一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒

摘要

本发明提供一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒，包括DNA提取剂、PCR试剂管成分、阴性对照和阳性对照；本发明弥补了国内CI-HHV-6检测的空白，通过本试剂盒检测样品DNA于178bp处有无特异性扩增条带，便可判断样品细胞内是否感染染色体整合人疱疹病毒6型，操作简单，灵敏度高，特异性强。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因检测技术，特别是一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒。

背景技术

    人疱疹病毒6型(Human Herpesvirus 6, 以下简称HHV-6)，是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA病毒，于1986年由美国癌症中心的Salahuddin等首先从淋巴增生及AIDS病人的外周血单个核细胞中分离得到，属于β疱疹病毒亚科。HHV-6在体内可感染多种细胞，但最敏感的是外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的CD4+T细胞。HHV-6在人群中普遍感染，血清HHV-6 IgG抗体阳性检出率很高。原发感染大都在婴儿期，是引起婴幼儿急疹(exanthem subitum, ES)的病原，随后潜伏并持续存在于宿主体内，不引起临床症状。当人体受到各种非特异性刺激、机体抵抗力减弱、免疫功能低下时，容易发生HHV-6的再激活或外源性再感染。临床研究表明HHV-6与多发性硬化症(MS)等中枢神经系统疾病相关；它是骨髓移植、器官移植等免疫抑制患者中的主要致病性病原，也是引起严重移植物被排斥的重要病因；HHV-6在HIV感染后发展成AIDS过程中起促进作用；此外，HHV-6也是一肿瘤相关病毒，其DR7基因具有转化能力，发现其与人类多种肿瘤如淋巴瘤、白血病、口腔癌等有关。

    HHV-6与其他疱疹病毒一样，病毒颗粒呈球形，有包膜，平均直径约为150纳米（nm)。基因组为线状双链DNA。其核衣壳与包膜之间为基质蛋白组成的皮层（Tegument），它是人类疱疹病毒家族中唯一可以整合到人类染色体末端的病毒，在此情况下HHV-6的完整基因组可以整合到人类染色体的端粒末端，称为染色体整合的人疱疹病毒6型(Chromosomally integrated HHV-6，以下简称CI-HHV-6)。国外研究表明，健康人群中HHV-6的整合率为1%左右，在脑炎患者中整合率为3% ，并且整合的HHV-6可以游离下来，引起HHV-6的再激活。因此检测人群中CI-HHV-6的发生率，以及CI-HHV-6与HHV-6相关疾病的发生是否有相关性显得尤为重要。

     在感染CI-HHV-6个体中，每个有核细胞都稳定整合一份HHV-6完整基因组，并以50%的概率稳定传给后代。在人群中，潜伏感染的非染色体整合形式的HHV-6病毒在全血中含量很低，通常利用巣式PCR在人外周血中检测HHV-6 DNA，但巣式PCR检测灵敏度极高，极易受空气中微量的气溶胶的污染，导致检测结果假阳性；CI-HHV-6可通过染色体荧光原位杂交（fluorescence in 1 situ hybridization ，FISH)检测，但FISH技术首先需要培养人外周血细胞，制备人类中期染色体，合成HHV-6特异性荧光探针，并进行杂交后洗脱，检测周期长，假阳性高；另外CI-HHV-6也可通过荧光定量PCR（以下简称Q-PCR）检测，但Q-PCR检测需要特异的引物、探针和Q-PCR酶，并且需要专门的荧光定量PCR仪，检测成本比较高，不利于大规模人群普查重复使用。

 

发明内容

针对目前CI-HHV-6检测存在的不足，提供一种操作简单，灵敏度高，可用于CI-HHV-6快速诊断与流行病学调查的试剂盒，本发明是这样实现的：

    一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：

A）DNA提取剂：红细胞裂解液、Proteinase K溶液、DNA抽提液、NaAc、无水乙醇、体积比为75%乙醇、 TE缓冲液；其中，所述红细胞裂解液配方为139.6 mmol/L NH4Cl溶液中加入16.96 mmol/L Tris-HCl；DNA抽提液为体积比为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇；TE缓冲液配方为10mmol/L Tris-HCl溶液中加入1mmol/L EDTA；

B）PCR试剂管成分：2×Taq Master Mix 15μl、ddH₂O 11μl、1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.1 以及1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.2 ；

其中SEQ ID No.1：5' -GTTGACGGTGGAAGCCTTTTTA -3'；

SEQ ID No.2：5'- TTTAGCGGGGACCATGTAGTTG -3'；

C）阴性对照：已灭菌的双蒸水；

D）阳性对照：人疱疹病毒6型标准株GS DNA 。

本发明弥补了国内CI-HHV-6检测的空白，在涉及CI-HHV-6特异性引物的基础上研制成的简单、快速检测CI-HHV-6的试剂盒，通过本试剂盒检测样品DNA于178bp 处有无特异性扩增条带，便可判断样品细胞内是否存在染色体整合人疱疹病毒6型，2小时即可出结果，操作简单，灵敏度高，特异性强。

附图说明

图1 为25-36号样品PCR检测电泳图。

图2 为380-392号样品PCR检测电泳图。

图3 为467-480号样品PCR检测电泳图。

图4 为HHV-6 U22标准品的PCR电泳图。

图5 为 pMD19T-U22重组质粒的双酶切鉴定电泳图。

图6为Q-PCR 标准曲线。

图7 为467-480号样品Q-PCR检测结果。

具体实施方式

实施例1  人外周血CI-HHV-6检测

（1）样品DNA提取：红细胞裂解液、Proteinase K溶液（南京凯基生物科技发展有限公司）、DNA抽提液、NaAc、无水乙醇、体积比为75%乙醇、 TE缓冲液；其中，所述红细胞裂解液配方为139.6 mmol/L NH4Cl溶液中加入16.96 mmol/L Tris-HCl；DNA抽提液为体积比为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液；TE缓冲液配方为10mmol/L Tris-HCl溶液中加入1mmol/L EDTA。；

（2）PCR试剂管成分：2×Taq Master Mix 15μl，ddH₂O 11μl，1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.1 ，1.0μl浓度为10μM的引物SEQ ID No.2 ；

SEQ ID No.1：5' -GTTGACGGTGGAAGCCTTTTTA -3'；

SEQ ID No.2：5' -TTTAGCGGGGACCATGTAGTTG -3'。

（3）阴性对照：已灭菌的双蒸水；

（4）阳性对照：HHV-6标准株GS DNA；

按照以下的程序进行检测：

（1）样品DNA提取：收集500份人外周血，各取1ml血液样品加入2ml的红细胞裂解液，颠倒混匀，10,000 rpm离心1 min，吸去上清，在沉淀中加入20μl Proteinase K溶液， 55℃水浴1h；加等体积的DNA抽提液，颠倒混匀后12000rpm离心10min，再加入等体积DNA抽提液，12000rpm离心10min后再加入1/10体积2.5 mM NaAc和2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，－20℃沉淀过夜。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加体积比为75%乙醇1ml/管，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，室温晾干，沉淀即为DNA，加100μl TE溶解，获得与500份人外周血对应的DNA提取液，它们的编号分别为1-500；

（2）PCR扩增，在PCR试剂管内加入DNA提取液2.0μl，置于PCR仪中（美国PE公司MJ-PTC-100）进行扩增：94℃预变性5 min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s, 循环30次， 72℃ 延伸8 min；同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照中在PCR试剂管内加入HHV-6标准株GS DNA（香港大学吴文翰教授赠予），阴性对照中在PCR试剂管内加入灭菌的ddH₂O 2μl；

（3）PCR扩增产物分析，取8μl的扩增产物，置于浓度为1%的琼脂糖凝胶溶液中，100V下电泳20min后在体积比为5%的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观测结果。

    图1、图2、图3分别对应500份样品中出现特异性条带样品的检测电泳图，其中M泳道为DNA标准值，P泳道为阳性对照，N泳道为阴性对照，其中，28、36、392、479号泳道在178bp 处有特异性扩增条带，则认为该四个泳道对应的样品细胞内存在染色体整合人疱疹病毒6型。

实施例2    Q-PCR法对467-480号样品进行染色体整合人疱疹病毒6型检测对照

 实施例涉及的引物序列：

SEQ ID No.3：5'–CGCTCGGAAAGGAAACATTA–3'

SEQ ID No.4：5'–AAGTGGAACTGCTTGGTGGC–3' 

引物序列构建参考“人类疱疹病毒6A 对神经细胞的嗜性及细胞周期的影响”郭丹丹等，南京医科大学学报，2011年7月。

   （1）重组标准质粒pMD19T-U22的构建

    以HHV-6标准株GS DNA 为模板（香港大学吴文翰教授赠予）以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物。

    PCR反应体系：2×Taq Master Mix (北京百泰克生物技术有限公司生产) 15μl， 1.0μl浓度为10μM的SEQ ID No.3，1.0μl浓度为10μM的SEQ ID No.4 ，样品DNA2.0μl，ddH₂O 11μl。

    PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s, 循环30次， 72℃ 延伸8 min。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，称取0.5 g琼脂糖于烧瓶中，加入50 ml TAE，微波炉中加热至完全溶解，冷却至60℃时加入EB 2.5μl，混匀，充槽，室温冷却30min后, 加10μl PCR产物进行电泳。如图4所示，HHV-6 DNA中U22基因在194bp中存在特异性扩增条带，其中1泳道是HHV-6 U22 PCR片段，M泳道是DNA标准品D2000，参照胶回收试剂盒(Agarose GeL DNA Extraction Kit ver. 3,0, TaKaRa)回收目的片段。

U22基因片段与克隆载体pMD19-T（购自TaKaRa）连接，连接反应体系：2× ligation buffer 5.0μl，pMD19-T 载体 0.5μl，U22 PCR产物 2μl ，ddH2O 2.5μl。 16℃连接30min，连接产物转化DH5α感受态细菌（购自TIANGEN公司）。转化的质粒在DH5α中大量扩增，提取质粒DNA，溶于100μlTE中用于后续实验。带有U22基因的克隆载体命名为pMD19T-U22。对连接产物pMD19T-U22进行双酶切鉴定。双酶切鉴定体系：10×K Buffer 2.0μl，pMD19T -U22，5.0μl，EcoRⅠ1.0μl，HindⅢ  1.0μl， ddH2O  11μl，37℃酶切2h后进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图5所示，其中M泳道是DNA标准品DL5000，1泳道是pMD19T-U22双酶切结果，从电泳结果可见大、小2条带，分别符合酶切后质粒载体pMD19T (2692bp)和目的片断U22的长度（194bp），说明U22基因片断已连接到pMD19-T载体上，重组标准质粒pMD19T-U22构建成功。

其中EcoRⅠ和HindⅢ购自TaKaRa公司。

（2） 建立Q-PCR标准曲线

用分光光度计测定pMD19T-U22重组质粒的浓度，根据质粒的分子量与质粒浓度，计算拷贝数，制得标准品，换算公式：

    质粒拷贝浓度(copy/μl )：C=(质粒浓度×6.02×10²³ )/质粒分子量（MW）。

    将标准品按10倍梯度稀释成10^-1－10^-6，以浓度梯度标准品为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物分别进行Q-PCR扩增，建立反映Ct值与质粒浓度对应关系的定量标准曲线；同时以灭菌水代替DNA模版，进行阴性对照。

    Q-PCR反应体系：

    SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μl；

    0.8μl浓度为10μM的SEQ ID No.3 ；

    0.8μl浓度为10μM的SEQ ID No.4 ；

    标准品DNA模板2.0μl；

    6.4μl的ddH₂O；

    Q-PCR扩增程序：Stage 1: 预变性 95℃ 30s；Stage 2 ：循环反应：95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环；Stage 3溶解曲线95℃ 15s, 60℃ 60s, 95℃ 15s。 

读取Ct值，进行记录分析，以起始浓度拷贝数的log值为横坐标，以Ct值为纵坐标，y=-3.0783x+50.387，R²=0.9965，绘制标准曲线，如图6所示。

（3） 对实施例1中467-480号样品用Q-PCR方法检测，与实施例1进行对照

    A）样品DNA提取，取实施例1中467-480号样品的DNA提取液；

    B）以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物，进行Q-PCR检测：

    Q-PCR反应体系：

    SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μl，

    0.8μl浓度为10μM的SEQ ID No.3，

    0.8μl浓度为10μM的SEQ ID No.4，

    样品DNA2.0μl，

    6.4μl的ddH₂O ；

    Q-PCR扩增程序： Stage 1: 预变性 95℃30s；Stage 2 ：循环反应：95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环；Stage 3溶解曲线95℃ 15s, 60℃ 60s, 95℃ 15s。

   467-480号样品Q-PCR反应结果如图7所示，测得479号样品HHV-6全血拷贝数为5.3×10⁶/ml，鉴于每毫升人全血中总细胞的数目大约在5×10⁶至1×10⁷之间，CI-HHV-6的个体每个细胞中都含有一份HHV-6基因组，则其对应的样品细胞内存在染色体整合人疱疹病毒6型，与实施例1中的检测结果一致。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京医科大学

 

<120>  一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒

 

<130>  4

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

gttgacggtg gaagcctttt ta                                              22

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

tttagcgggg accatgtagt tg                                              22

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

cgctcggaaa ggaaacatta                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

aagtggaact gcttggtggc                                                 20