生成氨气和二氧化碳的原

理，采用制备尿素酶试剂，通过吸收法检测特定波长的OD值，通过标准曲线读取相应的CFU数，从而能够定量检测幽门螺杆菌，方法简单、快速，可得定量检测数据，并且因为检测的活菌不需要提取DNA而直接进行检测，能够节约操作步骤，同时试剂相对便宜，比其他方法更加经济有效省时省力；

（3）    本发明还能测定不同药物对幽门螺杆菌的作用敏感性，在培养板或培养瓶增添配置了药敏测定试剂盒，利用该测定方法的药敏测定试剂盒能够同时进行多种抗幽门螺杆菌药物敏感性测定，能快速方便筛选出最适宜的抗幽门螺杆菌的敏感药物。此操作简单、迅速，可减少抗生素滥用引起的耐药和机体菌群失调，适宜临床医学的科学个性化治疗。

具体实施方式

下面根据具体实施例对本发明作进一步阐述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1 

幽门螺杆菌活菌定量测定方法

将wt2%的尿素8-10份、wt 0.04%酚红0.1-0.5份、wt 0.04%NaH₂PO₄﹒H₂O 3-5份， wt 的0.1%Na₂HPO₄ 2-3份配置成无菌尿素酶试剂。

绘制OD值对应的CFU/ml值即每ml菌液中的细菌个体数量的标准曲线。     OD值对应的CFU的标准曲线是通过细菌学检测金标准(菌落平板计数)确定的，菌落平板计数具体操作简述如下：

将一定浓度的菌液按10倍梯度稀释，将稀释的菌液取100微升涂板到培养基上，平行3个平板，培养72h后数菌落数，稀释梯度直到平板上只有1-5菌落

时为10¹菌液，再将梯度稀释的菌液做快速尿素酶实验，测其OD值。

标准幽门螺杆菌菌株为：ss1(悉尼株）。

幽门螺杆菌的定量检测:

本实施例选用疑似含活幽门螺杆菌的粪便或者血液或者分泌物等待检样本15例。

1、    配制幽门螺杆菌定量测定试剂盒：用诸如聚乙烯分子等高分子材料的板孔或者玻璃瓶，封口作为反应板孔；并配装有OD值对应的CFU/ml值标准曲线图卡和无菌酶试剂。加入上述待检样本10微升于聚乙烯孔板或者玻璃瓶中，同时设置PBS空白对照，迅速的在待检验本和PBS空白对照板孔中加入10微升无菌尿素酶试剂，在36-38℃孵育10-60 min后，迅速在酶标仪578-630nm处检测OD值。再与标准曲线对比，得出具体的CFU数如下。

 

2、配制幽门螺杆菌定量测定试剂盒：用诸如聚乙烯分子等高分子材料的板孔或者玻璃瓶加入幽门螺杆菌培养基，封口作为反应板孔；并配装有OD值对应的CFU/ml值标准曲线图卡和无菌酶试剂。上述1000微升待检样本于聚乙烯孔板幽门螺杆菌培养基的板孔或玻璃瓶幽门螺杆菌培养基中，同时设置PBS空白对照，将待见样本和PBS空白对照同时在温度36-38℃的微需氧环境（5%氧气、85%氮气、10%二氧化碳）下培养72-96 h后，同时迅速的加入1000微升无菌尿素酶试剂，37℃反应10-60 min，在酶标仪578-630nm处检测OD值。再与标准曲线对比，得出具体的CFU数如下。当待检样本里的幽门螺杆菌活菌个数较小时，需要将其放入培养基中培养，待活菌增大后便于检测，，提高检测的灵敏度，避免漏检。

                    

   从表2、表3和表4可以看出，采用本发明的检测方法能够定量检测出幽门螺杆菌，定量比之定性检测方法能够根据确切的幽门螺杆菌数目得到准确的数值，从而能够准确检测出幽门螺杆菌的量，得到较为准确的结果。

实施例2  

幽门螺杆菌药敏测定方法

将wt2%的尿素8-10份、wt 0.04%酚红0.1-0.5份、wt 0.04%NaH₂PO₄﹒H₂O 3-5份， wt 0.1%Na₂HPO₄ 2-3份配置成无菌尿素酶试剂。

绘制OD值对应的CFU/ml值即每ml菌液中的细菌个体数量的标准曲线。    

OD值对应的CFU的标准曲线是通过细菌学检测金标准(菌落平板计数)确定的，菌落平板计数具体操作简述如下：

将一定浓度的菌液按10倍梯度稀释，将稀释的菌液取100微升涂板到培养

基上，平行3个平板，培养72h后数菌落数，稀释梯度直到平板上只有1-5菌落时为10¹菌液，再将梯度稀释的菌液做快速尿酶实验，测其OD值。

配制幽门螺杆菌药敏测定试剂盒：用诸如聚乙烯分子等高分子材料的板孔或者其他材料如玻璃瓶加入含已知种类和已知剂量的抗生素的幽门螺杆菌培养基，封口作为反应板孔；并配装有OD值对应的CFU/ml值标准曲线图卡。

测定：将10-1000微升的疑似含活幽门螺杆菌的粪便或者血液或者分泌物等待检样本加入含已知种类和已知剂量的抗生素的幽门螺杆菌培养基板孔，在温度36-38℃的微需氧环境（5%氧气、85%氮气、10%二氧化碳）下培养72-96 h后，加入10-1000微升的和待检样本等体积的无菌尿素酶试剂，同时设置只加无菌尿素酶试剂的空白对照，在相同的孵育条件（温度36-38℃，10-60 min）下孵育，在酶标仪578-630nm处读数，得到OD值，对照标准曲线，读取活的Hp具体的CFU/ml数。注：每次加入不同抗生素的量均相等且为临床上常用的添加的抗生素剂量。

加入尿素酶试剂后的孵育时间为10-60 min。在此时间范围内孵育对测定OD值最佳，如不在此时间范围内，则会因为反应时间不充分或者反应时间过久外界因素的影响而使得测定不准。

奥美拉唑、克拉霉素、阿莫西林、PBS空白组的药敏试剂盒检测:

将10-1000微升的活幽门螺杆菌菌液分别加入含奥美拉唑幽门螺杆菌培养基、克拉霉素幽门螺杆菌培养基、阿莫西林幽门螺杆菌培养基、PBS的幽门螺杆菌培养基的聚乙烯板4个板孔中，上述四种幽门螺杆菌培养基的体积相等均为10-1000微升。上样后用封口膜密封孔板，在温度36-38℃的微需氧环境下培养72-96 h，孵育结束后给上述4孔中分别加入尿素酶试剂，在温度36-38℃，孵育10-60 min，然后在578-630nm处读数，记录每组的OD值。读数越低药物抗菌效果越好，读数越高，抗菌效果越差。

通过表5可以看出，药物对幽门螺杆菌的药效可以反映在OD值上，药物抑制幽门螺杆菌越强，其OD值越低、其对于的CFU数也低，说明抗生素抑制了Hp的生长。因此通过此种办法可以看出，采用本发明可对不同抗幽门螺杆菌药物的敏感性定量测定，为临床幽门螺杆菌的治疗药物筛选提供了快速、高效、准确的方法。在临床上更能反应抑制细菌的能力。