一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法

摘要

一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法。针对朱砂叶螨钠离子通道基因的kdr（knockdownresistance）突变进行PCR检测，通过引物设计、提取朱砂叶螨基因组DNA、PCR扩增等，可快速监测朱砂叶螨对拟除虫菊酯类杀虫、杀蟎剂的靶标抗性（kdr抗性）。本发明可节省大量生物试材、操作简单，结果快速、明确。可取代为掌握朱砂叶螨对拟除虫菊酯类杀虫、杀蟎剂抗药性发生、发展动态所采用的常规生物测定方法。

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，特别是涉及一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法。

背景技术

朱砂叶螨别名棉红蜘蛛、棉叶螨、红叶螨，在我国分布广泛，华北、华东、华中、华南、东北、云南、甘肃等地区均有发生。可为害的植物有43科146种，主要有豆类、茄子、高粱、辣椒、西瓜、草莓、玉米、葱、苋菜、桑树及杂草等。该螨具有极强的繁殖能力，在适宜的生长环境下产卵量多，世代周期短，短时间里就能迅速形成一定数量的种群，然后在植物叶背及叶脉两侧聚集，以口针刺吸植株汁液，并结成丝网，使受害叶片逐渐褪绿，形成无数白色斑点，对植物组织造成严重的伤害。在田间，朱砂叶螨危害严重时可导致植株叶片完全干枯脱落，甚至成片死亡，造成严重的经济损失。多年来对朱砂叶螨最有效的防治方法就是使用化学药剂。朱砂叶螨具有个体小、世代短、发育快等特点，使其极易产生抗药性，因而防治极为困难。至上世纪八十年代末，朱砂叶螨至少对25种杀虫杀螨剂产生了抗药性，导致许多杀虫杀螨剂的效果显著降低。研究表明，在我国，朱砂叶螨对有机氯、有机磷、有机氮类以及拟除虫菊酯类的多种农药已达到中抗至极高抗水平。

拟除虫菊酯类杀虫剂是一类根据具有杀虫活性的菊花提取物的天然除虫菊素化学结构而仿生出来的合成杀虫剂。由于其具有杀虫活性高、击倒作用强、对非靶标高等动物低毒及在环境中易降解等特点，因而从其被发现至今三十余年来，被广泛的用于农业、林业及卫生害虫防治。在2005年，该类杀虫剂的销售额依然占到世界杀虫剂销售总量的20%。

害虫对拟除虫菊酯杀虫剂(或DDT)产生抗性的主要原因是由于靶标位点(钠离子通道)的突变导致靶标与药剂的结合能力下降引起的，这种突变被命名为kdr突变，由此导致的抗性称为kdr抗性，而害虫kdr抗性一旦产生，将导致所有的拟除虫菊酯类药剂对该害虫防治失效。因此，害虫田间种群kdr抗性的早期预警对于延缓抗药性、延长药剂使用寿命、可持续治理害虫以及保护农产品质量安全意义重大，而发展快速、简便和灵敏的kdr抗性检测技术则可为害虫田间kdr抗性的早期预警提供有力的技术支撑。常规的朱砂叶螨kdr抗性检测的方法主要是通过增效剂结合生物测定的方法，了解害虫是否产生了kdr抗性，以及抗性程度有多高。常规检测方法存在一次所需生物试材多、操作复杂、对害虫田间kdr抗性的基因型组成无法准确探测等缺点，因此目前急需一种快速、简便、灵敏的方法检测田间kdr抗性。

发明内容

本发明的目的是提供一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法，用于朱砂叶螨田间kdr抗性的监测与预警。本发明申请人从甲氰菊酯抗性朱砂叶螨钠离子通道氨基酸序列鉴定出一个kdr突变F1538I（已公开报道）。本发明的技术路线是：明确朱砂叶螨钠离子通道氨基酸序列的F1538I突变与其对甲氰菊酯抗药性是否存在相关关系；如果F1538I突变与朱砂叶螨对甲氰菊酯抗药性存在相关关系，则基于该突变位点，研究并提出关于朱砂叶螨kdr抗性的简便、快速和灵敏的分子检测方法。

1、本发明申请人研究发现，朱砂叶螨钠离子通道基因F1538I突变频率与其对甲氰菊酯的抗性水平存在显著的正相关关系。

2010-2011年间，本发明申请人从南方地区田间采集获得7个朱砂叶螨野外种群，分别为：重庆市北碚区、重庆市璧山县、重庆市潼南县、重庆市武隆县、浙江省杭州市、湖北省荆州市、云南省个旧市。对各朱砂叶螨野外种群进行对甲氰菊酯抗性水平的生物测定及kdr突变频率测定。检测结果显示，七个野外品系的F1538I突变频率(13.6%到45%) 随着药膜法测定各种群对甲氰菊酯的LC₅₀的升高而上升，说明朱砂叶螨kdr突变F1538I与其对甲氰菊酯抗性相关。将朱砂叶螨地理种群的kdr突变频率与其对甲氰菊酯抗性水平进行线性回归分析，发现kdr突变频率大小与抗性水平高低呈显著正相关关系（R=0.81525）（图1）。该结果表明，kdr突变频率高低与其对甲氰菊酯抗性水平大小之间存在着正相关关系，揭示出kdr突变F1538I与甲氰菊酯抗性密切相关。

基于二者之间的相关关系，使用本发明提供的kdr突变检测方法，即可测出某一种群的kdr突变频率（随机选取30头以上），将突变频率X带入公式Y=23435X+345.16进行计算，可预测该种群的抗性水平Y值（LC₅₀值）。

2、基于F1538I突变，设计特异引物，提出朱砂叶螨kdr抗性PCR检测方法并验证其可靠性

设计原理与思路：

本发明利用等位基因PCR的方法设计引物进行PCR扩增，进而通过电泳检测其突变位点的基因型。PCR过程中引物延伸是3'端开始的，所以3'末端的碱基是否与模板配对对引物的延伸来说处于至关重要的位置。如果这个碱基与模板互补，则引物能不间断延伸，PCR可以正常进行，得到特定长度扩增带。因此只要将发生kdr突变的碱基安排在3'引物最末端，进行PCR时，如果得到特异扩增带，表明被检测基因含有该种突变。没有特异扩增带出现，则表示没有这种突变。

本发明所述的一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法，通过以下步骤实现：

（1）使用等位基因PCR的方法，根据朱砂叶螨钠离子通道cDNA序列设计用于kdr突变基因型检测的特异引物：Primer1和Primer2用于扩增150bp左右非突变片段， Primer3和Primer4用于扩增600bp左右突变片段；

Primer1（S-Forward）  5'- TTCAAGTGGCAACATTCAAAGG-3' 

Primer2（S-Reverse）  5'- AATAAACAGGTTAAGTGTGAA-3'

Primer3（R-Forward）  5'- TTCATCATTTTTGGCTCTTTTA-3'

Primer4（R- Reverse）  5'- TGGTCAAGGGACATCACA-3'

（2）单头提取朱砂叶螨基因组DNA，PCR扩增，PCR体系为：10×PCR Buffer Reaction Buffer2.5μL、MgCl₂2.5μL、dNTP mixture2.0μL、S-Forward0.5μL、S-Reverse0.5μL、R-Forward0.5μL、R- Reverse0.5μL、dd H₂O14.8μL、基因组DNA1.0μL、Taq DNA聚合酶0.2μL；PCR程序为：94℃预变性3min，94℃变性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存；

（3）PCR反应完成后，取10μL扩增产物进行1.0% 的琼脂糖凝胶电泳，经染色后，在凝胶成像系统上观察并拍照电泳结果；

（4）结果鉴定，样品出现单一150bp带，无600bp带，则基因型为SS（敏感纯合子）；样品出现150bp和600bp两条带，则基因型为RS（抗性杂合子）；样品出现单一600bp带，无150bp带，则基因型为RR（抗性纯合子）。

（5）根据朱砂叶螨基因型检测结果计算该种群的突变频率，将突变频率X带入公式Y=23435X+345.16进行计算，得到该种群的抗性水平Y值即LC₅₀值。

步骤（2）在退火温度高于50℃或模板DNA浓度较高的情况下，会出现750bp左右条带，为引物S-Forward和R- Reverse扩增出来的条带，对结果判定无影响。

附图说明

图1为突变频率与LC₅₀线性关系图

图2 为传统分子生物学方法与本发明方法检测结果比较

本发明的优点是：

1、节省大量生物试材

    昆虫或螨类对杀虫剂产生抗药性的机制主要分为代谢抗性和靶标抗性。朱砂叶螨对甲氰菊酯产生代谢抗性与多功能氧化酶(MFO)、谷胱甘肽转移酶(GSTs)和酯酶活性的升高有关。因而朱砂叶螨常规kdr抗性的检测方法需要抑制代谢酶的活性后，通过生物测定的方法检测其抗性水平。这种方法需要较多的螨源，一般一次生物测定需要活体螨约1000头以上，2-3次生物测定才能区分出kdr抗性及其程度；采用本发明的PCR检测方法可在单头水平上对kdr抗性进行检测，明确kdr突变频率、抗性基因显隐性程度以及预测抗性水平，一般需要100头左右的螨源，减少生物试材使用量20-30倍。

2、操作简单，结果快速

常规生物测定的方法检测kdr抗性需要制备药膜（叶碟、玻片）、配药、喷药（浸药）、挑螨等一系列步骤，抗性检测过程一般都需要2-3天，得出准确结果需要7-10天，比较费时、费力；而本发明采用分子生物学的PCR方法对朱砂叶螨kdr抗性的检测在三个小时之内即可完成，并且可通过电泳直观地看出每个样品的基因型，简单、经济，并且与常规分子生物学的测序检测方法相比，省去了kdr抗性中的克隆、纯化、序列测定、序列对比等步骤。相比常规生物测定方法及分子生物学测序检测kdr抗性，本发明操作简单，节省时间。

3、结果直接明确

   常规生物测定方法只能检测出朱砂叶螨种群对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平，而对种群单个个体的kdr抗性基因型及其群体构成无法判断。本发明方法可直接测定单头个体kdr突变的基因型，计算抗性等位基因在群体中的分布，结果直观、明确。

具体实施方式

实施例

使用等位基因PCR的方法，根据朱砂叶螨钠离子通道cDNA序列设计用于kdr突变基因型检测的特异引物：Primer1和Primer2用于扩增150bp左右非突变片段，Primer3和Primer4用于扩增600bp左右突变片段。单头提取朱砂叶螨基因组DNA，PCR后经电泳检测其kdr突变基因型。

PCR扩增使用引物

引物名称序列S-Forward5'- TTCAAGTGGCAACATTCAAAGG-3'S-Reverse5'- AATAAACAGGTTAAGTGTGAA-3'R-Forward5'- TTCATCATTTTTGGCTCTTTTA-3'R- Reverse5'- TGGTCAAGGGACATCACA-3'

所用仪器及试剂

仪器：精密微量移液器一套、PCR仪、电泳槽、微波炉、凝胶成像分析仪

耗材：PCR管、1.5mL离心管，移液器枪头

试剂：动物基因组DNA提取试剂盒、Taq酶、Mg²⁺、10×Buffer、琼脂糖、1×电泳液、dNTP、电泳上样液、1000bp DNA Marker

操作步骤

1、朱砂叶螨基因组DNA提取

参照购买试剂盒说明书。

2、PCR

    PCR体系如下：

试剂体积(μL)10×PCR Buffer Reaction Buffer2.5MgCl₂2.5dNTP mixture2.0S-Forward0.5S-Reverse0.5R-Forward0.5R- Reverse0.5dd H₂O14.8基因组DNA1.0Taq DNA聚合酶0.2

PCR程序如下：

94℃预变性3min，94℃变性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存

3、产物检测

PCR反应完成后，取10μL扩增产物进行1.0% 的琼脂糖凝胶电泳，经染色后，在凝胶成像系统上观察并拍照电泳结果。

4、结果鉴定

   样品出现单一150bp带，无600bp带，则基因型为SS（敏感纯合子）；样品出现150bp和600bp两条带，则基因型为RS（抗性杂合子）；样品出现单一600bp带，无150bp带，则基因型为RR（抗性纯合子）；

选取室内朱砂叶螨敏感品系及甲氰菊酯抗性品系，单头朱砂叶螨使用前述发明方法对其基因型进行鉴定。样品检测结果与测序结果相吻合（图2）： 

样本A：左侧为测序结果，右侧为电泳结果。测序结果为单峰T，电泳结果对应约150bp条带，根据之前预测为Primer1和Primer2扩增出来的无突变片段，而检测结果没有出现Primer3和Primer4扩增出来的含有突变片段，因此其基因型为SS（敏感纯合子），与测序结果吻合。

样本B：左侧为测序结果，右侧为电泳结果。测序结果为套峰T/A，电泳结果对应无突变150bp片段和含突变的600bp片段两条带，因而确定其基因型为RS（抗性杂合子），电泳结果与测序结果吻合。

样本C：左侧为测序结果，右侧为电泳结果。测序结果为单峰A，电泳结果显示没有出现150bp的无突变片段，而只存在约600bp的含突变片段条带，根据电泳结果预测其基因型为RR，测序结果显示基因型为RR（抗性纯合子），与电泳结果吻合。