多巴反应性肌张力障碍相关基因突变、其检测方法及其用途

摘要

本发明属于分子病理学领域，特别涉及多巴反应性肌张力障碍相关基因突变，具体是多巴反应性肌张力障碍相关TH基因的2个突变型。

说明书

技术领域

本发明属于分子病理学领域，特别涉及多巴反应性肌张力障碍相关 基因突变。

背景技术

在1976年，多巴反应性肌张力障碍（dopa responsive dystonia， DRD）首次被Segawa等报道，被称为伴有明显昼间波动的遗传性进行 性肌张力障碍（hereditary progressive dystonia with marked diurnal fluctuation，HPD）或Segawa病（Segawa M，Hosaka A，Miyagawa F， et al.Hereditary progressive dystonia with marked diumal fluctuation．Adv Neuro，1976，14：215-233.）。DRD是一种少见的 遗传性运动障碍疾病，常发于儿童或青少年，以肌张力障碍或步态异 常为首发症状，发病率约为每百万人0.5－1例（Segawa M,Nomura Y, Nishiyama N.Autosomal dominant guanosine triphosphate cyclohydrolase I deficiency(Segawa disease).Ann Neurol 2003:54 (Suppl6):S32–45.）。

大多数DRD呈常染色体显性遗传（autosomal dominan，AD）， 致病基因为三磷酸鸟苷环化水解酶I基因（guanosine triphosphate cyclohydrolase I，GCH1）；少数呈常染色体隐性遗传（autosomal recessive，AR），致病基因为酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylabe， TH）基因；个别可呈散发性。

随着分子遗传学研究的发展，已发现70多种位于GCH1基因编码区 或内含子外显子结合区的不同突变；其中约52%为错义突变,17%为无 义突变，11%为剪切点突变，20%为缺失或插入突变。目前，在AR-DRD 家系中已报道的8种TH基因突变（3种纯合子突变，5种复合杂合子突 变），主要位于外显子内，仅有1种突变位于内含子内。外显子内的突 变中，除第14外显子的1493A→G突变导致TH四聚体区的氨基酸改变 外，其余突变均导致TH催化区内不同位点的氨基酸改变,对TH的结构 与功能产生不同程度的影响，第11内含子的分支点序列内24T→A突变 可引起其他分支点序列的启动，导致TH的Pre-mRNA剪接错误，产生 错误的mRNA，从而导致了整个遗传信息的改变。

多巴反应性肌张力障碍（DRD）常染色体隐性遗传家系TH基因的 新突变发现，有利于完善DRD患者的分子诊断，也可为研究DRD的 发病机理提供重要线索。

因此，本领域仍然需要发现DRD相关的TH基因突变，以及检测 DRD相关疾病的方法。

发明内容

本发明人经过不懈的努力，发现了多巴反应性肌张力障碍（DRD） 常染色体隐性遗传家系TH基因的新突变，并由此提供了下述发明：

本发明涉及多巴反应性肌张力障碍（DRD）常染色体隐性遗传家 系TH基因新的复合杂合错义突变，具体为：c.1004C>T（p.A335V） 和c.1451G>A（p.R484H）。

在第一方面，本发明涉及DRD的生物标记物，即突变的TH基因 或TH蛋白，所述生物标记物是具有选自如下的突变的TH基因或TH 蛋白：

错义突变（c.1004C>T,p.A335V）；

错义突变（c.1451G>A,p.R484H）。

在一个实施方案中，本发明的突变TH基因为具有以下突变的SEQ ID NO:1：

错义突变c.1004C>T；和/或

错义突变c.1451G>A。

在一个实施方案中，本发明的突变的TH蛋白为具有以下突变的SEQ ID NO:2：

错义突变p.A335V；和/或

错义突变p.R484H。

在第二方面，本发明涉及一种检测DRD的方法，所述方法包括检测 受试者的TH基因或TH蛋白中是否存在突变位点，如果有突变位点，则 所述受试者被鉴定为患有DRD或易患DRD，或者其后代会患有DRD或 易患DRD，所述突变位点选自如下任一种或其组合：

错义突变（c.1004C>T，p.A335V）；和

错义突变（c.1451G>A,p.R484H）。

在一个实施方案中，TH蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。

在一个实施方案中，TH基因为SEQ ID NO:1的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的检测DRD的方法包括如下至少一组引 物扩增的步骤：

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在一个实施方案中，本发明的检测DRD的方法中检测突变位点通过 选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录 酶链反应和变性高效液相色谱。

在本发明第二方面的方法中，优选检测纯合的突变TH基因。

在第三方面，本发明涉及一种检测突变TH基因或TH蛋白的方法， 所述方法包括检测受试者的TH基因或TH蛋白中是否存在突变位点，所 述突变位点选自如下任一种或其组合：

错义突变（c.1004C>T，p.A335V）；和

错义突变（c.1451G>A,p.R484H）。

在一个实施方案中，TH蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。

在一个实施方案中，TH基因为SEQ ID NO:1的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的检测突变TH基因或TH蛋白的方法包 括如下至少一组引物扩增的步骤：

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在一个实施方案中，本发明的检测突变TH基因或TH蛋白的方法中 检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、原位杂 交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。

在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变TH基因或TH蛋白中 使用的引物对，所述突变是选自如下任一种或其组合：

错义突变（c.1004C>T，p.A335V）；和/或

错义突变（c.1451G>A,p.R484H），

其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序 列上前后设计，使得扩增该位置：cDNA序列第1004位和第1451位。

在第五方面，本发明涉及与突变TH基因互补的核酸探针，所述突变 是选自如下任一种或其组合：

错义突变c.1004C>T；和/或

错义突变c.1451G>A，

所述探针与突变TH基因的互补区包括选自如下的基因组序列或 cDNA序列上的位置：cDNA序列第1004位和第1451位。

在第六方面，本发明涉及检测突变TH基因或TH蛋白的试剂盒，包 含一组或多组引物对，其中所述突变是选自如下任一种或其组合：

错义突变（c.1004C>T，p.A335V）；和

错义突变（c.1451G>A,p.R484H），

其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序 列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：cDNA序列第1004位和第1451 位。

在一个实施方案中，所述检测突变TH基因或TH蛋白的试剂盒包含 选自如下的至少一组引物：

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在第七方面，本发明涉及检测突变TH基因的试剂盒，包含一个或多 个核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合：

错义突变c.1004C>T；和

错义突变c.1451G>A，

所述探针与突变TH基因上包含选自如下位置的基因组序列或 cDNA序列上的区域互补：cDNA序列第1004位和第1451位。

在第八方面，本发明涉及TH基因的突变外显子9和/或突变外显 子14。

在本发明中，引物对SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于扩增TH 基因的野生型或突变外显子9；引物对SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6 用于扩增TH基因的野生型或突变外显子14。

本发明发现了多巴反应性肌张力障碍相关基因的2个新的突变位 点，对该基因位点的检测可能用于DRD患者的辅助诊断，并且可能有 利于明确DRD患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变TH基因或 TH蛋白的方法可以用于诊断DRD的目的，例如产前诊断、植入前遗传 学诊断（PGD）、患者筛查。然而，本发明的方法并不仅限于用于诊断疾 病的目的。

另外，本发明的检测突变TH基因或TH蛋白的方法也可以用于非诊 断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和 多态性，用于家族演化研究。本发明可以对DRD的发病机理提供重要 线索，对DRD的诊断治疗具有十分重要的意义。这样的应用也是本领 域技术人员可以理解的。

例如，根据本文的描述可以看出，有些个体携带本发明所述的突变 TH基因但不患DRD，例如仅一条染色体携带突变的杂合基因型。对这部 分人群的检测可以任何不涉及诊断疾病的目的，因为这些个体并不患病。 但对于他们进行检测的结果可以作为例如有用信息使用，例如作为育前检 查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分 布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。

野生型TH基因序列和TH蛋白序列说明

人TH基因的序列（SEQ ID NO:1）（下划线标明突变位置）：

ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCCGTGTCTGAGCTGGACGCC AAGCAGGCAGAGGCCATCATGGTAAGAGGGCAGGGCGCCCCGGGGCCCAGCCTCACAGGCTCTCCGTGGCCT GGAACTGCAGCCCCAGCTGCATCCTACACCCCCACCCCAAGGTCCCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGAGC CTCATCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCTGCAGTCCCCTCGGAGCCC GGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAGAAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCG AGGGCCACCAAGCCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAAATCCACCAT CTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCCCACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTG CGCCGAGGGGACCTGGCCGCCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGG CCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGAC CCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAG ATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGG AAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCT TTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAG GAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCC TTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGC TGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGC CTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTC GGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTG CACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGAC CAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCC TCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCC CAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATT GGCTAG

人TH蛋白的序列（SEQ ID NO:2）（下划线标明突变位置）：

MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQGAPGPSLTGSPWPGTAAPAASYTPTPRSPRFIGRRQSL IEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRP AQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPG FSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNI PQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFA QFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQP YQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG

附图说明

图1示出常染色体隐性DRD家系的两名患者（II1、II2）及其父母 （I1、I2）的关系图。

图2示出对图1中亲代H1和H2的测序结果，（A）I1的TH基 因8号外显子的测序结果；（B）I2的TH基因8号外显子的测序结果； （C）I1的TH基因12号外显子的测序结果；（D）I2的TH基因12 号外显子的测序结果。

具体实施方式

突变型多巴反应性肌张力障碍相关TH基因与野生型多巴反应性 肌张力障碍相关TH基因在序列上的区别是c.1004C>T和c.1451G>A， 其中c.1004C>T表示野生型TH基因第1004位的碱基为C，突变型 DRD相关基因的第1004位碱基突变为T；c.1451G>A表示野生型TH 基因第1451位的碱基为G，突变型DRD相关基因的第1451位碱基突 变为A。

在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。c.1004C>T表示cDNA 第1004位核苷酸由C变成T；p.A335V表示蛋白质水平第335位密码子由A 变成V；c.1451G>A表示cDNA第1451位核苷酸由G变成A；p.R484H表示 蛋白质水平第484位密码子由变成H。

野生型人TH基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

野生型人TH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员 应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说 明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开 了与之互补的另一条链。例如提及TH基因的cDNA序列，实际上包括该序 列以及其互补序列。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本 领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

在本发明中，复合杂合突变是指患者两条同源染色体上的TH基因各有 一个不同的杂合突变，在本发明中一个杂合突变遗传自父亲，一个杂合突 变遗传自母亲。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意 味着另一种也被公开。例如提及TH基因的cDNA序列，实际也包括相应的 RNA序列。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技 术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定 本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的 文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译 的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得 的常规产品。

实施例：

发明人采集到一个二代遗传的常染色体隐性DRD家系，家系内2 名患者（男性1名，女性1名）表现为步态异常和肌张力障碍，对小 剂量多巴制剂有显著而持续的疗效。如图1所示，两名患者分别是（II1、 II2），他们是兄妹关系。他们的父母（I1、I2）表型正常，I1和I2各 携带一个突变（如图2所示），I1携带c.1004C>T，I2携带c.1451G>A， 而遗传给II1、II2后，II1、II2都携带两个突变，从而出现临床表型。 II1是先证者。

分别对该常染色体隐性DRD家系内2名DRD患者（II1、II2） 及其父母（I1、I2），200名健康对照者的基因组中多巴反应性肌张力 障碍相关TH基因进行检测，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法 获得多巴反应性肌张力障碍相关基因9号外显子及14号外显子的序列， 结合序列测定比对结果，发现多巴反应性肌张力障碍相关TH基因的2 个新的突变位点。

1.多巴反应性肌张力障碍相关基因的2个新的突变位点的发现具 体步骤如下：

1）DNA提取

分别采取上述的2名DRD患者及其父母的外周静脉血，每人5mL， 经枸橼酸钠抗凝，常规酚/氯仿法提取基因组DNA，分光光度计测DNA 含量，并稀释至20ng/μL；

2）PCR扩增

根据多巴反应性肌张力障碍TH基因：

9外显子的核苷酸序列设计如下的引物：

正向引物：5'GAGGACGTCTCCCGCTTC  3'（SEQ ID NO:3）

反向引物：5'AGCAGGCAGCACACTTCAC  3'（SEQ ID NO:4）

14外显子的核苷酸序列设计如下的引物：

正向引物：5'CTGGAAGAGGCCTCAGTGTC 3'（SEQ ID NO:5）

反向引物：5'AGGACAGGACCTCACCACAG 3'（SEQ ID NO:6）

PCR反应体系：10μL

反应条件如下面的表1所示：

表1：PCR反应条件

得到的PCR产物可以在4℃保存。

3）测序

将步骤2中获自家系中2名DRD患者及其父母的PCR扩增产物 进行DNA测序，测序在深圳华大基因科技有限公司进行。

其中，作为示例显示，对于父母（I1、I2）的测序结果见图2：

（A）I1的TH基因8号外显子的测序结果：

GCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGG[C/T]CTTCCGCGTGTTCC A（SEQ ID NO:11和12）；

（B）I2的TH基因8号外显子的测序结果：

GCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCA （SEQ ID NO:11）；

（C）I1的TH基因12号外显子的测序结果：

CTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCG （SEQ ID NO:13）；

（D）I2的TH基因12号外显子的测序结果：

CTATGCCTCACGCATCCAGC[G/A]CCCCTTCTCCGTGAAGTTC G（SEQ ID NO:13和14）。

对于获自该DRD家系内的2名患者的PCR扩增样品，测得的序 列如下所示（下划线为外显子序列，突变位点用边框标示出）。

突变外显子9（SEQ ID NO:7）：

GAGGACGTCTCCCGCTTCctgaagggtgtgcccagacgggaggggcgcag agccggggggccggggatggtcagccaagcgccccaccccagcgcggctc cagcccgtcccggctcggcagtgacccgcgtggccccttgcagagcgcacgggcttccagctgcggcctgtggccggcctgctgtccgcccgggacttcctggccagcctggcttccgcgtgttccagtgcacccagtatatccgccacgcgtcctcgcccatgcactcccctgagccgtgagtgcgcgccctggccgc cagcccgagggtggggggtgcgacgggcggcccctcagcccccttctccc tcctacgcgcagggactgctgccacgagctgctggggcacgtgcccatgc tggccgaccgcaccttcgcgcagttctcgcaggtacgccgcggcctcgga gggagccggggtcacccaggggctggcttggcgccgggggcgggcgggga tcgatgtgcgggtggGTGAAGTGTGCTGCCTGCT

突变外显子14（SEQ ID NO:8）：

CTGGAAGAGGCCTCAGTGTCccgcctgtgaccagttggctcagaaaagcc ctgggagctctgagccactgtgaaggtggaaacgcggcccctggcctccc ctctcctggaggctgcagactctgcccgccagttgacgagggctctgccg ctctcctccccaggagctatgcctcacgcatccagcccccttctccgtgaagttcgacccgtacacgctggccatcgacgtgctggacagcccccaggccgtgcggcgctccctggagggtgtccaggatgagctggacacccttgcccatgcgctgagtgccattggctaggtgcacggcgtccctgagggcccttcc caacctcccctggtcctgcactgtcccggagctcaggccctggtgagggg ctgggtcccgggtgccccccatgccctccctgctgccaggctcccactgc ccctgcacctgcttctcagcgcaacagctgtgtgtgcccgtggtgaggtt gtgctgcCTGTGGTGAGGTCCTGTCCT

家系中2名正常人各有以下一种序列形式，测得的序列如下所示 （下划线为外显子序列，突变前的碱基c/g用边框标示出）。

野生型外显子9（SEQ ID NO:9）：

GAGGACGTCTCCCGCTTCctgaagggtgtgcccagacgggaggggcgcag agccggggggccggggatggtcagccaagcgccccaccccagcgcggctc cagcccgtcccggctcggcagtgacccgcgtggccccttgcagagcgcacgggcttccagctgcggcctgtggccggcctgctgtccgcccgggacttcctggccagcctggcttccgcgtgttccagtgcacccagtatatccgccacgcgtcctcgcccatgcactcccctgagccgtgagtgcgcgccctggccgc cagcccgagggtggggggtgcgacgggcggcccctcagcccccttctccc tcctacgcgcagggactgctgccacgagctgctggggcacgtgcccatgc tggccgaccgcaccttcgcgcagttctcgcaggtacgccgcggcctcgga gggagccggggtcacccaggggctggcttggcgccgggggcgggcgggga tcgatgtgcgggtggGTGAAGTGTGCTGCCTGCT

野生型外显子14（SEQ ID NO:10）：

CTGGAAGAGGCCTCAGTGTCccgcctgtgaccagttggctcagaaaagcc ctgggagctctgagccactgtgaaggtggaaacgcggcccctggcctccc ctctcctggaggctgcagactctgcccgccagttgacgagggctctgccg ctctcctccccaggagctatgcctcacgcatccagcccccttctccgtgaagttcgacccgtacacgctggccatcgacgtgctggacagcccccaggccgtgcggcgctccctggagggtgtccaggatgagctggacacccttgcccatgcgctgagtgccattggctaggtgcacggcgtccctgagggcccttcc caacctcccctggtcctgcactgtcccggagctcaggccctggtgagggg ctgggtcccgggtgccccccatgccctccctgctgccaggctcccactgc ccctgcacctgcttctcagcgcaacagctgtgtgtgcccgtggtgaggtt gtgctgcCTGTGGTGAGGTCCTGTCCT

完成家系共分离的验证。

4）结果分析：

2名多巴反应性肌张力障碍患者TH基因的9号外显子的第1004 位均发生了C→T的突变，14号外显子的第1451位均发生了G→A的 突变。

9号外显子的第1004位发生C→T的突变，该突变导致多巴反应 性肌张力障碍患者TH基因的编码蛋白质的第335位氨基酸序列由变 为丙氨酸（A）变为缬氨酸（V）；14号外显子的第1451位发生了G→A 的突变,该突变导致多巴反应性肌张力障碍患者TH基因的编码蛋白质 的第484位氨基酸序列由精氨酸（R）变为组氨酸（H）。

2验证过程实施例

此外，本发明人还进一步对该家系外的200个正常人的多巴反应 性肌张力障碍患者TH基因进行了突变筛查，方法同上。未发现上述 的C→T突变及G→A的突变，排除了单个核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的可能性，确定上述的T→G突变是 该常染色体显性遗传DRD家系的致病基因突变。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。