朱砂叶螨甲氰菊酯kdr抗性分子标记建立

摘要

朱砂叶螨是一种世界性的农业害螨。拟除虫菊酯类杀虫剂被广泛运用于害虫防治。害虫钠离子通道的突变导致对拟除虫菊酯类杀虫剂的不敏感，进而对其产生的抗药性已成为目前该类药剂继续用于害虫防治最主要的障碍。因而抗药性监测对于杀虫剂的科学使用及害虫抗药性治理意义重大。
　　 本文以朱砂叶螨敏感(SS)、甲氰菊酯抗性品系(FeR)及野外采集的朱砂叶螨七个地理种群为研究对象，克隆并比对朱砂叶螨敏感及甲氰菊酯抗性品系钠离子通道基因cDNA全长序列，建立朱砂叶螨甲氰菊酯kdr抗性分子标记，并对野外种群kdr突变频率进行检测。获得以下主要结果:
　　 1、在朱砂叶螨钠离子通道片段(GU19630)基础上，通过RACE技术克隆了该基因cDNA全长（GenBank登录号:JQ290514）:开放阅读框含有6579个核苷酸，编码2193个氨基酸，涵盖钠离子通道基因的C-端、N-端及结构域ⅠS1-ⅣS6;比对朱砂叶螨SS和FeR品系的钠离子通道cDNA序列，发现在FeR品系有且只有一个突变位点，即F1538I突变。
　　 2、设计特异引物分别扩增朱砂叶螨SS及FeR品系钠离子通道基因组DNA片段，从DNA分子中也鉴定出F1538I突变，表明朱砂叶螨FeR品系钠离子通道基因存在的苯丙氨酸F-异亮氨酸Ⅰ的突变是由于DNA突变转录导致，而不是由RNA编辑引起。
　　 3、使用高浓度甲氰菊酯(LC90，约10000mg/L)处理朱砂叶螨SS品系，在死亡个体、存活个体及FeR品系中检测F1538I突变频率，结果为:在死亡个体、存活个体和FeR个体中，突变频率分别为0％、6.7％和100％。突变检测的实验结果表明，kdr突变F1538I在朱砂叶螨敏感种群中以较低频率存在(6.7％×10％=0.67％)，经甲氰菊酯筛选后以极高频率出现在甲氰菊酯抗性品系中，因此，F1538I突变与甲氰菊酯抗性密切相关，该突变可以作为朱砂叶螨对甲氰菊酯产生抗药性的一个分子标记位点。
　　 4、采用建立的分子检测方法对朱砂叶螨7个野外地理种群的kdr突变频率及其对甲氰菊酯的抗性水平进行监测，结果表明野外地理种群的F1538I突变频率与其对甲氰菊酯抗性水平存在正相关关系(R2=0.665):地理种群的抗性倍数从3.8增加到16.2，相应的突变频率从13.6％增加至45％，实际验证了F1538I突变可以作为朱砂叶螨甲氰菊酯抗性的分子标记。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 朱砂叶螨

2 蜱螨抗药性研究现状

2．1 朱砂叶螨抗药性

2．2 其他蜱螨抗药性

3 拟除虫菊酯类杀虫(螨)剂

2．1 杀虫(螨)剂

2．2 作用靶标

3．3 kdr突变

引言

第二章 朱砂叶螨钠离子通道基因末端扩增

1 材料与方法

1．1 朱砂叶螨

1．2 主要药剂与仪器

2 朱砂叶螨钠离子通道基因末端扩增

2．1 朱砂叶螨总RNA的提取

2．2 引物设计

2．3 朱砂叶螨cDNA第一链合成

2．3 PCR扩增

2．4 目的片段的克隆与测序

3 结果与分析

3．1 朱砂叶螨总RNA提取

3．2 朱砂叶螨钠离子通道末端扩增

3．3 朱砂叶螨钠离子通道基因序列分析

4 讨论

第三章 朱砂叶螨钠离子通道基因DNA突变鉴定

1 材料与方法

1．1 朱砂叶螨

1．2 主要药剂与仪器

2 朱砂叶螨钠离子通道DNA基因片段扩增

2．1 朱砂叶螨基因组DNA提取

2．2 引物设计

2．3 PCR扩增

2．4 目的片段的克隆与测序

3 结果与分析

3．1 电泳结果分析

3．2 测序结果分析

3．3 DNA突变鉴定

4 讨论

第四章 朱砂叶螨kdr抗性分子标记建立及野外种群抗性监测

1 材料与方法

1．1 朱砂叶螨

1．2 主要药剂与仪器

2 朱砂叶螨kdr抗性分子标记建立

2．1 分子标记方法

2．2 引物设计

2．3 单头朱砂叶螨总RNA提取

2．4 cDNA第一链合成

2．5 PCR扩增

2．6 琼脂糖凝胶电泳检测

2．7 测序

3 结果与分析

3．1 电泳结果分析及突变个体鉴定

3．2 分子标记建立

3．3 野外种群抗性及kdr突变频率监测

4 讨论

参考文献

在读期间发表的文章

致谢