一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法及其用途

摘要

本发明涉及一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法及其用途，包括以下步骤：A：甲醇提取；B：石油醚萃取；C：正丁醇萃取；D：硅胶柱分离：将第三步得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，洗脱速度2～8mL/min；得棕黑色浸膏；E：Sephadex LH-20柱色谱纯化：棕黑色浸膏用甲醇溶解，Sephadex LH-20柱色谱纯化，CH

说明书

技术领域

本发明涉及一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法及其用途，属于天然药物 领域。

背景技术

随着人口老龄化时代的来临，衰老和老年性疾病已成为威胁人类健康的突 出问题，人们对防治衰老、延年益寿有着迫切的要求，抗衰老药物的开发和应 用是解决这一问题的重要途径。许多天然活性分子具有抗衰延寿作用，如番茄 红素、白藜芦醇及茶多酚，已在医药、化妆品及食品等行业得到广泛应用。天 然抗衰老活性物质向人们展示了广阔的应用前景。

猴腿蹄盖蕨(Athyrium multidentatum(Doll.)Ching)系蹄盖藏科(Athyriaceae) 植物，又名多齿蹄盖藏、猴腿菜、猴腿儿，是一种多年生蕨类植物，其拳状嫩 叶和根状茎可食用，味道鲜美，风味独特，是长白山地区一种重要的山野菜。 猴腿蹄盖蕨不仅可以食用，也可药用，是一类重要的“药、食两用”蕨类植物。 《中华本草》记载猴腿蹄盖蕨味微苦、性凉，去须根茎入药，煎服，具有清热 解毒、杀虫之功效，主治虫积腹痛，同时可预防流感、麻疹。其营养成分和药 用功效与蕨菜相当。经常食用可治疗高血压、头晕、子宫出血、关节炎等症。 此外，猴腿蹄盖蕨中含有丰富的赖氨酸，能促进骨骼发育和牙齿的形成，抑制 病毒性感染等，对婴幼儿、孕妇营养的补充有很大意义。

植物多酚是一类广泛存在于植物体内的多元酚类化合物，具有抗衰老、抗 氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种功效，被人们誉为人类健康的“第7营养素”。 文献检索尚未发现猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法及应用的论文及专利报道。 王晓林，钟方丽，薛健飞探索了猴腿蹄盖蕨总多酚的超声提取工艺条件（猴腿 蹄盖蕨总多酚的超声提取工艺研究[J].广东农业科学2013,13：98-100,119）， 文献中总多酚的提取采用65%乙醇在微沸状态下超声提取，多酚提取率为169.27 mg/g，该方法提取的总多酚中含有大量杂质，多酚纯度不高，同时加热提取可 能破坏活性多酚的结构。该文献并未提到猴腿蹄盖蕨活性多酚的化学组成和生 物活性。

发明内容

本发明提供了一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的制备方法。发明人采用溶剂冷浸， 硅胶及Sephadex LH-20柱色谱纯化的方法制备猴腿蹄盖蕨水溶性多酚。利用该方 法制备的猴腿蹄盖蕨活性多酚纯度可达90%以上，质量稳定可控。药理学实验表 明本发明中制备的猴腿蹄盖蕨活性多酚具有抗D-半乳糖致小鼠衰老作用。解决 了现有猴腿蹄盖蕨活性多酚提取过程中纯度低、质量不可控、生物活性不明确 等问题，填补了猴腿蹄盖蕨活性多酚研究的空白。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

文献调查显示，猴腿蹄盖蕨根茎为主要用药部位。预实验结果显示，猴腿 蹄盖蕨根茎多酚含量较高，本发明以猴腿蹄盖蕨根茎为材料提取多酚。

一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法，包括以下步骤：

（1）猴腿蹄盖蕨粗提物的制备：

A：甲醇提取：将猴腿蹄盖蕨根茎粉碎，用甲醇室温浸泡，过滤，合并滤液， 浓缩，得甲醇提取物浸膏；

B：石油醚萃取：将得到的甲醇提取物浸膏用蒸馏水溶解，得到甲醇提取物 浸膏溶液，然后用石油醚萃取，除去脂溶性成分，得到水溶液；

C：正丁醇萃取：将得到的水溶液用水饱和的正丁醇萃取，浓缩，得正丁醇 萃取物浸膏；

（2）猴腿蹄盖蕨活性多酚的纯化：

D：硅胶柱分离：将得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅胶柱， 用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，洗脱速度2～8mL/min；洗脱液依次为：石油 醚/乙酸乙酯体积比为15～1:1的洗脱液20-30L、乙酸乙酯洗脱液10-15L、乙酸乙 酯/甲醇体积比为15～6:1的洗脱液6-8L和乙酸乙酯/甲醇体积比为5:1的洗脱液 6-8L，乙酸乙酯/甲醇体积比为1:1的洗脱液8-10L；收集乙酸乙酯洗脱液和乙酸 乙酯/甲醇体积比为5:1的洗脱液，合并，减压浓缩，得棕黑色浸膏；

E：Sephadex LH-20柱色谱纯化：棕黑色浸膏用甲醇溶解，Sephadex LH-20 柱色谱纯化，CH₂Cl₂-甲醇梯度洗脱，洗脱速度2～8mL/min，洗脱液依次为：CH₂Cl₂洗脱液3-5L、CH₂Cl₂/甲醇体积比为15～1:1的洗脱液15-20L和甲醇洗脱液7-10L， 收集甲醇洗脱液，浓缩，得猴腿蹄盖蕨活性多酚。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的甲醇提取具体为：称取猴腿蹄盖 蕨粉碎根茎，按1:5～1:8料液比加入甲醇，室温浸泡2～3次，1～3个月/次，期间 时常搅动，过滤，合并滤液，浓缩，得到甲醇提取物浸膏。采用1:5～1:8料液比 加入甲醇，室温浸泡2～3次，1～3个月/次，采取这样的提取方法一方面可以提高 产率，另一方面可以降低提取成本。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的甲醇提取物浸膏溶液的浓度为 70-90mg/mL。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的石油醚萃取采用三次萃取，具体 为第一次用甲醇提取物浸膏溶液体积1/3的石油醚，第二次用甲醇提取物浸膏溶 液体积1/4的石油醚，第三次用甲醇提取物浸膏溶液体积1/6的石油醚。采用三次 萃取，可以有效的提高产品纯度，降低生产成本。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的正丁醇萃取采用三次萃取，具体 为第一次用甲醇提取物浸膏溶液体积1/3的正丁醇萃取，第二次用甲醇提取物浸 膏溶液体积1/4的正丁醇萃取，第三次用甲醇提取物浸膏溶液体积1/6的正丁醇萃 取。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的浓缩采用真空浓缩，真空度 0.1～0.08MPa，温度为40～75℃。采用真空浓缩可以提高产品活性，提高产品收 率。

另外本发明提供了一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的用途：猴腿蹄盖蕨活性多酚 在抗衰老药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明的猴腿蹄盖蕨活性多酚提取方法提取率为12.29%，纯度达到 95%～99.9%，所得猴腿蹄盖蕨活性多酚为棕黑色固体，可在避光条件下室温保 存，其保存期不少于24个月。猴腿蹄盖蕨活性多酚能溶于纯水、正丁醇和甲醇， 不溶于石油醚或乙醚，猴腿蹄盖蕨活性多酚属于无毒物。

本发明制备的猴腿蹄盖蕨活性多酚在抗衰老有用途上的效剂量范围为 10～70mg/kg/d（D-半乳糖致衰老小鼠）。本文所用的术语“有效量”指治疗剂 治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果 的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型、健康状况、病症的性 质和程度。因此，预先指定准确的有效量是没用的。

为了本发明的目的，有效剂量为给予个体10～70mg/kg/d（D-半乳糖致衰老 小鼠）的本发明猴腿蹄盖蕨活性多酚。

本发明的猴腿蹄盖蕨活性多酚，可将其直接给予对象。

药理学实验证明本发明的猴腿蹄盖蕨活性多酚可以显著抑制小鼠脑组织海 马区细胞凋亡，提高小鼠脏器指数，提高小鼠血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）、 肝脏组织过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，降低肝 脏脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量。本发明的猴腿蹄盖蕨活性多酚具有抗 D-半乳糖致小鼠衰老作用。

附图说明

图1为本发明所制备的猴腿蹄盖蕨活性多酚的红外（IR）谱图；

图2为没食子酸酸标准曲线；

图3为脑组织切片HE染色图。

具体实施方式

下面将结合本附图和实施例，对本发的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法，包括以下步骤：

（1）猴腿蹄盖蕨粗提物的制备：

A：甲醇提取：将5kg猴腿蹄盖蕨根茎粉碎，按照1:6的料液比加入30kg甲醇， 室温浸泡2次，2个月/次，期间时常搅动，过滤，合并滤液，浓缩，所述的浓缩 采用真空浓缩，真空度0.1MPa，温度40℃，得190g甲醇提取物浸膏，产率3.8%；

B：石油醚萃取：将得到的甲醇提取物浸膏用2.4L蒸馏水溶解，得到79mg/mL 的甲醇提取物浸膏溶液，然后用1.8L石油醚萃取，石油醚萃取采用三次萃取，具 体为800mL/第一次，600mL/第二次，400mL/第三次，除去脂溶性成分，得到水 溶液；

C：正丁醇萃取：将得到的水溶液用1.8L水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃取 采用三次萃取，具体为800mL/第一次，600mL/第二次，400mL/第三次，采用真 空浓缩，真空度0.1MPa，温度为60℃，得94g正丁醇萃取物浸膏，产率49.47%。

（2）猴腿蹄盖蕨活性多酚的纯化：

D：硅胶柱分离：将得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅胶柱， 用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，洗脱速度6mL/min；洗脱液依次石油醚/乙酸 乙酯体积比为5:1的洗脱液13L，石油醚/乙酸乙酯体积比为1:1的洗脱液12L，乙 酸乙酯洗脱液10.65L，乙酸乙酯/甲醇体积比为10:1的洗脱液6.075L；乙酸乙酯/ 甲醇体积比为5:1的洗脱液7.5L，乙酸乙酯/甲醇体积比为1:1的洗脱液8L，收集乙 酸乙酯洗和乙酸乙酯/甲醇体积比为5:1的洗脱组分，合并，浓缩，所述的浓缩采 用真空浓缩，真空度0.1MPa，温度为45℃，得到20.75g棕黑色浸膏，产率为 27.67%；

E：Sephadex LH-20柱色谱纯化：将棕黑色浸膏20.75g用7mL甲醇溶解， Sephadex LH-20柱色谱纯化，洗脱流速3mL/min，CH₂Cl₂和甲醇梯度洗脱，具体 为：CH₂Cl₂洗脱液3.25L；CH₂Cl₂/甲醇体积比为15:1的洗脱液7.85L；CH₂Cl₂/甲 醇体积比为4:1的洗脱液7.05L，甲醇洗脱液7.6L；收集甲醇洗脱组分，浓缩。所 述的浓缩采用真空浓缩，真空度0.09MPa，温度45℃，得2.55g棕黑色固体，产率 12.29%。

实施例2

一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法，包括以下步骤：

（1）猴腿蹄盖蕨粗提物的制备：

A：甲醇提取：将5kg猴腿蹄盖蕨根茎粉碎，按照1:5的料液比加入25kg甲醇， 室温浸泡3次，1个月/次，期间时常搅动，过滤，合并滤液，浓缩，所述的浓缩 采用真空浓缩，真空度0.08MPa，温度45℃，得187g甲醇提取物浸膏，产率3.74%；

B：石油醚萃取：将得到的甲醇提取物浸膏用2.64L蒸馏水溶解，得到 71mg/mL的甲醇提取物浸膏溶液，然后用1.98L石油醚萃取，石油醚萃取采用三 次萃取，具体为880mL/第一次，660mL/第二次，440mL/第三次，除去脂溶性成 分，得到水溶液；

C：正丁醇萃取：将得到的水溶液用1.98L水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃 取采用三次萃取，具体为880mL/第一次，660mL/第二次，440mL/第三次，采用 真空浓缩，真空度0.09MPa，温度为60℃，得93g正丁醇萃取物浸膏，产率49.43%。 猴腿蹄盖蕨活性多酚的纯化的步骤与实施例1相同，得到20.6g棕黑色浸膏，产率 为27.46%，2.51g棕黑色固体，产率12.18%。

实施例3

一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法，包括以下步骤：

（1）猴腿蹄盖蕨粗提物的制备：

A：甲醇提取：将5kg猴腿蹄盖蕨根茎粉碎，按照1:8的料液比加入40kg甲醇， 室温浸泡2次，2个月/次，期间时常搅动，过滤，合并滤液，浓缩，所述的浓缩 采用真空浓缩，真空度0.09MPa，温度50℃，得191g甲醇提取物浸膏，产率3.82%；

B：石油醚萃取：将得到的甲醇提取物浸膏用2.1L蒸馏水溶解，得到91mg/mL 的甲醇提取物浸膏溶液，然后用1.575L石油醚萃取，石油醚萃取采用三次萃取， 具体为700mL/第一次，525mL/第二次，350mL/第三次，除去脂溶性成分，得到 水溶液；

C：正丁醇萃取：将得到的水溶液用1.575L水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃 取采用三次萃取，具体为700mL/第一次，525mL/第二次，350mL/第三次，采用 真空浓缩，真空度0.1MPa，温度为65℃，得95.5g正丁醇萃取物浸膏，产率50%。 猴腿蹄盖蕨活性多酚的纯化步骤与实施例1相同，得到20.4g棕黑色浸膏，产率为 27.2%，2.52g棕黑色固体，产率12.35%。

实施例4

一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法，包括以下步骤：

（1）猴腿蹄盖蕨粗提物的制备与实施例2相同，

（2）猴腿蹄盖蕨活性多酚的纯化：

D：硅胶柱分离：将得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅胶柱， 用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，洗脱速度2mL/min；洗脱液依次石油醚/乙酸 乙酯体积比为5:1的洗脱液10L，石油醚/乙酸乙酯体积比为1:1的洗脱液10L，乙 酸乙酯洗脱液10L，乙酸乙酯/甲醇体积比为10:1的洗脱液6L；乙酸乙酯/甲醇体 积比为5:1的洗脱液8L，乙酸乙酯/甲醇体积比为1:1的洗脱液9L，收集乙酸乙酯 洗和乙酸乙酯/甲醇体积比为5:1的洗脱组分，合并，浓缩，所述的浓缩采用真空 浓缩，真空度0.08MPa，温度为50℃，得到20g棕黑色浸膏，产率为26.67%；

E：Sephadex LH-20柱色谱纯化：将棕黑色浸膏20g用7mL甲醇溶解，Sephadex LH-20柱色谱纯化，洗脱流速2mL/min，CH₂Cl₂和甲醇梯度洗脱，具体为：CH₂Cl₂洗脱液3L；CH₂Cl₂/甲醇体积比为15:1的洗脱液7.85L；CH₂Cl₂/甲醇体积比为4:1 的洗脱液7.05L，甲醇洗脱液7.6L；收集甲醇洗脱组分，浓缩。所述的浓缩采用 真空浓缩，真空度0.09MPa，温度50℃，得2.5g棕黑色固体，产率12.5%。

实施例5

一种猴腿蹄盖蕨活性多酚的提取方法，包括以下步骤：

（1）猴腿蹄盖蕨粗提物的制备与实施例3相同，

（2）猴腿蹄盖蕨活性多酚的纯化：

D：硅胶柱分离：将得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅胶柱， 用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，洗脱速度4mL/min；洗脱液依次石油醚/乙酸 乙酯体积比为5:1的洗脱液16L，石油醚/乙酸乙酯体积比为1:1的洗脱液14L，乙 酸乙酯洗脱液12L，乙酸乙酯/甲醇体积比为10:1的洗脱液8L；乙酸乙酯/甲醇体 积比为5:1的洗脱液6L，乙酸乙酯/甲醇体积比为1:1的洗脱液10L，收集乙酸乙酯 洗和乙酸乙酯/甲醇体积比为5:1的洗脱组分，合并，浓缩，所述的浓缩采用真空 浓缩，真空度0.09MPa，温度为60℃，得到20.3g棕黑色浸膏，产率为26.67%；

E：Sephadex LH-20柱色谱纯化：将棕黑色浸膏20.3g用7mL甲醇溶解， Sephadex LH-20柱色谱纯化，洗脱流速6mL/min，CH₂Cl₂和甲醇梯度洗脱，具体 为：CH₂Cl₂洗脱液5L；CH₂Cl₂/甲醇体积比为15:1的洗脱液7L；CH₂Cl₂/甲醇体积 比为4:1的洗脱液7L，甲醇洗脱液10L；收集甲醇洗脱组分，真空浓缩，真空度 0.08MPa，温度50℃，得2.49g棕黑色固体，产率12.26%。

猴腿蹄盖蕨活性多酚质量控制

本发明中的猴腿蹄盖蕨活性多酚主要通过显色反应和IR谱图及含量测定进 行质量控制，测定方法描述如下。

1、猴腿蹄盖蕨活性多酚显色反应

分别取本发明实施例1-5制备的棕黑色固体10mg，用25mL蒸馏水溶解， 取1mL该溶液分别进行多酚类物质显色反应：实施例1-5所制备的棕黑色固体 均与明胶-NaCl溶液反应产生白色沉淀，与1%三氯化铁反应呈蓝黑色。棕黑色 固体多酚类物质显色反应呈阳性，说明棕黑色固体是猴腿蹄盖蕨活性多酚。

2、猴腿蹄盖蕨活性多酚IR谱图测定

本发明实施例1制备的猴腿蹄盖蕨活性多酚红外谱图测定采用KBr压片法。 IR谱图见图1。IR谱图中1610.56、1521.48、1448.54、1111.00和767.67cm^-1处有5个明显的多酚类成分特征峰。IR谱图进一步明确本发明实施例1中制备 的棕黑色固体为猴腿蹄盖蕨活性多酚。其它实施例的IR谱图与实施例1的相同， 不再提供。

3、猴腿蹄盖蕨活性多酚含量测定

猴腿蹄盖蕨活性多酚含量采用福林酚试剂比色法测定，具体方法描述如下。

（1）对照品溶液的配制及标准曲线绘制

精密称取没食子酸（上海融禾医药科技有限公司）10mg，置于25mL容量瓶 中，蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀。精密移取没食子酸对照品溶液0、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL，分别置于10mL具塞刻度试管中，依次加入0.2mL 福林酚试剂，混匀，振荡1min，0.2mL新鲜配制的10%Na₂CO₃，振荡30s，最后 蒸馏水定容至5mL，摇匀，放置20min。以0mL管为参比，760nm波长处比色， 测定系列没食子酸对照品溶液吸光度值。测定标准曲线见图2。以吸光度对没食 子酸浓度（μg/mL）进行线性回归，得回归方程Y=0.065X-0.0084，r=0.9945。 线性范围4～28μg/mL。

（2）样品多酚含量测定

精密称取本发明实施例中制备的棕黑色固体10mg，用蒸馏水溶解并定容至 10mL，得浓度为10mg/mL的样品溶液。精密移取样品溶液0.05mL，按标准曲 线绘制项下方法，自置于10mL具塞刻度试管中起，至用蒸馏水定容至5mL， 760nm波长处比色，依法测定吸光度值，根据回归方程计算本发明的猴腿蹄盖蕨 活性多酚含量，实施例1-5的猴腿蹄盖蕨活性多酚含量依次为99.5%、99.6%、 99.8%、99.9%和99.8%。

猴腿蹄盖蕨活性多酚抗D-半乳糖致小鼠衰老作用

1、实验材料

（1）实验药品

D-半乳糖：取0.4g D-半乳糖用0.9%生理盐水溶解并定容至20mL，浓度为 20mg/mL。

维生素E：取维生素E丸（3.8mg维生素E/丸）刺破胶囊后，挤出内容物，加 入蒸馏水，配成5mg/mL的溶液，用时摇匀。

多酚：本实验使用的猴腿蹄盖蕨活性多酚是按实施例1所示方法制备的，多 酚含量为99.5%，该多酚用蒸馏水溶解，配成5mg/mL的溶液，现用现配。

（2）实验动物

昆明种小鼠（30周龄），清洁级，体重50±2g，25℃恒温恒湿条件下饲养， 明暗周期12h，自由饮水给食。

2、小鼠衰老模型的建立

（1）动物模型建立

小鼠适应性饲养3天，除空白组外，其余均按100mg/kg/d剂量腹腔注射D-半 乳糖50天，脑组织切片HE染色观察，与空白组相比较，小鼠脑组织海马区结构 异常，细胞显著变性坏死视为造模成功。

（2）动物分组及给药

小鼠随机分为6组：空白对照组、D-半乳糖组、维生素E组、多酚低剂量组、 多酚高剂量组，各组雌雄各半，分笼饲养。

维生素E组及多酚组腹腔注射D-半乳糖16天后，在腹腔注射D-半乳糖的同 时，每日1次灌胃给药，分别为维生素E组25mg/kg，多酚低剂量组30mg/kg，多 酚高剂量组60mg/kg，连续灌胃给药34天。D-半乳糖组腹腔注射D-半乳糖 100mg/kg，空白对照组腹腔注射等体积生理盐水，16天后D-半乳糖组及空白对 照组分别灌胃等体积蒸馏水。

各组动物均根据当日体重给药。

（3）动物标本采集

小鼠于末次给药12h后，摘眼球取血，低温离心（3000r/min，4℃，10min）， 分离血清，放入1.5mL EP管中，-20℃冰箱保存，以待相关生化指标测定。小鼠 取完血后，立即脱臼处死，快速摘取心脏、肝脏和脑组织，分别用生理盐水冲 净血液，吸干水分，称重，按公式计算脏器指数。

脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/个体质量(g)

分别取空白对照组、D-半乳糖组、多酚低剂量组、多酚高剂量组小鼠的脑 组织，放入10%甲醛溶液中，脑组织切片HE染色观察海马区细胞形态学变化。 小鼠肝脏精密称重并尽快剪碎，与冷生理盐水按1:9体积比混合，冰浴条件下机 械匀浆5～6min，3000r/min低温离心10min，分离上清液，制备10%的肝组织匀 浆。

采用紫外可见分光光度计按照各试剂盒说明书测定肝组织谷胱甘肽过氧化 物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）含量。肝组织蛋 白含量采用蛋白定量测试盒测定。血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力采用 黄嘌呤氧化酶法测定。

（4）实验结果采用SPSS11.0统计分析软件进行统计分析，实验数据均以表示，组间比较用t检验法。

3、实验结果

（1）脑组织切片HE染色观察

小鼠脑组织切片HE染色结果如图3所示。脑组织切片HE染色结果显示正常组 小鼠脑组织切片海马区细胞数目正常，形态结构完整清晰，细胞排列整齐，层 次清楚。模型组切片海马区结构模糊，细胞数目减少，细胞体积减小而且表面 扭曲不平，细胞核呈固缩状，染色后呈棕褐色，说明有部分细胞变性坏死。HE 染色结果显示D-半乳糖致小鼠衰老模型成功建立。多酚低剂量组和高剂量组海 马区细胞变性坏死均减轻，细胞形态正常，结构清晰。猴腿蹄盖蕨活性多酚可 以显著减少D-半乳糖致小鼠脑组织海马区细胞凋亡，具有抗衰老作用。

（2）脏器指数

小鼠给药前后脏器指数实验结果列于表1中。

表1小鼠脏器指数

注：与空白对照组比，^#P<0.05，与D-半乳糖组相比，^*P<0.05，^**P<0.01

结果显示D-半乳糖组与空白对照组比较，小鼠肝脏指数降低（P<0.05）。 与D-半乳糖组比较，维生素E组心脏指数显著提高（P<0.01）；多酚低剂量组 心脏指数及肝脏指数提高（P<0.05）；多酚高剂量组心脏指数及脑指数提高（P <0.05），肝脏指数显著提高（P<0.01）。结果说明本发明的猴腿蹄盖蕨活性多 酚能提高小鼠脏器指数。

（3）小鼠血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力

小鼠给药前后血清T-SOD活力实验结果列于表2中。

表2小鼠血清T-SOD活力测定结果

注：与空白对照组比，^#P<0.05，与D-半乳糖组相比，^*P<0.05

结果显示，D-半乳糖组与空白对照组相比小鼠血清T-SOD活力降低（P< 0.05）。多酚低剂量及高剂量组与D-半乳糖组比较小鼠血清T-SOD活力提高（P <0.05）。结果说明本发明的猴腿蹄盖蕨活性多酚能提高小鼠血清总超氧化物歧 化酶活力。

（4）小鼠肝脏过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力及 丙二醛（MDA）含量

小鼠给药前后肝脏组织CAT、GSH-Px活力及MDA含量实验结果列于表3 中。

表3小鼠肝脏CAT、GSH-Px活力及MDA含量测定结果

注：与空白对照组比，^#P<0.05，^##P<0.01，与D-半乳糖组相比，^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果显示，D-半乳糖组与空白对照组比较GSH-Px活力显著降低（P< 0.01），MDA含量升高（P<0.05）。维生素E组与空白对照组比较GSH-Px活力 提高（P<0.05）。多酚组与D-半乳糖组比较，多酚低剂量组GSH-Px活力显著 提高（P<0.01），多酚高剂量组肝脏组织CAT活力提高（P<0.05），GSH-Px 活力显著提高（P<0.01），MDA含量降低。结果说明本发明的猴腿蹄盖蕨活性 多酚能提高小鼠肝脏组织过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活力，降低丙二醛 含量。

实施例2-5所制备的猴腿蹄盖蕨活性多酚抗D-半乳糖致小鼠衰老作用相差 不大，不再提供其实验结果。

综上所述，本发明的猴腿蹄盖蕨活性多酚可以提高小鼠体内抗氧化酶 （SOD、CAT、GSH-Px）活力，降低脂质过氧化产物（MDA）含量，提高小鼠 脏器指数，各组生化指标与多酚使用剂量呈明显的量效关系。因此，本发明的 猴腿蹄盖蕨活性多酚具有抗D-半乳糖致小鼠衰老作用，可以用于预防或延缓衰 老。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。