一种测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿有效成分的检测方法

摘要

一种测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿有效成分的检测方法，该方法利用高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用法（HPLC-ESI-MS），对卷烟烟丝及卷烟主流烟气中淫羊藿主要有效成分淫羊藿苷和淫羊藿定c的含量进行检测，依次包括以下步骤：（1）卷烟烟支的挑选和平衡；（2）制备对照品溶液；（3）制备卷烟烟丝样品溶液；（4）制备卷烟主流烟气中样品溶液；（5）对所得待分析样品进行高效液相色谱-电喷雾质谱法（HPLC-ESI-MS）分析。本发明能够将卷烟烟丝及卷烟主流烟气中淫羊藿有效成分进行有效完全的提取，并且能准确测定卷烟烟丝及卷烟主流烟气中淫羊藿有效成分的含量。该方法重复性好，分析检测灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明涉及淫羊藿有效成分的含量检测方法，特别是测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿有效成分含量测定方法，属于烟草检测技术领域。 

背景技术

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.、或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥地上部分，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿之功效。用于阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛。 

随着全球性控烟运动的不断推进，社会公众对于吸烟与健康问题日益关注，有观点认为，在卷烟中加入天然植物的有益成分能够降低卷烟烟气对人体危害，国内部分研究通过在卷烟添加淫羊藿提取物试图降低吸烟引起的危害。中国专利“一种用于卷烟的保润增香添加剂及其制备方法和应用”（CN201210227599.3）和“一种天然植物烟用减害添加剂及其制备方法和应用”（CN201210227591.7）显示，含淫羊藿成分的天然植物萃取液添加于卷烟后可以有效增加卷烟的香气量，改善香气质和协调性，减少杂气与刺激性，增加甜润感，使余味更干净、舒适，整体提升了卷烟的内在品质；与对照卷烟相比可减轻卷烟烟气对人呼吸道上皮细胞的损伤、逆转在动物烟气暴露30天引起的血红蛋白下降，血小板数量增加状况、逆转卷烟烟气引起的动物咳嗽潜伏期降低，咳嗽次数增加等症状、逆转卷烟烟气引起的动物酚红排泌量降低症状，体现一定减轻卷烟烟气危害作用。 

淫羊藿功效与其主要的有效成分密切相关，淫羊藿主要有效成分为淫羊藿苷（Icariin）和淫羊藿定c（Epmedin C），淫羊藿苷具有改善心脑血管功能、调节内分泌及性腺功能、促进成骨细胞的增殖和发育、增强免疫功能、抗肿瘤等多重药理学作用；淫羊藿定c具有显著的抗炎镇痛作用，两种成分既是淫羊藿的主要有效成分，也是其主要质控成分。而这些有效成分的含量较低，尤其是在燃烧之后，这些有效成分可能经热裂解、化学反应等产生变化，卷烟主流烟气中的含量更低。目前天然药物制剂中淫羊藿有效成分的检测方法主要为高效液相色谱法，在烟草行业也有文献报道采用HPLC方法检测添加淫羊藿提取物卷烟主流烟气中的淫羊藿苷，而烟气中淫羊藿定c的检测尚未见报道。液相色谱法可实现两种有效成分含量测定，但灵敏度较低、自身抗干扰能力较弱，在分析低含量样品时，易出现定量不准确或无法定量。高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用法（HPLC-ESI-MS）是当今药物定量分析研究 强有力的工具，具有灵敏度高，专属性好，样品处理简单，分析快速等优点，对检测卷烟烟气中天然植物有效成分具有相当优势。 

发明内容

本发明主要针对液相色谱法在含量低的情况下测定淫羊藿有效成分方面的不足之处，特别是针对尚未有检测卷烟烟气中淫羊藿定c含量报道的情况，提供了一种测定卷烟及主流烟气中淫羊藿主要有效成分含量的方法。该方法能实现卷烟及主流烟气中淫羊藿主要有效成分的快速、准确定量分析。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。 

一种测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿有效成分的检测方法，所述淫羊藿有效成分包括淫羊藿苷和淫羊藿定c，其特征在于：该方法利用高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用法（HPLC-ESI-MS），分别对卷烟烟丝及卷烟主流烟气中淫羊藿苷和淫羊藿定c的含量进行检测，依次包括以下步骤： 

（1）卷烟烟支的挑选和平衡：将卷烟烟支于22℃±1℃和RH60%±2%下平衡48h； 

（2）制备对照品溶液：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加35-75%醇溶液制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；取淫羊藿定C对照品适量，精密称定，加35-75%醇溶液制成每1ml含0.1mg的溶液，即得； 

（3）制备卷烟烟丝样品溶液：取10-20支平衡后样品烟的烟丝，精密称定，精密加入35-75%的醇溶液100-200ml，提取20-60min，用35-75%醇溶液补足重量，摇匀，过0.22um微孔滤膜，即得； 

（4）制备卷烟主流烟气中样品溶液：取平衡后的卷烟，在22℃±2℃和RH60%±5%的环境中和标准条件下，用吸烟机抽吸卷烟样品，用剑桥滤片捕集烟气粒相物，每张滤片捕集20支烟的烟气；吸毕，取出样品烟滤片一份，精密加入35-75%醇溶液30-100ml，提取20-60min，用35-75%醇溶液补足重量，摇匀，过0.22um微孔滤膜，即得； 

（5）对所得待分析样品进行高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用法（HPLC-ESI-MS）分析： 

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈/水=30/70；流速：0.5ml/min；柱温：30℃； 

质谱条件：采用电喷雾（ESI）离子源，负离子模式；喷雾电压：3kV；鞘气压力：30mTorr；辅助气体压力：0；加热毛细管温度：350℃；碰撞能量：15V；源内碰撞诱导解析电压：0；碰撞气压：1.1mTorr；碰撞能量：30V； 

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5-10ul，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。 

本发明所述的一种测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿有效成分的检测方法，其特征在于，上述第（3）和（4）步所述提取过程，可以是超声波提取，也可为震荡提取，或者是浸泡提取。 

本发明所述的一种测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿有效成分的检测方法，其特征在于，上述第（2），（3）和（4）步所述溶解和提取过程所用醇，可以是包括一个，两个或三个碳原子的一元醇或多元醇，优选为甲醇、乙醇、丙二醇、正丙醇、异丙醇或丙三醇。 

本发明所述的一种测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿主效成分的检测方法，其特征在于，上述第（2）、（3）和（4）步所述溶解及提取过程所用醇溶液浓度优选为40-60%，最优为50%。 

本发明所述的一种测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿主效成分的检测方法，其特征在于，上述第（3）步所述加入醇溶液优选为130-160mL，最优为150mL；上述（4）步所述加入醇溶液优选为40-60mL，最优为50mL。 

本发明所述的一种测定卷烟烟丝及其主流烟气中淫羊藿主效成分的检测方法，其特征在于，上述第（3）步所述提取时间优选为25-40分钟，最优为30分钟。 

本发明的优点在于：采用本方法，能够将卷烟烟丝及卷烟主流烟气中淫羊藿有效成分进行有效完全的提取，并且能准确测定卷烟烟丝及卷烟主流烟气中淫羊藿有效成分的含量。该方法重复性好，分析检测灵敏度高，能够实现卷烟烟丝及卷烟主流烟气中淫羊藿化学成分的有效分析，可有效地评价卷烟烟丝添加增香减害添加剂的均匀性和准确性，为卷烟制丝工艺提供技术支持，对提高卷烟产品质量具有重要意义。 

附图说明：

图1淫羊藿苷标准品色谱图； 

图2淫羊藿定c标准品色谱图； 

图3对照卷烟烟丝中淫羊藿苷的检测色谱图； 

图4对照卷烟烟丝中淫羊藿定c的检测色谱图； 

图5样品卷烟烟丝中淫羊藿苷的检测色谱图； 

图6样品卷烟烟丝中淫羊藿定c的检测色谱图； 

图7对照卷烟主流烟气中淫羊藿苷的检测色谱图； 

图8对照卷烟主流烟气中淫羊藿定c的检测色谱图； 

图9样品卷烟主流烟气中淫羊藿苷的检测色谱图； 

图10样品卷烟主流烟气中淫羊藿定c的检测色谱图。 

具体实施方式：

本发明以下将结合实施例作进一步描述，但并不限定本发明的实施范围。 

实施例： 

材料与方法 

1.1实验仪器 

Finnigan TSQ Quantum Discovery Max液相色谱-质谱联用仪（美国Thermo Finnigan公司），配备电喷雾（ESI）离子源检测器；塞多利斯BP110s型电子天平；RM200吸烟机(德国BORGWALDT公司)。 

1.2标准品与样品 

淫羊藿苷和淫羊藿定C购于天津马克生物技术有限公司；某牌号卷烟空白烟丝及添加含淫羊藿复合天然植物提取液的样品烟丝卷制成的对照卷烟及样品卷烟；乙腈为色谱纯（Merck）；水为高纯水；其余试剂均为分析纯。 

烟气滤片：取挑选后的对照卷烟及样品卷烟，于22℃±1℃和RH60%±2%下平衡48h，采用RM200吸烟机按GB/T19609抽吸卷烟样品，用φ92mm剑桥滤片捕集烟气粒相物，每张滤片捕集20支卷烟。 

1.3试验方法 

1.3.1色谱条件 

Agilent Eclipse XDB C18(150mm×2.1mm，5um)；流动相：乙腈/水=30/70；流速：0.5ml/min；柱温：30℃ 

1.3.2质谱条件 

电喷雾（ESI）离子源，负离子模式，喷雾电压：3kV；鞘气压力：30mTorr；辅助气体压力：0；加热毛细管温度：350℃；碰撞能量：15V；源内碰撞诱导解析电压：0；碰撞气压：1.1mTorr；碰撞能量：30V。 

淫羊藿苷：721.01（m/z）--513.26（m/z）；故选择性的检测质荷比（m/z）为513.26的子离子；淫羊藿定C：867.15（m/z）--659.31（m/z），故选择性的检测质荷比（m/z）为659.31的子离子。 

1.3.3溶液配制 

1.3.3.1对照品溶液配制 

分别精确称取淫羊藿苷对照品8.99mg,淫羊藿定C对照品8.57mg，，置于容量瓶中，加50%甲醇溶液，分别配制成质量浓度为35.96ng/ml和171.4ng/ml的对照品溶液。 

1.3.3.2供试品溶液的制备： 

烟丝供试品溶液的制备：取对照卷烟烟丝和样品卷烟烟丝各约10.0g，精密称定，精密加入50%甲醇溶液150ml，超声提取30min，用50%甲醇补足重量，摇匀，过0.22um微孔滤膜，即得。 

滤片供试品溶液的制备：取滤片样品，精密加入50%甲醇溶液50ml，超声提取30min，用50%甲醇补足重量，摇匀，过0.22um微孔滤膜，即得。 

2.结果与分析 

2.1专属性实验 

精确量取对照卷烟烟丝供试品溶液、样品卷烟烟丝供试品溶液、对照卷烟烟气滤片供试品溶液、样品卷烟烟气滤片供试品溶液各10ul，注入液-质联用仪，分别检测513.26和659.31子离子，并与淫羊藿苷和淫羊藿定C标准品图谱进行比对，结果见图1-图10，结果表明对照卷烟烟丝及其烟气滤片对样品卷烟烟丝及其主流烟气的测定没有干扰。 

2.2标准曲线和线性范围 

分别将对照品稀释成系列浓度，分别精密吸取10ul注入液-质联用仪，进行分析，记录色谱图，分别以进样量（ng）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得淫羊藿苷的线性回归方程：y=367.39x-249.49（r=0.9991），线性范围为0.0072-0.539ng；淫羊藿定Ｃ的线性回归方程y=12282x-1161.5（r=0.9992），线性范围为0.0857-1.714ng。 

2.3精密度实验 

取淫羊藿苷和淫羊藿定C对照品溶液各一份，分别连续进样测定6次，测得淫羊藿苷和淫羊藿定C的峰面积的RSD分别为2.5%和3.4%，表明精密度较好，结果见表1。 

表1精密度实验 

2.4稳定性实验 

取样品烟丝约10.0g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备，分别在0，1，2，4，6， 8小时测定，结果淫羊藿苷和淫羊藿定C的峰面积的RSD分别为2.8%和3.8%，结果表明供试品溶液在8小时内稳定，结果见表2。 

表2样品溶液稳定性实验 

2.5重复性实验 

取6份样品烟丝约10.0g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，并进行测定，测得淫羊藿苷和淫羊藿定C的含量的RSD分别为3.6%和3.7%，结果表明方法的重现性较好，结果见表3。 

表3重复性实验 

2.6回收率实验 

取样品烟丝6份，每份约5.0g，精密称定，并分别精密加入浓度为71.92ng/ml的淫羊藿苷对照品溶液20.0ml或浓度为171.4ng/ml的淫羊藿定C对照品溶液15.0ml，再精密补足50%甲醇至150ml后照供试品溶液制备方法制备供试品溶液并进行测定，结果淫羊藿苷和淫羊藿定C的平均回收率（n=6）分别为95.1%和97.3%，RSD分别为3.6%和3.7%，结果见表4-5。 

表4淫羊藿苷回收率实验 

表5淫羊藿定C回收率实验 

2.7样品卷烟烟丝及主流烟气中淫羊藿苷和淫羊藿定c含量测定 

按照上述方法对对照卷烟及样品卷烟烟气及主流烟气滤片进行淫羊藿苷和淫羊藿定C的含量测定，检测图谱见图3-10，结果对照卷烟烟丝和主流烟气中未检出淫羊藿苷和淫羊藿定c；淫羊藿苷和淫羊藿定C在样品烟丝中含量分别为443.68ng/支和844.65ng/支，在主流烟气滤片中分别为15.61ng/支和60.14ng/支，计算淫羊藿定C和淫羊藿苷的转移率分别为3.52%和7.12%。 

2.8溶剂适应性试验 

为验证本发明分析方法的溶剂适应性，按照上述检测方法，更换不同醇作溶剂和提取剂进行试验，分别为乙醇、丙二醇、正丙醇、异丙醇或丙三醇，结果表明，所选用溶剂对试验结果无影响，与甲醇试验结果一致。