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法律状态信息
法律状态
2019-10-29
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K31/352 授权公告日:20160113 终止日期:20181105 申请日:20121105
专利权的终止
2016-01-13
授权
授权
2014-07-16
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K31/352 申请日:20121105
实质审查的生效
2014-05-21
公开
公开
技术领域
本发明属于药物应用技术领域,涉及肿瘤血管破坏剂DMXAA的新的药物用途,具体涉及DMXAA在制备抗血小板、抗血栓药物中的用途,以及在制备预防和治疗动脉血栓性疾病药物中的应用。
背景技术
随着人民生活水平的提高,中风、冠心病等动脉血栓性疾病已成为威胁我国人民身体健康和生命安危的头号杀手。研究显示,血小板异常激活引起的血管内血栓形成是动脉血栓性疾病冠心病和中风的病理基础,因而抑制血小板激活的抗血小板药成为预防与治疗这类疾病的主要手段。有关研究表明,抗血小板药对冠心病和中风的疗效肯定,但治疗效果仍未尽如人意。目前临床上广泛应用的抗血小板药主要包括环氧化酶抑制剂阿司匹林,噻吩吡啶类P2Y12受体拮抗剂如氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷,血小板纤维蛋白原受体拮抗剂阿昔单抗等和磷酸二酯酶抑制剂西洛他唑等;但上述药物或具有胃肠道毒性,或临床应用中存在耐受和抵抗现象,或出血副作用大,因而局限了它们的应用。
肿瘤血管破坏剂DMXAA又名Vadimezan或ASA404,是含有三元环化学结构的黄酮类化合物,现有技术公开了其主要通过破坏肿瘤血管导致肿瘤组织血供不足,作为抗肿瘤药已进入III期临床试验,人体内最大耐受血药浓度是1.29mM,临床应用非常安全。
迄今为止,尚未见有关肿瘤血管破坏剂DMXAA在制备抗血小板、抗血栓药物中的用途的报道。
发明内容
本发明的目的是提供肿瘤血管破坏剂DMXAA的新的药物用途,具体涉及DMXAA在制备抗血小板、抗血栓药物中的用途。
本发明中,所述的DMXAA具有式(Ⅰ)的结构,
本发明对所述的DMXAA进行了体外、离体及体内试验,结果表明,DMXAA具有显著地抗血小板、抗血栓作用;所述DMXAA对U46619、花生四烯酸、ADP、胶原、瑞氏托霉素诱导的血小板聚集和ATP释放具有良好的抑制效应;进一步的机制研究结果显示,DMXAA主要通过抑制TXA2生成(如图1所示)和TXA2受体拮抗(如图2所示)发挥抗血小板作用;U46619、花生四烯酸、胶原、瑞氏托霉素不能诱导含DMXAA的富血小板血浆发生血小板聚集;10%三氯化铁诱导损伤的肠系膜动脉血栓形成试验显示,DMXAA具有与氯吡格雷相似的抗血栓活性;
本发明进行了小鼠断尾试验,结果显示,DMXAA与体内抗血栓作用相同浓度下的氯吡格雷比较,其出血副作用小。
本发明的实验结果显示,所述DMXAA抗血小板机制不同于已知的抗血小板药物阿司匹林、氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷、西洛他唑及纤维蛋白原受体拮抗剂,其同时具有抑制TXA2生成和TXA2受体拮抗双重活性。
(1)DMXAA对U46619诱导的人血小板聚集的抑制效果研究结果表明,DMXAA浓度依赖性地抑制U46619(1μM)诱导的阿司匹林处理或阿司匹林未处理的人洗涤血小板聚集,其IC50分别为146±33μM和26±6μM(如表1所示),明显低于临床可耐受剂量的血药浓度1.29mM;
(2)DMXAA(300μM)对其它多种激动剂诱导的阿司匹林未处理的人血小板聚集的抑制效果结果表明,300μM 时DMXAA可显著抑制花生四烯酸125μM、ADP10μM、胶原1μg/ml或瑞氏托霉素1.25mg/ml诱导的血小板聚集(如表2所示);
(3)DMXAA体内给药体外抗血小板作用研究结果表明,DMXAA 28mg/kg尾静脉注射给药1h内腹主动脉取血制备富血小板血浆,用U46619(1μM)、花生四烯酸(125μM)、胶原(1μg/ml)或瑞氏托霉素(1.25mg/ml)均不能诱导富血小板血浆产生血小板聚集,用ADP (10μM)能诱导富血小板血浆产生轻微的血小板聚集。对照组富血小板血浆用上述激动剂诱导均能产生聚集(如图3所示);
(4)DMXAA的体内抗血栓效果研究结果表明,在10%三氯化铁诱导的小鼠肠系膜动脉血栓模型中,DMXAA 28mg/kg尾静脉注射给药具有很好的抗血栓效果,显著延长血栓形成时间,给药后形成第一个稳定血栓(直径大于20μM,稳定时间超过2min)所需时间为464±33秒,较对照组所需时间89±16秒明显延长。和氯吡格雷给药组一样,DMXAA给药组的全部13只小鼠损伤的肠系膜动脉均未发生血管完全栓塞(如图4所示);
(5)DMXAA静脉给药后的出血倾向研究结果表明,与氯吡格雷口服有较强的出血倾向相比,DMXAA静脉给药后的出血倾向小;具体为离尾端5mm处剪尾后测量小鼠尾静脉10分钟内出血量,对照组出血量为66±9μL,氯吡格雷30mg/kg灌胃给药出血量为393±49μL,DMXAA28mg/kg尾静脉注射给药出血量为102±19μL。DMXAA给药组引起的出血与对照组相比没有明显差别(P>0.05),显著低于氯吡格雷给药组(P<0.01,如图5所示),显示DMXAA在达到和氯吡格雷相似的体内抗血栓作用时出血副作用很小,比氯吡格雷安全。这一重要的发现也可解释DMXAA临床上不引起出血的现象。
进一步,本发明所述DMXAA可用于制备有效、安全的抗血小板、抗血栓药物,用于预防和治疗动脉血栓性疾病,所述动脉血栓性疾病包括冠心病、中风和周围血管病等。
附图说明
图1显示了DMXAA抑制U46619、花生四烯酸、ADP、胶原诱导的人血小板TXB2生成,其中,
DMXAA、DMSO和indomethacin (吲哚美辛)与处理好的阿司匹林未处理的人洗涤血小板孵育3分钟,然后加入U46619(1μM)、AA(花生四烯酸,125μM)、ADP(10μM)或collagen(胶原,1μg/ml)刺激5分钟,随后终止反应收集上清检测TXB2含量。数据用平均值±标准误表示。与DMSO和激动剂组比较,*P<0.05,**P<0.01。
图2显示了DMXAA使U46619与血小板聚集的量效曲线明显右移,其中,
阿司匹林处理的血小板先与DMXAA或DMSO孵育3分钟,然后加入U46619记录5分钟检测血小板的最大聚集程度;以10μM U46619诱导的最大聚集度作为100%,数据用平均值±标准误表示(n=3)。
图3显示了DMXAA体内给药体外具有较好的抗血小板作用,其中,
C57BL/6J小鼠DMXAA尾静脉注射单次给药(28mg/kg)后,麻醉后1小时内腹主动脉取血;对照组尾静脉注射生理盐水,氯吡格雷组为氯吡格雷30mg/kg灌胃,第一天1次,第2天给药后1小时内麻醉腹主动脉取血;每组分离出富血小板血浆后用U46619(1μM)、花生四烯酸(125μM)、ADP(10μM)、胶原(1μg/ml)或瑞氏托霉素(1.25mg/ml)刺激诱导血小板聚集。
图4.显示了DMXAA抑制10%三氯化铁诱导的C57BL/6J小鼠肠系膜动脉血栓形成,其中,
A)实验分为生理盐水对照组、DMXAA静脉给药组(28mg/kg,单次给药1小时内)、氯吡格雷口服给药组(30mg/kg灌胃,第一天1次,第二天给药后1小时),3组经10%三氯化铁诱导损伤的小鼠肠系膜动脉血栓形成过程中0、5、12.5分钟的代表性截图;血流从左向右流,白色实线表示血管壁;
B)生理盐水对照组、DMXAA、氯吡格雷3组中第一个血栓(>20μm)形成时间、血栓数量(>20μm)、第一个血栓形成2分钟时的平均大小的结果(平均值±标准误)。
图5显示了DMXAA在达到体内抗血栓作用下出血副作用小,其中,
实验分为生理盐水对照组、DMXAA静脉给药组(28mg/kg,单次给药1小时内),氯吡格雷口服给药组(30mg/kg灌胃,第一天1次,第二天给药后1小时);每组C57BL/6J小鼠腹腔注射苯巴比妥(100mg kg-1)麻醉置于加热板上,截断尾部离远端5毫米处,迅速将断尾远端浸入12毫升37℃的生理盐水中,保持10分钟,收集血样保存于-80℃中,复溶后加入红细胞裂解液裂解红细胞,采用比色法测定吸光度(405nm)。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Alan D.Michelson等人,在血小板第二版(New York:Elsevier Press,2007)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,文中所使用试剂来自国药试剂有限公司,百分比和份数按重量计算。
除非另行定义,所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.DMXAA对U46619诱导的人血小板聚集的抑制效果
本实施例的目的是证明DMXAA可抑制U46619诱导的人血小板聚集
本实施例中,制备血小板:血小板来自于签订了知情同意书的健康志愿者,志愿者在取血前20天内未服用阿司匹林、氯吡格雷等任何抗血小板药物;抗凝剂采用ACD(85mmol L-1 sodium citrate,71.38mmol L-1 citric acid,and 27.78mmol L-1glucose);300g离心20分钟得到富血小板血浆,取上清后900g进一步离心10分钟得到血小板,最后用Tyrode’s buffer重悬(138mmol L-1 NaCl,2.7mmol L-1 KCl,2mmol L-1 MgCl2,0.42 mmol L-1 NaH2PO4,5mmol L-1 glucose,10mmol L-1 HEPES,0.2% bovine serum albumin,and 0.02unit mL-1 apyrase,pH 7.4),计数血小板,将血小板数目调整为2.5×108个血小板/ml。
血小板聚集测定:血小板的聚集在血小板聚集仪(Model 400VS,Chrono-Log,Haverston,PA),参数设定:搅拌速度900rpm,温度37℃,在加入激动剂U46619之前,血小板用溶剂或药物预处理3分钟,血小板聚集曲线监测时间为5分钟,聚集率定义以溶剂对照组为100%。
聚集抑制结果如表1所示,DMXAA浓度依赖性抑制1μM U46619(Chrono-Log公司)诱导的阿司匹林处理或未处理的人洗涤血小板聚集,其IC50分别为146±33μM和26±6μM。
表1是DMXAA浓度依赖性抑制U46619诱导的阿司匹林处理或未处理的人洗涤血小板聚集(平均值±标准误)。
表1
实施例2.DMXAA 300μM对其它多种激动剂诱导的人血小板聚集的抑制效果
本实施例的目的是证明DMXAA可抑制花生四烯酸、ADP、胶原或瑞氏托霉素诱导的人血小板聚集。
在本实施例中,血小板的制备和血小板聚集测定方法同实施例1。
结果如表2所示,DMXAA在300μM时明显抑制花生四烯酸、ADP、胶原或瑞氏托霉素(此四种激动剂均购自Chrono-Log公司)诱导的阿司匹林未处理的人血小板聚集。
表2是DMXAA抑制花生四烯酸、ADP、胶原或瑞氏托霉素诱导的阿司匹林未处理的人血小板聚集(平均值±标准误)(n=3)。
表2
实施例3.DMXAA抑制TXA2生成试验
本实施例的目的是为了证明DMXAA可抑制TXA2生成。
在本实施例中,制备未经阿司匹林处理的人洗涤血小板,终浓度调整至2.5×108个/ml,以500μl/管为反应体系,在血小板聚集仪上,加药孵育3分钟,随后加激动剂刺激反应至第8分钟,加入1/6体积的吲哚美辛(0.55mM)和EDTA(22mM)终止反应,迅速置于冰上,12000g4℃离心3分钟去除血小板,所得的上清部分于-80℃保存;由于TXA2极不稳定,很快就转变成TXB2,因此检测TXB2含量来反应TXA2生成;本实施例采用苏州大学医学院血栓室制备的TXB2酶联免疫测定试剂盒检测TXB2含量,具体步骤参照其说明书;结果显示,DMXAA可明显抑制U46619、花生四烯酸、ADP、胶原诱导的人血小板TXA2生成(如图1所示)。
实施例4.DMXAA的TXA2受体拮抗活性试验
本实施例的目的是证明DMXAA具有TXA2受体拮抗活性。
在本实施例中,DMXAA和TXA2受体之间的结合力通过DMXAA对TXA2受体激动剂U46619与血小板聚集的量效曲线的影响间接获得。
试验结果显示,两个浓度的DMXAA(100和300μM)均能使U46619与血小板聚集的量效曲线右移,且呈浓度依赖性,显示DMXAA具有明显的TXA2受体拮抗作用(如图2所示)。
实施例5.DMXAA的体内给药体外抗血小板作用
本实施例的目的是证明DMXAA体内给药体外具有抗血小板作用。
在本实施例中,6到8周龄的小鼠(C57BL/6J)DMXAA尾静脉单次给药(28mg/kg)后,腹腔注射10%水合氯醛(400mgkg-1)麻醉,1小时内腹主动脉取血,6只小鼠1组,分离出富血小板血浆;对照组尾静脉注射生理盐水,其余同DMXAA组。氯吡格雷组为氯吡格雷30mg/kg灌胃,第一天1次,第二天给药后1小时内麻醉腹主动脉取血,其余同DMXAA组;3组富血小板血浆分别用U46619(1μM)、花生四烯酸(125μM)、ADP(10μM)、胶原(1μg/ml)或瑞氏托霉素(1.25mg/ml)刺激诱导血小板聚集。
结果显示,DMXAA明显抑制U46619(1μM)、花生四烯酸(125μM)、胶原(1μg/ml)或瑞氏托霉素(1.25mg/ml)诱导的血小板聚集,轻度抑制ADP(10μM)诱导的血小板聚集(如图3所示)。
实施例6.DMXAA的体内抗血栓效应
本实施例的目的是证明DMXAA具有抗血栓作用。
在本实施例中,体外获取C57BL/6J小鼠血小板,钙绿素标记后通过尾静脉注入C57BL/6J小鼠(6-8周)血液循环系统;苯巴比妥腹腔麻醉后分离出小鼠肠系膜动脉,用10%三氯化铁处理,损伤血管壁诱发血栓,在荧光显微镜(Leica DM5500)下观察血栓形成过程,使用共聚焦扫描显微镜(Leica TCS SPE)实时记录血栓形成影像资料。实验分为生理盐水静脉给药组、DMXAA静脉给药组(28mg/kg,单次给药1小时内麻醉分离出肠系膜动脉),氯吡格雷口服给药组(30mg/kg灌胃,第一天1次,第二天给药后1小时内麻醉分离出肠系膜动脉);每组用10%三氯化铁诱发血栓并记录血栓形成影像资料。
结果显示,对照组5分钟时可见血管小血栓出现,12.5分钟时可见明显大范围血栓将血管阻塞,DMXAA和氯吡格雷给药组5分钟和12.5分钟均仅见小血栓形成,未见大范围血栓形成或血管阻塞;DMXAA给药后形成第一个稳定血栓(直径大于20μM,稳定时间超过2min)所需时间为464±33秒,较对照组所需时间89±16秒明显延长,而氯吡格雷给药组所需时间为558±56秒(如图4所示);结果表明,DMXAA静脉给药显著抑制三氯化铁诱导损伤的体内血栓形成过程,抑制效果类似与氯吡格雷给药组。
实施例7.DMXAA静脉给药后的出血副作用
本实施例的目的是证明DMXAA在达到体内抗血栓作用时出血副作用小。
在本实施例中,6到8周龄的小鼠(C57BL/6J)腹腔注射苯巴比妥(100mg kg-1)麻醉,尾部离远端5毫米处截断,迅速将断尾远端浸入12毫升37℃的生理盐水中,保持10分钟,收集血样保存于-80℃中,复溶后加入红细胞裂解液(155mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA,pH 7.3)裂解红细胞,采用比色法测定吸光度,波长为405纳米,标准曲线为不同稀释度含小鼠血液的生理盐水,根据标准曲线计算出血量;实验分为生理盐水对照组,氯吡格雷口服给药组(30mg/kg灌胃,第一天1次,第2天给药后1小时),DMXAA静脉给药组(28mg/kg,单次给药)。
结果显示,对照组出血量为66±9μL,氯吡格雷30mg/kg灌胃给药出血量为393±49μL,DMXAA 28mg/kg尾静脉注射给药出血量为102±19μL,显示DMXAA发挥体内抗血栓作用时出血副作用小(如图5所示)。
机译: β-D-苯基硫代木糖苷衍生物,包含这些衍生物的治疗剂,该衍生物在制备抗血栓药物中的用途,该衍生物的制备方法以及酰基-β-D-硫代木糖酰卤和酰基氧代羟丙基三氯乙酰亚氨酸酯
机译: 具有相同抗血栓作用的1,2-苯并噻唑啉-3-酮的制备方法及其在制备抗血栓药物中的用途和这些药物组合物在血栓形成中的应用
机译: 肿瘤血管破坏剂多肽,基因,表达载体及其用途