与大白菜PHYB基因mRNA5′非翻译区突变相关的InDel标记及其应用

摘要

本发明公开了一种与大白菜PHYB基因mRNA的5'端非编码区突变相关的共显性InDel标记：与phyB3检测相关的标记命名为InDel-phyB3，片段大小139bp，如SEQIDNo.1所示；与phyB4检测相关的标记命名为InDel-phyB4，片段大小121bp，如SEQIDNo.2所示。本发明还公开了检测该标记的一对引物：序列如SEQIDNO.3、4所示。本发明还公开了该标记和引物在选择含有InDel-phyB3或InDel-phyB4突变类型的种质材料或转育后代中的应用，为培育耐抽苔大白菜提供辅助选择的工具，本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。

说明书

技术领域

本发明涉及一对与大白菜抽薹时间候选功能基因突变有关的分子标记，尤其涉及一对基 于光受体基因PHYB的mRNA5'非翻译区（UTR）突变相关的共显性InDel标记及其应用，该 标记为选育含相应类型耐抽苔大白菜材料和新品种提供辅助选择的工具，可以提高选择效率， 属于生物技术领域。

背景技术

大白菜(BrassicarapaL.ssppekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物，原产于中国， 在世界各地尤其是东南亚广泛种植。目前，已经育成了适合春、夏、秋不同季节栽培的大白 菜新品种，使得大白菜实现了周年供应，这对保证蔬菜市场供应、稳定物价起到了积极的作 用。

在不同季节栽培的大白菜品种中，春白菜对品种耐抽苔性的要求最高，主要是因为春白 菜栽培季节面临前期环境低温和后期环境日照较长的影响。如果春白菜品种的耐抽苔能力不 强，则前期低温极易使幼苗通过春化，导致后期叶球内短缩茎较长、甚或已经抽薹，从而影 响产品的商品价值和品质。所以，春白菜育种的关键是拥有极耐抽薹的育种材料以及获得与 耐抽苔特性紧密连锁的分子标记，以提高春白菜的育种效率。

目前，已经有与大白菜抽薹开花相关的分子标记报道【卓祖闯.大白菜耐抽薹性状遗传规 律分析及其分子标记的筛选.西北农林科技大学硕士学位论文；郁有健.大白菜抽薹开花相关 基因SNP分析与晚抽苔开花性状QTL定位.东北农业大学硕士学位论文；高颖，罗双霞，王 彦华，顾爱侠，赵建军，陈雪平，申书兴.大白菜抽薹开花时间与SSR和InDel标记的关联分 析.园艺学报.2012,39(6):1081-1089】，但所得到的标记要么是数量性状位点，要么连锁 程度不够紧密，很难用于育种辅助选择。因此，有必要寻找基于抽薹开花途径相关基因突变 的位点特异性分子标记，以提高选择的精准度。

大白菜与模式植物拟南芥亲缘关系较近，同属于芸薹属，因此拟南芥抽薹开花机制研究 的有关结果可以为大白菜相关研究提供借鉴。对模式植物拟南芥的研究结果表明：植物开花 受四条途径控制，即自主途径、赤霉素途径、春花途径和光周期途径。四条途径并非彼此相 互独立，而是通过一些整合基因形成一个复杂的调控网络，协同控制拟南芥的开花【徐雷,贾 飞飞，王利琳.拟南芥开花诱导途径分子机制研究进展.西北植物学报.2011,31(5):1057- 1065】。在光周期控制的开花途径中，起关键作用的是光受体及其介导的信号传导，拟南芥基 因组中的光受体有3类，即光敏色素、隐花色素和向光色素，其中光敏色素和隐花色素参与 光周期调节的植物开花【赵淑清,罗志鹏,李昱.拟南芥光周期调控开花的研究进展.山西大 学学报(自然科学版).2009,32(2):308-314】。在拟南芥基因组中有两个隐花色素(CRY1和 CRY2)和五个光敏色素(从PHYA到PHYE)，CRY1有促进开花的作用，cry1突变体在短日照下 推迟开花【MocklerTC,GuoH,YangH,DuongH,LinC..Antagonisticactionsof ArabidopsiscryptochromesandphytochromeBintheregulationoffloralinduction. Development.1999,126(10):2073-2082.】；CRY2在长日照下促进开花,cry2基因突变或 过量表达均能导致对光周期的敏感性下降[GuoH,YangH,MocklerTC,LinC. RegulationoffloweringtimebyArabidopsisphotoreceptors.Science.1998, 27;279(5355):1360-1363]。光敏色素中PHYA和PHYB在接收光信号中发挥重要作用【Meng ChenandJoanneChory.Phytochromesignalingmechanismsandthecontrolofplant  development.TrendsCellBiol.2011,21(11):664–671】。PHYA在黑暗和远红光条件下 积累而在红光下迅速降解，它在拟南芥中具有促进开花的作用，该基因突变导致植株晚开花； PHYB则在红光下相对稳定，在长日照和短日照条件下均有抑制开花的作用，phyB单基因突变 体在长日照和短日照条件下均比野生型明显提早开花【GotoN,KumagaiT,KoornneefM. Floweringresponsestolight-breaksinphotomorphogenicmutantsofArabidopsis thaliana,along-dayplant.PlantPhysiol.1991,83:209-215】。由此可见，植物体内 的光受体决定了光周期的信号传导，从而决定植物在感受光信号后的发育状态。

大白菜全基因测序工作已经完成【Wangetal.,2011，thegenomeofthemesopolyploid cropspeciesBrassicarapa.NatureGenetics.43(10):1035-103)】，通过与拟南芥全基 因比较，其相关功能基因的预测和注释也已完成并制作成数据库【ChengF,LiuS,WuJ,Fang  L,SunS,LiuB,LiP,HuaW,WangX.BRAD,thegeneticsandgenomicsdatabasefor  Brassicaplants.BMCPlantBiol.2011,11:136】，其中对开花基因的注释有专门的检索 菜单。在大白菜基因组中，CRY1有两个拷贝、分别位于A08和A10染色体上；CRY2是单拷贝、 位于A09上；PHYA是双拷贝、位于A06和A09上；PHYB则是单拷贝、位于A05上。没有发现 PHYC-PHYE的同源基因。

我国有适合不同季节栽培的大白菜种质资源，其抽薹开花性状差异较大，其中不乏长、 短日照条件下开花时间存在显著差异的材料，但至今未见有关光受体突变与开花时间有关的 报道。鉴于在模式植物拟南芥中发现的光受体对抽薹开花时间影响的相关结果，推测在大白 菜中也存在光受体控制的晚开花突变体资源，因此，有必要对我国丰富的大白菜资源在CRY1、 CRY2、PHYA和PHYB位点进行筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点 与野生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。有以下几个方面的潜 在益处：①可以将该标记用于筛查大白菜种群，提高晚开花大白菜资源的检测效率；②当其 他位点发现突变类型时，可以采用同样的方法开发标记；③当多个位点的突变位于不同的材 料中时，可以通过标记辅助选择手段将多位点突变聚合在一起，创造极耐抽薹的大白菜新种 质；④在培育耐抽苔大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。由于这种标 记直接位于功能基因内部，因此选择的准确率达100%。

发明内容

针对上述现有技术，针对目前大白菜在光受体基因位点突变体鉴定方面的空白，本发明 首先获得了PHYB基因mRNA5'端非编码区存在InDel突变的两种等位变异类型phyB3和phyB4， 与BRAD数据库中大白菜基因组序列相比，phyB3与数据库中Chiifu401的PHYB基因mRNA5' 端非翻译区有两处SNPs和一个InDel差异，而phyB4与数据库中Chiifu401的PHYB基因 mRNA5'端非翻译区有18处SNPs和23个InDels差异，其中靠近起始密码处20bp的InDels 突变适合开发共显性标记。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种与大白菜PHYB基因mRNA的5'端非编码区小片段插入/缺失突变有关的共显性InDel 标记：与phyB3检测相关的标记命名为InDel-phyB3，片段大小139bp，如SEQIDNo.1所示； 与phyB4检测相关的标记命名为InDel-phyB4，片段大小121bp，如SEQIDNo.2所示。

用于鉴别上述位点特异性共显性分子标记的引物是：

正向引物PF2：5'-AGAATCTCTCGGCTTCAATTTTC-3'；

反向引物PR2：5'-CCGCCGCCGACTCCGGAA-3'；

如SEQIDNO.3、4所示。

本发明采用同源克隆技术从两份开花时间存在显著差异的大白菜自交系材料He102(长、 短日照下开花早)和06-247(长、短日照下开花晚)的苗期总RNA逆转录产物中分别克隆到了 PHYB基因5'端非翻译区约260bp的一段cDNA序列，将来自两份材料的cDNA片段与BRAD数 据库中相应的基因组序列进行比对发现：来自晚开花材料06-247的cDNA片段与BRAD数据库 中的序列同源性高达99%以上，仅有2个SNP和1个单碱基插入缺失的差异，我们称此种突 变类型为phyB3，而来自极早开花材料He102中的序列则在该区域存在小片段的缺失，称其 为phyB4。在缺失部位两侧的保守区域设计引物，开发了区分两种等位变异的共显性InDel 标记。为了验证该标记的可用性，我们用设计的引物扩增了He102和06-247构建的F2群体， 结果表明该标记对纯合phyB3、phyB4以及杂合型鉴别的准确率达100%。

所述InDel标记的筛选过程如下：

(1)以长/短日照下大白菜早花自交系He102与晚花自交系06-247为材料，采用Trizol 试剂，提取两者幼苗叶片总RNA并反转录成cDNA。

(2)在BRAD数据库中查找PHYB基因所在的物理位置，下载起始密码上游300bp和下游 100bp的DNA序列，设计引物以各自cDNA为模板进行PCR扩增并对扩增产物进行测序，得到 了各自5'非翻译区域的部分EST序列。

(3)将两者所得序列进一步与已知序列进行比对发现，06-247(晚花表型)与BRAD数据库 中的序列同源性高达99%，仅有2处SNPs和1个InDels差异，称为phyB3；He102(早花表型) 的序列与已知序列相比，除了多处SNPs外、还有一处20bp的小片段缺失突变，称为phyB4。

(4)5'非翻译区是基因翻译水平调控的重要区域，控制着翻译的效率，在缺失部位两侧 保守区域设计引物，开发了能区分两种等位变异的共显性标记，该标记的扩增以gDNA为模板， 操作简单。该引物组合在phyB3基因型中能扩出139bp的条带，命名为InDel-phyB3，在phyB4 基因型中，能扩出121bp的条带，命名为InDel-phyB4。如果能够扩出两条带，则该材料是 杂合型。

所述分子标记可以作为分子标记应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有 InDel-phyB3或InDel-phyB4突变类型的种质材料或转育后代。具体应用方式为：利用InDel 标记的一套引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，在聚丙烯酰胺凝胶上检测扩增片段 大小，如果扩增出139bp的条带，则为晚抽薹类型；扩出121bp的条带，则为早抽薹类型； 如果同时扩出139bp和121bp的两条带，则为杂合型。对于杂合型个体应视情况而定：如果 杂合型材料是一份资源，则表明该资源在此位点不纯，需要继续自交分离，直至在其后代中 获得纯合InDel-phyB3晚抽苔类型；如果是回交转育后代，则继续选择杂合型个体为母本， 用纯合InDel-phyB3晚抽苔类型的花粉给其授粉，经过6～8代转育后，最后再自交一次，即 可将早抽薹类型的材料改造成晚抽苔类型。如果扩不出条带，可能是基因组DNA提取的不纯 或该材料在此位点发生了其它类型的突变。

本发明的有益效果是：由于大白菜光敏色素受体PHYB基因的表达除了受启动子序列的影 响外，5'端非翻译序列对翻译起始复合物的装配、以及在mRNA上滑动以找到起始密码的效率 有着重要的调控作用。本发明通过扩增其cDNA产物，发现了两种PHYB基因5’端非翻译序 列存在差异的等位变异突变体phyB3和phyB4，二者在5'UTR区存在较小片段的插入/缺失差 异。根据缺失区域两侧保守序列设计一对引物，通过对基因组DNA进行PCR扩增，在聚丙烯 酰胺凝胶上就能很容易地区分两种突变类型。该标记不仅可用于对大白菜种质资源进行筛查， 以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料，还可以用于对杂交后代进行标记辅助选择，以转育 晚花性状。

本发明优点具体如下：

1.本发明获得的与PHYB基因两种等位变异突变体直接相关的标记，结果准确、稳定、操 作简便。适用于不同遗传背景大白菜材料的筛选，是一个普遍性标记。它能够准确鉴定大白 菜种质资源在该位点的基因型，极大地提高了大白菜种质资源在PHYB位点等位变异的鉴定效 率。

2.在大白菜PHYB基因序列及突变体研究方面，国内外未见相关报道。本发明鉴定了两种 PHYB基因5'UTR区的等位变异突变类型，其中与晚花有关变异类型的标记可以为培育耐抽苔 大白菜提供辅助选择的工具，同时也可以用于大白菜种质资源鉴定。本发明的应用可大大简 化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。

附图说明

图1：特异引物在06-247与He102中的扩增结果，M为DNA分子量标准DL5000。

图2：来自06-247与He102的序列与BRAD数据库中Chiifu-401的PHYB基因同源序列 的比对结果。

图3：来自06-247(phyB3)、He102(phyB4)、Chiifu-401的PHYB5'端UTR区域的预测 的二级结构差异。

图4：共显性InDel标记的开发即标记所述引物在He102和06-247中的扩增结果。

图5：InDel标记的应用－对He102×06-247构建的F2群体部分单株的检测结果，其中 P1和P2分别是双亲He102和06-247；18没有扩增条带，可能是基因组提取有问题；1、19、 22、23、26、27、33、44是亲本P1即He102中等位变异类型phyB4；单株2、3、5、9、10、 12、13、16、28、35、37、45是亲本P2即06-247中的等位变异类型phyB3；其余单株是杂 合型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1不同大白菜自交系材料中PHYB基因启动子序列的克隆

1.1大白菜总RNA提取

（1）将大白菜幼苗叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

（2）待液氮挥发干，立即转移到1.5ml的离心管中，每100mg材料约加入1mlTrizol试 剂震荡混匀，室温放置5min后加入200μl氯仿，震荡混匀后室温放置5min；

（3）4℃，12000rpm离心15分钟；

（4）用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(按 1:1体积比例)，充分混匀，室温沉淀10min；

（5）在4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

（6）RNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心5min收集沉淀；

（8）重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；

（9）去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，加入适当体积（10μl）的 DEPC处理水溶解；

（10）紫外分光光度计及1%Agrose（琼脂糖）凝胶电泳检测RNA浓度及质量，用天根 生化科技有限公司的TIANScriptcDNA第一链合成试剂盒(KR104)进行逆转录反应合成cDNA 后-20℃保存备用。

1.2PHYB基因5'端EST的克隆及序列分析

(1)检索BRAD数据库中注释为PHYB的基因所在的染色体物理位置并下载其起始密码上 游300bp及下游100bp的序列。设计上、下游引物：

正向引物PF1：5'TGAACCGTAGCCCAATTTCTACC3'

反向引物PR1：5'CCGCCGCCGACTCCGGAAACCAT3'，委托华大基因有限公司合成。

引物序列如SEQIDNO.5和6所示。

(2)PCR扩增：在20μl反应体系中，包含1×TransStartFastPfubuffer；20ng的基 因组DNA；0.4μM正反向引物；0.25mMdNTPmix;1个标准单位的TransStartFastPfuDNA 聚合酶(TransGenAP221)。PCR循环条件：95℃预变性5分钟；接着是95℃变性30秒， 57.5℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35～38个循环，最后72℃延伸10分钟。

(3)PCR产物的电泳检测：

PCR结束后，取10μlPCR扩增产物加入1μl10×loadingbuffer，在2.5%的琼脂糖凝 胶上进行电泳，电泳结束后EB染色，自动凝胶成像系统观察拍照。结果如图1。

(4)PCR产物的克隆测序及序列分析

电泳确认目的条带被扩增后，取1μlPCR扩增产物加1μlpEasy-Blunt(TransGenCB101) 载体室温连接10分钟，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(TransGen：CD501)，转化菌在 含Kan50μg/ml的LB固体平板上37℃倒置培养16小时左右。菌落PCR检测后挑取阳性克 隆委托北京华大基因有限公司进行DNA序列的测定。

从06-247的cDNA产物中扩增得到的PHYBEST长259bp，序列如SeqIDNo.7所示。从 He102中得到的序列长240bp，序列如SeqIDNo.8。经与BRAD数据库中(Chiifu-401)PHYB 基因相关序列比对发现，06-247的EST有两处SNPs和两个InDels，而He102的EST却有24 个SNPs和一处20bp的小片段缺失(图2)。缺失区域位于起始密码上游40bp以内，用DNAMAN 软件对各自的RNA的二级结构进行预测，发现，即使是06-247中的4处突变，也对二级结构 造成了较大影响(图3)，这种RNA二级结构的差异对翻译起始复合物的形成以及核糖体在 5'UTR区滑动会产生重要的影响，从而影响PHYB的翻译效率，鉴于此，我们将来自06-247 中等位基因命名为phyB3，将来自He102的等位基因命名为phyB4。

实施例2共显性InDel标记的开发

2.1引物设计

仔细比较PHYB基因两种等位变异phyB3和phyB4的EST对应的基因组序列，其差异主要 在靠近起始密码处、尤其是20bp的小片段插入/缺失突变(如图2所示)。在两侧保守区设计 引物如下：

正向引物PF2：5'-AGAATCTCTCGGCTTCAATTTTC-3'；

反向引物PR2：5'-CCGCCGCCGACTCCGGAA-3'；

引物序列如SeqIDNo.3、4所示，委托华大基因有限公司合成。

2.2InDel标记的获得

(1)以He102和06-247的基因组DNA为模板，采用普通taq酶进行一次PCR扩增PCR循 环参数为：95℃预变性5分钟；接着是95℃变性20秒，58.5℃退火20秒，72℃延伸40秒， 35～38个循环，最后72℃延伸5分钟。

(2)扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测、银染照相，结果如图4所示。从图中可 以看出，引物PF2和PR2从具有phyB3类型的06-247(晚花表型)中扩出139bp的条带，从具 有phyB4类型的He102(早花表型)中扩出了121bp的条带，此即共显性InDel标记。前者称 为InDel-phyB3，如SEQIDNo.1所示；后者称为INDEL-phyB4，如SEQIDNo.2所示。

实施例3InDel标记对He102×06-247构建的F2群体的检测。

(1)F2群体不同单株基因组DNA提取采用CTAB法。

(2)PCR扩增：PCR反应液的配制及扩增条件如1.2第(2)条所述。

(3)PCR产物的检测如2.2第(2)条所述。检测结果如图5所示：P1和P2分别是双亲He102 和06-247，1-45是45个F2单株。图中单株18没有扩增条带，可能是基因组提取有问题，1、 19、22、23、26、27、33、44是亲本P1即He102中等位变异类型phyB4，单株2、3、5、9、 10、12、13、16、28、35、37、45是亲本P2即06-247中的等位变异类型phyB3，其余单株 是杂合型。从扩增结果可以看出这对引物能够100%鉴定纯合phyB3、phyB4以及杂合型，完 全可以用于种质资源的筛选和育种辅助选择。