优化episomal技术建立人ips的方法

摘要

本发明涉及一种优化episomal技术建立人ips的方法，本发明是建立在无插入的episomal技术上，通过对reprogramming培养中的氧含量降低为5%，外周血培养液为红系培养液，单核细胞在体外培养8天电转，诱导后建系时换为无feeder的E8培养液，使iPS效率又有显著提高，并且iPS细胞系的建立和扩增效率也有明显提高。为建立人iPS细胞库的提供可行性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种建立人ips的方法，特别涉及一种优化episomal技术建立人ips的方 法。

背景技术

2006年，日本科学家Yamanaka的研究组将4种转录因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）导 入小鼠皮肤成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导性多能性 干细胞”(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)^[1]。2007年，Yamanaka博士^[2]和美国 Thomson博士研究组^[3]分别用特定的因子诱导人类成纤维细胞，也使之成为了iPS细胞。iPS 细胞的分离培养成功是干细胞研究乃至生命科学领域的里程碑，它首次证明：可以用已知 的几种因子在体外逆转已经分化的细胞，使之成为全新的具有发育全能性的细胞，这项技 术避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题。

尽管近年来iPS技术不断取得发展，各种改良技术时有出现。然而重编程效率低下一直 都是科学家们头疼的问题，成为了iPS临床转化的重要障碍之一。经典的利用病毒为载体 将转录因子导入分化细胞的方法，很可能导致外源基因插入细胞的基因组中,引起插入突变, 存在很大的弊端，iPS细胞的致瘤性影响其在再生医学和临床细胞治疗中的应用^[4]。转录因 子c-Myc本身就是一种原癌基因。解析体细胞重编程过程中的分子调控机制，开发出高效 安全的iPS技术成为了近年来干细胞领域研究人员的热点。

供体细胞类型影响iPS细胞的形成效率和安全性。2008年，Yamanaka博士的研究组尝 试利用小鼠胃和肝的细胞诱导iPS细胞，发现由胃和肝细胞产生的iPS细胞的成瘤性明显低 于皮肤成纤维细胞来源的iPS细胞^[5]。采集皮肤细胞重编程为iPS细胞需要六七十天时间， 而从血液采集细胞制备iPS细胞只需3周左右，而且人外周血细胞来源丰富，采集方法便 利，创伤性小，安全性好。人外周血细胞是当前最理想的供体细胞之一，具有安全、方便、 数量多等优势^[6]。

使用病毒载体转染外源基因制备iPS细胞不仅操作过程复杂、对实验室设备和管理要求严 格，而且细胞有可能引发肿瘤的形成，这就阻碍了iPS细胞技术的普及和在临床应用的推广。 当前应用基因非整合方法建立iPS细胞主要有以下几个方面1）腺病毒载体，2）质粒或者 minicircle DNA，3）蛋白直接导入，但是这三种方法重建效率均非常低，难以满足基础实验 需要和临床应用研究。仙台病毒^[7]及改良mRNA方法^[8]建立非整合iPS细胞的效率很高，但是 费用相当高，不适用于大规模临床治疗的开展。Episomal Vectors是目前最高效最经济的基因 非整合建立iPS细胞的方法^[9]。

2013年5月张孝兵教授^[10]应用改良的表达Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc的EV成功地将人外周 血单个核细胞重编程为iPS细胞，重编程效率显著高于以往实验报导。我们在此基础上， 我们通过改善培养中的氧含量，培养液，和iPS培养条件使iPS效率又有显著提高，并且iPS 细胞系的建立和扩增效率也有明显提高。

应用EV基因非整合方法将人外周血细胞重编程，建立更安全高效的iPS细胞技术：有 利于下一步建立特异的针对严重危害我国人民身体健康的各种神经系统、血液系统、心脏 和肝脏疾病以及艾滋病的iPS细胞系；有利于发展疾病特异性iPS细胞定向诱导分化的技术， 从而利用这些细胞模型深入研究疾病的发病机制和发生规律；有利于建立iPS细胞和定向 分化模型进行药物评价和筛选；有利于建立iPS细胞库，为再生医学实现个体化治疗。

[1]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and  adult fibroblast cultures by defined factors.Cell.2006;126:663-76.

[2]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult  human fibroblasts by defined factors.Cell.2007;131:861-72.

[3]Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from  human somatic cells.Science.2007;318:1917-20.

[4]Okita K,Yamakawa T,Matsumura Y,et al.An efficient nonviral method to generate  integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells.2013;31:458-66.

[5]Aoi T,Yae K,Nakagawa M,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver  and stomach cells.Science.2008;321:699-702.

[6]Loh YH,Agarwal S,Park IH,et al.Generation of induced pluripotent stem cells from human  blood.Blood.2009;113:5476-9.

[7]Seki T,Yuasa S,Fukuda K.Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount  of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.Nat Protoc. 2012;7:718-28.

[8]Lin T,Ambasudhan R,Yuan X,et al.A chemical platform for improved induction of human  iPSCs.Nat Methods.2009;6:805-8.

[9]Yu J,Hu K,Smuga-Otto K,et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector and  transgene sequences.Science.2009;324:797-801.

[10]Su RJ,Baylink DJ,Neises A,et al.Efficient Generation of Integration-Free iPS Cells from  Human Adult Peripheral Blood Using BCL-XL Together with Yamanaka Factors.PLoS One. 2013;8:e64496.

发明内容

本发明要解决的技术问题是：通过对培养条件（单核细胞培养液，培养时间，质粒选 择，reprogramming中氧含量，iPS单克隆培养换为Feeder free E8培养基）等改良，使 episomal这种重编程效率很低的技术获得新生，效率有非常明显的提高，完全可以用5ml 人外周血就可以获得iPS细胞系的技术。

本发明采用的技术方案为：

一种优化episomal技术建立人ips的方法，包括如下步骤：

利用ficoll梯度离心技术分离外周血单核细胞，利用红系培养体系，即使用红系诱导 培养基培养单核细胞，体外培养8天，利用Amaxa细胞核转染仪电转episomal的pEV SFFV-OS (OS),pEV SFFV-MK(MK),pEV SFFV-B(B)三个质粒，放在feeder上，电转后到利用机械 手段建立iPS细胞系之前在低氧条件下培养；低氧条件：5%O₂，5%CO₂，90%N₂的混合气 体，利用红系诱导培养基培养1天，再应用红系诱导培养基和hESC培养基（质量比1:1） 培养，而后逐渐换成人ES培养基，培养7天换为CM（条件培养基：培养新鲜feeder一天 的ES培养液）。培养12-15天看到人iPS细胞克隆，20天左右将每个克隆挑出培养在24孔 板中，利用feeder-free培养液E8培养液培养。传代10代后检测ES特性，合格的为iPS 细胞系。

进一步，电转后第2天开始在培养基中加入0.25mM NaB提高重编程效率，第10天停 止。

所述的红系诱导培养基为在SFM的基础上进一步添加如下组分：SCF终浓度100ng/ml, IL-3终浓度10ng/ml,EPO终浓度2U/ml，IGF-1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度1μ M，转铁蛋白终浓度100μg/ml。

其中Serum free medium(SFM)组成为：

更具体地，该优化episomal技术建立人ips的方法，包括如下步骤：

利用ficoll梯度离心技术分离外周血单核细胞，利用红系培养体系培养单核细胞，体 外培养8天，利用Amaxa细胞核转染仪进行细胞核转染，1x10⁶细胞加入100μl配置好的 电转缓冲液（包含质粒pEV SFFV-OS(OS)+pEV SFFV-MK(MK)+pEV SFFV-B(B)），混 合均匀后转入电转杯，放到电转槽内，利用U-008转染程序进行电转。放在feeder上，电 转后到利用机械手段建立iPS细胞系之前在低氧条件下培养；用低氧培养箱或低氧培养盒， 在密闭的培养盒或培养箱内冲入5%O2，5%CO2，90%N2的混合气体，每天换液时换气； 利用红系诱导培养基培养1天，应用红系诱导培养基和hESC培养基（质量比1:1）培养， 而后逐渐换成人ES培养基，培养7天换为CM，即条件培养基：培养新鲜feeder一天的ES 培养液。电转后第2天开始在培养基中加入0.25mM NaB提高重编程效率，第10天停止， 培养12-15天可以看到人iPS细胞克隆，20天左右将每个克隆挑出培养在24孔板中，利用 feeder-free培养液E8培养液培养，传代10代后检测ES特性，合格的为iPS细胞系。

进一步，所述的hESC培养基组成为：

本发明所具有的有益效果：

本发明是建立在无插入的episomal技术上，通过对reprogramming培养中的氧含量降 低为5%，外周血培养液为红系培养液，单核细胞在体外培养8天电转，诱导后建系时换为 无feeder的E8培养液，使iPS效率又有显著提高，并且iPS细胞系的建立和扩增效率也 有明显提高。为建立人iPS细胞库的提供可行性。

附图说明

图1为不同的诱导方法对iPS效率的影响对比图；其中纵坐标为克隆数。

图中W柱为实施例1的方法，红系培养8天，张孝兵质粒，低氧培养诱导iPS。

C柱为：程临钊方法：红系培养体系8天诱导，程临钊自己构建的质粒，常氧培养诱导iPS。 Z柱为张孝兵方法是粒系培养体系4天，张孝兵自己构建质粒，低氧培养诱导iPS方法。

图2为利用Tra-1-60活染鉴定诱导克隆图片；图2是实施例1重编程15天时活染结果； Tra-1-60阳性的就是初步认为是重编程的克隆。

图3为ES marker鉴定实施例1的iPS多能型的图片；利用oct4,Nanog,Tra-1-60和SSEA-4 四个多能性marker染色，利用DAPI鉴定细胞核，定位不同的多能性基因表达的细胞位置。

图4为实施例1的iPS畸胎瘤组织切片H&E染色结果图；可以发现三个胚层的组织。

图5为iPS细胞核型鉴定图；显示有正常的人23对染色体，证明iPS具有正常的人核型特 征。

图6为利用EBNA1和OSW两对episomal特异序列引物，PCR鉴定10代iPS细胞系中有无插 入序列图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1

一种优化episomal技术建立人ips的方法，包括如下步骤：

1、采集健康志愿者外周血，分离单个核细胞、髓系CD33⁺细胞或者淋系CD3⁺CD19⁺细胞并预 刺激培养

采集健康志愿者静脉血10ml，用PBS-EDTA1:1稀释后，缓慢加入10ml Ficoll上，400g 离心30分钟，吸弃上清后小心收集单个核细胞层（白膜层）。

天津市血液中心购买新鲜白细胞，同上Ficoll法收集单个核细胞。

将收集的单个核细胞计数后，应用美天旎磁珠分离富集CD33⁺细胞或者CD3⁺CD19⁺细胞；

用红系培养体系培养单核细胞，培养8天，所使用的红系诱导培养基为在SFM的基础上 进一步添加如下组分：SCF终浓度100ng/ml,IL-3终浓度10ng/ml,EPO终浓度2U/ml， IGF-1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度1μM，转铁蛋白终浓度100μg/ml。

注：SFM配置后，用0.2μm filter过滤消毒，4℃冰箱保存，3周内使用。

2、Episomal质粒电转，iPS克隆培养与传代

利用Amaxa细胞核转染仪(Amaxa Nucleofector^TM)进行细胞核转染，按操作说明书进行。 步骤1中单个核细胞培养8天后，计数，1x10⁶细胞加入100μl配置好的电转缓冲液（包含 不同组合质粒如5ug pEV SFFV-OS(OS)+2.5ug pEV SFFV-MK(MK)+2.5ug pEV SFFV-B (B)），混合均匀后转入电转杯，放到电转槽内，利用U-008转染程序进行电转。电转后到 利用机械手段建立iPS细胞系之前在低氧条件下培养。可以用低氧培养箱或低氧培养盒（在 密闭的培养盒或培养箱内冲入5%O₂，5%CO₂，90%N₂的混合气体），每天换液时换气。将 电转后细胞种到预先铺有feeder细胞的6孔板的一个孔中，利用红系诱导培养基培养1天， 应用MNC培养基（红系诱导培养基）和hESC培养基（1:1）培养，而后逐渐换成人ES培 养基，培养7天换为CM（条件培养基：培养新鲜feeder一天的ES培养液）。电转后第2 天开始在培养基中加入NaB(0.25mM)提高重编程效率，第10天停止。

注：配置后0.2μm filter过滤消毒，4℃冰箱保存，3周内使用

第12天开始可见克隆开始形成。第20天左右克隆逐渐成熟，通过机械传代方法，在显 微镜下分离克隆，切成3,4块后吸出，转入FEEDER-FREE的E8培养系统（Invitrogen公司） （Essential8^TMMedium(published as E8)）。一周后可用化学方法（accutase）消化再传代， 一直传10代，形成稳定的iPS细胞系。

如图1所示，我们比较实施例1的方法（图中W柱）和程临钊（图中C柱），张孝兵（图 中Z柱）重编程效率，实施例1优化后显著提高的重编程效率。程临钊方法是红系培养体 系8天诱导，程临钊自己构建的质粒，常氧培养诱导iPS。张孝兵方法是粒系培养体系4天， 张孝兵自己构建质粒，低氧培养诱导iPS方法。

对比试验：粒系培养基包括：Iscove’s modified Dulbecco’s medium(IMDM)+10%FBS 其中TPO,SCF,Flt-3和G-CSF，终浓度100ng/ml；IL-3终浓度10ng/ml；StemRegenin1  or SR1终浓度1uM。

实施例2

iPS克隆染色鉴定，TRA--1--60活染鉴定完全重编程的克隆

将含有克隆的6孔板中，吸掉培养基，PBS洗一遍，每孔加入0.5ml含有抗体的hESC 培养基，37℃,5%CO₂培养箱中孵育1小时。吸掉培养基，每孔加入1ml PBS洗一遍。每 孔加入1ml hESC培养基，在倒置荧光显微镜下观察阳性克隆的情况。如图2所示，Tra-1-60 阳性的就是初步认为是重编程的克隆。

4、NOD/SCID小鼠体内畸胎瘤分析

选取核型鉴定为正常染色体的hiPS细胞，计数，5x10⁶细胞加入100μl的Matrigel  solution，混匀。用1ml注射器种植到NOD/SCID小鼠腹股沟皮下。1个月左右可见小鼠皮 下肿物。切下的肿瘤组织，放入10%甲醛溶液中固定24小时后，进行石蜡包埋、组织切片 和H.E.染色来确定肿瘤的组织形态。

如图4所示，将iPS细胞打到NOD/SCID小鼠腹股沟皮下，可以生成畸胎瘤，组织切片 H&E染色鉴定有三个胚层的组织形态，说明iPS具有分化为三胚层细胞的多能性。

5、iPSCs基因组非整合性分析

iPS克隆传代1，10和15次后，收集细胞，应用Qiagen DNeasy kit提取总DNA。将电 转前细胞的DNA作为阴性对照，将基因组中混有1个拷贝pCEP-OS作为阳性对照，SYBR染 料法进行real-time PCR检测多次传代后iPS细胞中Episomal质粒残留量。CEP质粒DNA 的引物可同时检测游离和整合这两种形式，引物序列如下：

利用载体特异的序列进行PCR测序分析方法，利用EBNA1和OSW两对episomal特异序 列引物，检测发现在我们分析的6个人iPS样品中，传代10代后，6个iPS细胞系中检测 不到插入序列。（如图6所示）

6、iPS细胞的多能性基因鉴定

4%多聚甲醛PFA配制：1)称取4gPFA（有毒，注意防护），置于三角烧瓶或烧杯中。 2)加入50-80ml DPBS，加热至60℃左右，磁力搅拌使粉末完全溶解。3)通常加入少许 1n NaOH才能使溶液清亮。4)最后补足PBS于100ml，充分混匀。

注意：因为PFA有毒、有味，且加热PFA会挥发，通风橱中操作，并用塑料手套或灭 菌用封口膜封口搅拌。

（1）第一天，细胞大约3天时状态比较好（分化细胞较少，细胞足够大），将长好的iPS 细胞用PBS洗涤2次,每次5min。

（4）4%多聚甲醛室温固定15min（4%多聚甲醛实验前准备好）。

（5）PBS洗涤3次，每次5min。

（6）用含0.1%的Triton透膜10min（如为细胞表面标记，此步骤则省略）。

（7）PBS浸泡5min。

（8）将几个孔中加入山羊血清工作液，室温封闭15min。

（9）吸出山羊血清工作液后，每孔分别加入稀释好的anti-Sox2(1:300),anti-SSEA1 (1:500),anti-NANOG(1:100),anti-OCT4(1:200)抗体工作液50-100μl，4℃过夜或37℃ 孵育1.5-2小时。

（10）吸出液体，然后用PBS洗涤3次，每次5min。

（11）每孔再加入相对应的二抗Alexa FLuor488Donken Anti-rabbit IgG或 Alexa555-conjugated goat anti-mouse IgM/IgG(1:1000)，室温避光孵育1小时或4℃过 夜。

（12）吸出液体，PBS洗涤3次，每次5min。

（13）DAPI复染，5min。

（14）PBS洗涤两次，然后用蒸馏水冲洗后晾干。

（15）共聚焦显微镜下观察实验结果。

如图3所示，利用Oct4，Nanog两个核内和Tra-1-60,SSEA-4两个细胞膜上的merker，利 用免疫荧光染色的方法鉴定。说明iPS表达ES多能性Marker基因，初步认定具有ES多能 性。

7、细胞核型鉴定

准备配置：1)低渗液配制：0.4%KCL用时放入37℃预热。2)固定液配制：甲醇： 冰醋酸=3：1，现用现配。3)G显带消化液配制：胰酶(Sigma G4507-5G)30mg，加入0.9% 生理盐水（or D-Hanks）50ml中，用时37℃水浴30min。

步骤如下：

（1）当iPS细胞大小合适时，约传代2天时，加入0.2-0.25g/ml的秋水仙素处理细胞 3.5-4小时。

（2）配低渗液（0.4%KCl现用现配，一个系用5mL），并在水浴锅中预热胰酶（每个细胞系 约500μl胰酶）和低渗液。

（3）加入0.025%的胰酶消化，加入mESM进行中和，将中和后的细胞吹打为单细胞，800～～1000 rpm离心5分钟后，弃上清，收获细胞。

（4）将收获的细胞中加入预热的低渗液51ml，低渗5min at37℃。同时配固定液（甲 醇与冰醋酸按3：1配，现用现配，一个系7mL)。

（5）预固定。加固定液7滴，轻轻以气泡冲匀，离心800～～1000rpm离心5min。

（6）固定：去上清，加入固定液4ml，轻轻以气泡冲匀，固定40分钟。离心800～～1000rpm 离心5min，去上清，加固定液2ml，第二次固定20min。（这两步固定都可以4℃或室温 过夜）。

（7）滴片：离心800～～1000rpm离心5min，去上清，加入新鲜固定液3～～4滴，气泡冲匀， 即可进行滴片2～～3张。

（8）滴片时将细胞悬液1～～2滴，滴到预先遇冷过的4℃冰水或干燥的洁净玻片上，晾干。

（9）放入65℃烤箱中烘烤过夜或80℃烘烤两小时。

（10）染色：第二天取出烤干的载玻片加入1滴Giemsa原液，15秒后，加入2滴稀释后的 磷酸缓冲液（磷酸缓冲液的稀释为：1份磷酸缓冲液原液加上9份等体积的蒸馏水），并用 吸耳球吹打均匀后，进行染色。染色时间为室温10分钟。10分钟后用流水轻轻清洗，室温 晾干后进行核型分析。在一组实验中，我们随机选择20个以上的细胞中期分裂相进行观察 并统计核型的正确率。

（11）核型显带：将配好的消化液放入水浴中30分钟，并加入3%Tris（PH=7.6）15滴打 匀起泡，放入烤后的片子，继续打泡，20s-25s（每个地方条件不一样，较干燥的地方时 间较短)后，取出片子迅速放入干净清水中洗掉胰酶，用Giemsa染液室温10min。然后用 流水轻轻清洗，室温晾干后就可以进行核型分析。

如图5所示，利用核型分析软件对分裂中期的染色体进行分析，显示有正常的人23对染色 体，证明iPS细胞具有正常的人核型。