一种大岩桐组培繁殖和块茎保存及其再繁殖的方法

摘要

本发明涉及一种大岩桐组培繁殖和保存及其再繁殖的方法，包括母株培养、外植体选择与消毒，在培养温度为26±2℃，光照培养时间为每天11～13h，光照强度为2500～5000lx条件下诱导分化；在500ml的三角瓶中继代扩繁；组培苗移栽，组培苗定植得到大岩桐组培苗木；组培苗保存及其再繁殖是将扩繁瓶子苗在500ml的三角瓶中培养，培养温度为16～28℃，光照强度为500～1500lx，光照时间为每天11～12h，瓶内结球，用块茎保存继代；瓶内块茎的复苏和进入下一周期的继代扩繁。本方法具有简单易行、效高价廉、繁殖速度快，不受时间和季节的限制，有利于高效繁殖，并应用于实际生产，具有较好经济效益、社会效益和生态效益。

说明书

技术领域  

本发明属于植物栽培技术领域，涉及观赏花卉快速繁殖和无菌材料的基因保存，具体涉及一种大岩桐组培繁殖和块茎保存及其再繁殖的方法。

背景技术

大岩桐(Sinningia speciosa)是苦苣苔科大岩桐属多年生肉质球根草本花卉，原产于巴西的热带雨林，二十世纪三十年代引进我国。大岩桐的块茎扁球形，地上茎极短，株高15-25 cm，全株密被白色绒毛，花大色艳，花期长，是室内盆栽、花坛造型、会议租摆的理想花卉。大岩桐不耐寒，植株地上部分在冬季会枯死，地下块茎越冬保存需要非常适宜的温度、湿度和基质，一般是把块茎取出，埋藏在微湿的沙中；在管理得当的情况下，大岩桐的块茎可连续栽植7年至8年；在太湿、太干、太冷的条件下越冬，大岩桐块茎容易腐烂、干瘪，失去活性。大岩桐常规采用播种、分割块茎、枝插、叶插等方法繁殖，繁殖系数较低。利用组织培养技术可以在短时间内提供大批大岩桐苗木，且能保持优良品种的性状，是一个很有潜力的发展方向。

二十年来，国内研究大岩桐组织培养的论文超过一百篇，但大多数研究停留在实验室探讨阶段。目前为止，国内只有我们和上海师范大学的赵小梅、孙静秋、戴黎鸣注意到大岩桐外植体有瓶内结球、形成块茎的现象。赵小梅等以大岩桐叶、顶芽为外植体，研究了“NAA、IBA对大岩桐块茎形成的影响”（上海师范大学学报，2006年4期）；孙静秋等在“大岩桐试管结球的初步研究”中，探讨了不同蔗糖浓度、添加活性炭和液体悬浮培养对大岩桐试管结球的影响（上海农业学报，2003年4期）；戴黎鸣等在“影响大岩桐试管块茎形成的若干因素”中，以大岩桐顶芽带2对叶、叶带叶柄为材料，研究了不同碳源、BA浓度和光照条件对大岩桐试管块茎形成的影响（上海师范大学学报，2006年5期）。

本发明专利的发明人黄小荣，1985～2010年在广西林科院组培室研究了“华南地区年产100万组培苗工厂新树种基因库的建立”，对金花茶、牡丹山茶等五十几种珍稀林木、花卉组培基因的保存技术进行了研究（广西林业，1990年S1期）。1998年，林业部重点项目“南亚热带珍稀花木培育技术研究”的实施，引进了8种珍稀大岩桐品种，其中4个品种建立了无菌再生繁殖体系（黄小荣等，“大岩桐的组织培养”，广西林业科学，2001年3期）。与上海师范大学的三个研究团队不同的是，我们的大岩桐结球是在500 ml三角瓶的改良ER继代培养基上自然发生的，块茎为土豆色；他们的大岩桐试管结球是诱导产生的，块茎为浅绿、黄绿、鲜绿和墨绿色；我们用于保存的块茎质量较好，个头较大（4～7 mm），而且是处于半休眠状态的块茎。我们继代保存培养时使用的是瓶苗的基部，而他们研究试管内结球时使用的材料是顶芽、叶、顶芽带2对叶、叶带叶柄。我们用来使组培苗从旺盛生长繁殖转向结球半休眠状态的关键因素不是NAA、IBA、BA、活性炭、悬浮培养，而是培养基的琼脂含量，即基质的含水率和硬度，辅以弱光照和比常规继代扩繁培养基略高的蔗糖含量。

大岩桐组培快繁工厂化生产中存在的最大问题，是生产期与销售期的脱节，以及在不生产的年份如何低成本地保存无菌离体基因，在生产的季节随时提供无菌材料扩大生产。大岩桐无菌离体繁殖材料在常规MS继代培养条件下生长太快，特别是瓶子苗的株高生长，每月达3～6 cm，很快顶到培养容器上部的棉塞或瓶盖，容易因此造成污染。所以，一般大岩桐无菌瓶苗1个月需要继代培养1次。在1～2年都没有大订单的情况下，请工人配培养基、消毒、继代来保存无菌离体繁殖材料的花费相当大；另一方面，大岩桐外植体消毒接种的成功率很低，且接种材料的获取受到室外温度、盆苗植株生长状况的影响；当重新出现市场需求时，如果要从重新接种来形成生产规模的话，往往需要较长时间，难以满足市场需求。因此，只有开发一种能够减缓大岩桐瓶子苗株高生长的培养基和培养方法，减少继代转瓶频率，同时又能够保持无菌材料的活力和数量以备随时投入生产，形成一套‘收放自如’的大岩桐组培生产和保存体系，才能达到低成本地保存无菌材料和迅速扩繁生产盈利的双重要求。

我们试验了不同培养容器对大岩桐瓶内结球的影响，发现有利于大岩桐离体保存的培养容器从优到劣排列顺序是500 ml三角瓶、250 ml三角瓶、250 ml广口瓶、直径3 cm试管、直径2 cm试管。通过调整继代培养基琼脂含量、光照强度，使大岩桐瓶苗向结球供应养料，减缓瓶苗的株高生长和芽苗分化，延长继代周期，利用大岩桐固有的结球特征进行瓶内基因保存，保存的材料随时可应用于快繁生产，这一技术具有实用性和创新性，特别是对于那些稀有大岩桐品种的离体保存和快速大规模商品化生产，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对大岩桐常规繁殖技术的不足，旨在提供一种大岩桐组培繁殖和块茎保存及其再繁殖的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种大岩桐组培繁殖和保存及其再繁殖的方法，组培繁殖包括母株培养、外植体选择与消毒、诱导分化、继代扩繁、组培苗移栽、组培苗定植工序，得到大岩桐组培苗木；保存及其再繁殖的方法是将瓶子苗从扩繁转向瓶内结球、保存块茎的继代、瓶内块茎的复苏和进入下一周期的继代扩繁，其操作步骤如下：

（1）母株培养：选用开过花或正在开花的盆栽大岩桐作为母株，适当追肥、修剪，促进大岩桐萌芽和植株的生长；

（2）外植体选择与消毒：选择大岩桐健壮的腋芽或顶芽带下部枝条，剪成3～4 cm，在超净工作台上用70 %的乙醇浸润8～10秒，再用无菌水漂洗2次，然后将材料转移到已灭菌的广口瓶，用0.1 %的升汞消毒10～12分钟，最后用无菌水清洗5次；

（3）诱导分化：将消毒好的外植体的两端切口分别剪去2～3 mm，将修剪好的外植体斜插在试管诱导培养基上，所述的诱导培养基采用改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L、NAA 0.25 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂4.5 g/L，为了提高接种成功率，每只试管只插一个外植体进行诱导培养，培养温度为26±2 ℃，光照培养时间为每天11～13 h，光照强度为2500～5000 lx，15天后外植体膨大，25天后出现芽点；

（4）继代扩繁：将试管接种成功的无菌材料转入装有继代培养基的500 ml三角瓶容器中，所述的继代培养基采用改良ER配方，附加BA 0.2～0.25 mg/L，NAA 0.1～0.12 mg/L，蔗糖30 g/L、琼脂4.5 g/L，主要是通过腋生枝途径继代扩繁，少数接触到继代培养基的叶片也产生丛生芽，温度和光照同诱导培养条件，25～32天继代1次，每瓶有效瓶子苗20～40株；

（5）组培苗移栽：移栽组培苗，苗床基质先用0.1 %的高锰酸钾淋透消毒1天后使用，所述的苗床基质为沙3份＋珍珠岩1份；移栽时先将3～6 cm高的组培丛生苗从三角瓶内夹出，清水洗去培养基，再将组培丛生苗分成单株，移栽到苗床上；

（6）组培苗定植：组培苗在苗床上经过28～32天的驯化适应之后，挑选健壮植株移栽到装有定植基质的营养杯定植，所述的定植基质为珍珠岩1份、沙3份、素土3份，定植后的杯苗1月后可以出售；

（7）瓶内结球：完成组培苗生产任务后，剩余的继代扩繁瓶子苗作为备用材料进入保存阶段，保存阶段采用保存培养基在500 ml的三角瓶中培养，所述的保存培养基采用改良ER配方，附加BA 0.2～0.25 mg/L，NAA 0.1～0.12 mg/L，蔗糖40 g/L、琼脂6.5 g/L，培养温度为16～28℃，光照强度为500～1500 lx，光照时间为每天11～12 h，修剪瓶子苗，剪去株高高于2.5～3 cm以上的部分，保留膨大的基部，剪好的材料直插方式转入装有保存培养基的500 ml三角瓶中培养，插入深度为3～6 mm，由于保存培养基较硬，模拟了冬季的干旱条件，瓶子苗的株高生长很慢，分化芽非常少，养分开始供应基部结球，保存3.5～4月后，瓶子苗的基部结球直径达2～4 mm；

（8）保存块茎的继代：每隔3.5～4月，将瓶内结球从旧的保存培养基转入新的保存培养基，以避免三角瓶的棉塞连续使用太长时间而出现霉菌污染，保留块茎和其上部2.5～3 cm高的植株，其余材料剪掉丢弃，保存温度为16～28℃，光照强度为500～1500 lx，光照时间为每天11～12 h，块茎逐渐增大，经过1年的保存，块茎直径可达4～7 mm；

（9）瓶内块茎的复苏：当需要扩大生产时，将半休眠状态的块茎材料复苏唤醒，将保存的瓶内块茎和其上部植株整块转入诱导培养基，使块茎完全浸泡在半固态培养基中，培养室温度升高至26±2℃，光照强度提高到2500～5000 lx，每天光照11～13 h，20～30天块茎分化大量新芽，繁殖系数10以上，切分块茎，进入下一周期腋生枝继代扩繁阶段。

以上所述的改良ER配方为：NH₄NO₃ 1200 mg/L、KNO₃ 1600 mg/L、CaCl₂ 400 mg/L、MgSO₄ 370 mg/L、KH₂PO₄ 170 mg/L、H₃BO₃ 0.63 mg/L、MnSO₄·4H₂O 2.23 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 15 mg/L、Na₂MoO₂·2H₂O 0.025 mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025 mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L、Na₂·EDTA · 2H₂O 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、烟酸1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5 mg/L、盐酸硫胺素1 mg/L、甘氨酸1 mg/L。

本发明相对于现有的技术具有以下优点：

（1）本发明一种大岩桐组培繁殖和块茎保存及其再繁殖的方法，利用大岩桐的自然结球特性，通过改变培养基琼脂含量，调整培养基含水率和硬度，调整光照强度，减缓瓶子苗株高生长，促使瓶内结球，延长保存继代周期，减少备用基因保存的成本。

（2）本发明一种大岩桐组培繁殖和块茎保存及其再繁殖的方法，使用瓶内结球继续转入保存培养基的方法，使瓶内块茎在新的保存培养基上继续增大、分化芽苗很少，形成的块茎个头大、质量好，在需要生产时可以迅速扩繁。

（3）本发明一种大岩桐组培繁殖和块茎保存及其再繁殖的方法，利用500 ml三角瓶作为容器进行组培生产和备用基因保存，这种容器的内空大，瓶口塞上棉塞，再包上牛皮纸，单瓶容纳的材料多，单次保存继代可存放3.5～4月不污染，极大地减少了劳力使用。如果采用试管保存，单管容纳材料少，离体保存转瓶需要的人力较多。广口瓶的瓶高相对较矮，瓶苗容易顶到瓶盖，容易污染，达不到长期离体保存基因的目的。

（4）本发明一种大岩桐组培繁殖和块茎保存及其再繁殖的方法，结合组培快繁和离体基因保存技术，解决了大岩桐组培苗供求脱节的问题，具有简便易行、成本低廉、扩繁迅速、成活率高的特征；在组培快繁和离体保存中始终使用低激素，有利于保持品种的优良特性。本发明对于珍稀大岩桐品种的保存和快繁具有重大意义。

具体实施方式

通过下面给出的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。

实施例1 

选用开过花或正在开花的盆栽大岩桐作为母株，适当追肥、修剪，促进大岩桐萌芽和植株的生长；选择大岩桐健壮的腋芽或顶芽带下部枝条为外植体，剪成3～4 cm，在超净工作台上用70 %的乙醇浸润10秒，再用无菌水漂洗2次，然后将材料转移到已灭菌的广口瓶，用0.1 %的升汞消毒10分钟，最后用无菌水清洗5次。

将消毒好的外植体的两端切口分别剪去2～3 mm，将修剪好的外植体斜插在试管以NH₄NO₃ 1200 mg/L、KNO₃ 1600 mg/L、CaCl₂ 400 mg/L、MgSO₄ 370 mg/L、KH₂PO₄ 170 mg/L、H₃BO₃ 0.63 mg/L、MnSO₄·4H₂O 2.23 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 15 mg/L、Na₂MoO₂·2H₂O 0.025 mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025 mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L、Na₂·EDTA · 2H₂O 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、烟酸1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5 mg/L、盐酸硫胺素1 mg/L、甘氨酸1 mg/L组成的改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L、NAA 0.25 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂4.5 g/L的诱导培养基上，每只试管只插一个外植体进行诱导培养，培养温度为26±2 ℃，光照培养时间为每天12 h，光照强度为5000 lx，15天后外植体膨大，22天后出现芽点；再将试管接种成功的无菌材料转入装有上述改良ER配方，附加BA 0.2 mg/L，NAA 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L、琼脂4.5 g/L的继代培养基的500 ml三角瓶容器中，主要是通过腋生枝途径继代扩繁，少数接触到继代培养基质的叶片也产生丛生芽，温度和光照同诱导培养条件，25天继代1次，每瓶有效瓶子苗28～32株。

将继代扩繁组培苗移栽，移栽前先用0.1 %的高锰酸钾淋透苗床消毒1天，苗床基质为沙3份＋珍珠岩1份，继代扩繁组培苗移栽时先将3～6 cm高的组培丛生苗从三角瓶内夹出，清水洗去培养基，再将组培丛生苗分成单株，移栽到苗床上；组培苗在苗床上经过32天的驯化适应之后，挑选健壮植株移栽到装有以珍珠岩1份、沙3份、素土3份的定植基质的营养杯定植，定植1月后出售杯苗。

实施例2

选用开过花或正在开花的盆栽大岩桐作为母株，适当追肥、修剪，促进大岩桐萌芽和植株的生长；选择大岩桐健壮的腋芽或顶芽带下部枝条为外植体，剪成3～4 cm，在超净工作台上用70 %的乙醇浸润10秒，再用无菌水漂洗2次，然后将材料转移到已灭菌的广口瓶，用0.1 %的升汞消毒11分钟，最后用无菌水清洗5次。

将消毒好的外植体的两端切口分别剪去2～3 mm，将修剪好的外植体斜插在以NH₄NO₃ 1200 mg/L、KNO₃ 1600 mg/L、CaCl₂ 400 mg/L、MgSO₄ 370 mg/L、KH₂PO₄ 170 mg/L、H₃BO₃ 0.63 mg/L、MnSO₄·4H₂O 2.23 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 15 mg/L、Na₂MoO₂·2H₂O 0.025 mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025 mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L、Na₂·EDTA · 2H₂O 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、烟酸1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5 mg/L、盐酸硫胺素1 mg/L、甘氨酸1 mg/L组成的改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L、NAA 0.25 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂4.5 g/L的试管诱导培养基上，每只试管只插一个外植体进行诱导培养，培养温度为26±2 ℃，光照培养时间为每天13 h，光照强度为2500 lx，15天后外植体膨大，25天后出现芽点；再将试管接种成功的无菌材料转入装有以上所述的改良ER配方，附加BA 0.25 mg/L，NAA 0.12 mg/L，蔗糖30 g/L、琼脂4.5 g/L的继代培养基的500 ml三角瓶容器中，主要是通过腋生枝途径继代扩繁，少数接触到继代培养基质的叶片也产生丛生芽，温度和光照同诱导培养条件，32天继代1次，每瓶有效瓶子苗30～35株。

将继代扩繁组培苗移栽，移栽前先用0.1 %的高锰酸钾淋透苗床消毒1天后使用，苗床基质为沙3份＋珍珠岩1份，继代扩繁组培苗移栽时先将3～6 cm高的组培丛生苗从三角瓶内夹出，清水洗去培养基质，整丛移栽到苗床上；组培苗在苗床上经过32天的驯化适应之后，分成单株，挑选健壮单株移栽到装有定植基质的营养杯定植，定植基质为珍珠岩1份、沙3份、素土3份，定植1月后出售杯苗。

实施例3

选用开过花或正在开花的盆栽大岩桐作为母株，适当追肥、修剪，促进大岩桐萌芽和植株的生长；选择大岩桐健壮的腋芽或顶芽带下部枝条为外植体，剪成3～4 cm，在超净工作台上用70 %的乙醇浸润9秒，再用无菌水漂洗2次，然后将材料转移到已灭菌的广口瓶，用0.1 %的升汞消毒12分钟，最后用无菌水清洗5次。

将消毒好的外植体的两端切口分别剪去2～3 mm，将修剪好的外植体斜插在以上所述的改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L、NAA 0.25 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂4.5 g/L的试管诱导培养基上，每只试管只插一个外植体进行诱导培养，培养温度为26±2 ℃，光照培养时间为每天12 h，光照强度为4000 lx，15天后外植体膨大，25天后出现芽点；再将试管接种成功的无菌材料转入装有以NH₄NO₃ 1200 mg/L、KNO₃ 1600 mg/L、CaCl₂ 400 mg/L、MgSO₄ 370 mg/L、KH₂PO₄ 170 mg/L、H₃BO₃ 0.63 mg/L、MnSO₄·4H₂O 2.23 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 15 mg/L、Na₂MoO₂·2H₂O 0.025 mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025 mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L、Na₂·EDTA · 2H₂O 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、烟酸1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5 mg/L、盐酸硫胺素1 mg/L、甘氨酸1 mg/L组成的改良ER，附加BA 0.2～0.25 mg/L，NAA 0.1～0.12 mg/L，蔗糖30 g/L、琼脂4.5 g/L的继代培养基的500 ml三角瓶容器中，主要是通过腋生枝途径继代扩繁，少数接触到继代培养基质的叶片也产生丛生芽，温度和光照同诱导培养条件，28天继代1次，每瓶有效瓶子苗28～32株。

将继代扩繁组培苗移栽，移栽前先准备好沙3份＋珍珠岩1份的苗床基质，先用0.1 %的高锰酸钾淋透消毒1天后使用，继代扩繁组培苗移栽时先将3～6 cm高的组培丛生苗从三角瓶内夹出，清水洗去培养基，再将组培丛生苗分成单株，移栽到苗床上；组培苗在苗床上经过30天的驯化适应之后，挑选健壮植株移栽到装有以珍珠岩1份、沙3份、素土3份的定植基质的营养杯定植，定植1月后出售杯苗。

实施例4

将上述实施例1中完成组培苗生产任务后剩余的继代扩繁瓶子苗保存，保存采用上述的保存培养基，即改良ER配方，附加BA 0.2 mg/L，NAA 0.1 mg/L，蔗糖40 g/L、琼脂6.5 g/L，用500 ml的三角瓶进行培养保存，培养温度为22～28℃，光照强度为500～800 lx，光照时间为每天12 h；修剪瓶子苗，剪去株高高于2.5～3 cm以上的部分，保留膨大的基部，剪好的材料直插方式转入装有保存培养基的500 ml三角瓶中培养，插入深度为5～6 mm，由于保存培养基较硬，模拟了冬季的干旱条件，瓶子苗的株高生长很慢，分化芽非常少，养分开始供应基部结球，保存3.5～4月后，瓶子苗的基部结球直径达2～4 mm。

保存每隔3.5～4月，将瓶内结球从旧的保存培养基转入上述新的保存培养基，以避免三角瓶的棉塞连续使用太长时间而出现霉菌污染，保存是保留块茎和其上部2.5～3 cm高的植株，其余材料剪掉丢弃，保存温度为22～28℃，光照强度为500～800 lx，光照时间为每天12 h，块茎逐渐增大，经过1年的保存，块茎直径可达6～7 mm；当需要扩大生产时，将半休眠状态的块茎材料复苏唤醒，将保存的瓶内块茎和其上部植株整块转入诱导培养基，使块茎完全浸泡在半固态培养基中，培养室温度升高至26±2℃，光照强度提高到3500～5000 lx，每天光照12 h，20天块茎分化大量新芽，繁殖系数10以上，切分块茎，按实施例1大岩桐组培繁殖条件进行下一周期腋生枝继代扩繁，能快速得到市场需要的杯苗。

实施例5

将上述实施例2完成组培苗生产任务后剩余的继代扩繁瓶子苗保存，保存采用上述的保存培养基，即改良ER配方，附加BA 0.25 mg/L，NAA 0.12 mg/L，蔗糖40 g/L、琼脂6.5 g/L的保存培养基，用500 ml的三角瓶进行保存培养，培养温度为16～20℃，光照强度为1000～1500 lx，光照时间为每天11 h，修剪瓶子苗，剪去株高高于2.5～3 cm以上的部分，保留膨大的基部，剪好的材料直插方式转入装有上述保存培养基的500 ml三角瓶中培养，插入深度为3～4 mm，由于保存培养基较硬，模拟了冬季的干旱条件，瓶子苗的株高生长很慢，分化芽非常少，养分开始供应基部结球。

保存3.5～4月后，瓶子苗的基部结球直径达2～3 mm；每隔3.5～4月，将瓶内结球从旧的保存培养基转入新的保存培养基，以避免三角瓶的棉塞连续使用太长时间而出现霉菌污染，保留块茎和其上部2.5～3 cm高的植株，其余材料剪掉丢弃，保存温度为16～20℃，光照强度为1000～1500 lx，光照时间为每天11 h，块茎逐渐增大，经过1年的保存，块茎直径可达4～6 mm；当需要扩大生产时，将半休眠状态的块茎材料复苏唤醒，将保存的瓶内块茎和其上部植株整块转入诱导培养基，使块茎完全浸泡在半固态培养基中，培养室温度升高至26±2℃，光照强度提高到2500～3000 lx，每天光照13 h，25天块茎分化大量新芽，繁殖系数10以上，切分块茎，按实施例2大岩桐组培繁殖条件进行下一周期腋生枝继代扩繁阶段，能快速得到市场需要的杯苗。