用于酶法精制经预处理的纤维素材料以供糖化的工艺

摘要

本发明涉及用于酶法精制经预处理的纤维素材料以供糖化的工艺。

说明书

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式通过提述并 入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及使用一种或多种酯酶酶法精制经预处理的纤维素材料的工 艺。经精制的经预处理的纤维素材料适于糖化。

背景技术

纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水 解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡 糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖 水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二 糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤 维二糖水解成葡萄糖。

将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势： 大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木 材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。 这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将木素纤维素转化成 可发酵的糖例如葡萄糖，所述可发酵的糖容易地由酵母发酵成乙醇。亦可将 糖催化转化或发酵为除了乙醇之外的其它化学品。

将木素纤维素原料转化为糖通常涉及纤维素材料的预处理，接着对其进 行酶水解，然后将糖转化为发酵产物或催化转化的产物。预处理破坏纤维素 材料，因此酶水解可有效地进行。

然而，纤维素材料的预处理可在经预处理的纤维素材料中产生杂质，其 对于纤维素酶具有有害作用，和/或减少或抑制酶水解和/或糖化。

对于本领域，能够改善经预处理的纤维素材料以供糖化是有利的。例如， 在本领域中，通过减少、消除或去除对纤维素酶具有有害作用的杂质如酯而 改善经预处理的纤维素材料如生物质，包括玉米秸秆、刨花、柳枝稷等的酶 水解性能是有利的。

令人感兴趣的现有技术包括WO2009/042622A2，其公开了从含木质材 料产生发酵产物的工艺，其中所述工艺包括下述步骤：i)预处理含木质材料； ii)通过对经预处理的含木质材料施以一种或多种纤维素分解酶进行水解；iii) 使用发酵生物进行发酵，其中在步骤i)中的预处理和/或步骤ii)中的水解和/ 或步骤iii)中的发酵之前和/或之中对所述含木质材料施以一种或多种酯酶。

本发明涉及用于在酶协助下精制经预处理的纤维素材料以供糖化的工 艺。

发明内容

本发明涉及用于酶法精制经预处理的纤维素材料的工艺，其包括：(a)将 经预处理的纤维素材料与酯酶和/或酯酶组合物相接触以形成经精制的经预 处理的纤维素材料。

本发明亦涉及用于酶法精制经预处理的纤维素材料的工艺，其包括：

(a)加工所述经预处理的纤维素材料以形成经预处理的纤维素材料的固/ 液混合物；

(b)从经预处理的纤维素材料的固/液混合物分离出液剂；和

(c)通过阿魏酸酯酶处理来处理所述液剂。在实施方案中，所述酯酶或阿 魏酸酯酶减少和/或消除了有毒的酯，所述酯抑制经预处理的纤维素材料的水 解。

在一个方面，本公开的工艺包括酶和/或酶组合物，其包含一种或多种(几 种)选自下组的酶：酯酶和阿魏酸酯酶。依照本公开使用的合适的阿魏酸酯酶 的非限定性实例包括与SEQ ID NO:133，134，135，136和137的成熟多肽 或其具有阿魏酸酯酶活性的片段(单独的或组合)具有至少70%，80%，90%， 95%，96%，97%，98%，99%序列同一性的酶。

在一个方面，上述工艺进一步包括回收经精制的经预处理的纤维素材料。

在一个方面，上述工艺进一步包括从经预处理的纤维素材料分离出液剂。

在一个方面，上述工艺进一步包括将液剂与阿魏酸酯酶相接触并再循环 所述液剂，从而使得其与纤维素材料、经预处理的纤维素材料和/或经精制的 经预处理的纤维素材料相接触。

在一个方面，上述工艺进一步包括将所述液剂再循环至用所述酶组合物 对经预处理的纤维素材料进行的新的处理中。

在一个方面，上述工艺进一步包括对经酶预处理、化学预处理、机械预 处理和/或物理预处理的经精制的经预处理的纤维素材料进行后处理。

本公开的一个方面涉及用于水解经预处理的纤维素材料的工艺，包括糖 化根据本公开处理和精制的经预处理的纤维素材料。在实施方案中，所述工 艺包括从糖化回收经糖化的经预处理的纤维素材料。在实施方案中，所述经 糖化的纤维素材料是糖如葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。

本公开的一个方面涉及用于产生发酵产物的工艺，其包括：

(a)用适于糖化的酶糖化经预处理的纤维素材料，其中根据本公开将所述 经预处理的纤维素材料与酶包括酯酶和/或阿魏酸酯酶相接触或用所述酶处 理所述经预处理的纤维素材料；

(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的经预处理的纤维素材 料以产生发酵产物；和

(c)从发酵回收发酵产物。在实施方案中，所述酯酶包括一种或多种(几 种)选自下组的酶：依照本公开的酯酶和阿魏酸酯酶。在实施方案中，所述酯 酶包含或组成为(consist of)氨基酸，所述氨基酸与SEQ ID NOS:133，134， 135，136和137的成熟多肽(单独的或组合)，或其具有酯酶活性的片段具有 至少70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，99%序列同一性。在实施 方案中，所述酯酶包含或组成为来自SEQ ID.NO:133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137的氨基酸的成熟多肽或其具 有酶活性如酯酶活性的片段。在实施方案中，所述酶选自下组：FAE(1)， FAE-A，FAE-C，和FAE-D或其具有酶活性的片段。在实施方案中，步骤(a)(用 酶组合物糖化经预处理的纤维素材料，其中根据本公开将所述经预处理的纤 维素材料与酯酶和/或阿魏酸酯酶相接触或用所述酶处理所述经预处理的纤 维素材料)和(b)(用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的经预处理的纤 维素材料以产生发酵产物)在同时糖化和发酵中同时进行。在实施方案中，所 述发酵产物是醇，有机酸，酮，氨基酸，烷烃，环烷烃，烯烃，或气体。用 于糖化的合适的酶/酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆 酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在实施方案中， 所述纤维素是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解 酶和β-葡糖苷酶。在实施方案中，所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自 下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、 木糖苷酶、β-木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

本公开的另一个方面涉及用于发酵经预处理的纤维素材料的工艺，其包 括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经预处理的纤维素材料，其中所述经 预处理的纤维素材料根据本公开用酯酶和/或阿魏酸酯酶或其组合物处理、精 制和/或糖化。在实施方案中，经预处理的纤维素材料的发酵产生发酵产物。 在实施方案中，包括了从发酵回收发酵产物的步骤。在实施方案中，发酵产 物是醇、有机酸、酮、氨基酸、烷烃、环烷烃、烯烃或气体。

在一个实施方案中，所述经预处理的纤维素材料是非木质底物。

本公开涉及用于酶法精制经预处理的纤维素材料的工艺，其包括或组成 为：(a)将经预处理的纤维素材料与一种或多种酯酶相接触以形成经精制的经 预处理的纤维素材料。在实施方案中，所述一种或多种酯酶包含或组成为一 种或多种(几种)选自下组的酶：酯酶和阿魏酸酯酶。在实施方案中，所述酯酶 包含或组成为这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137的成熟多 肽或其具有阿魏酸酯酶活性的片段具有至少70%，80%，90%，95%，96%， 97%，98%，99%序列同一性。在实施方案中，所述酯酶包含或组成为SEQ ID. NO:133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO: 137或其成熟多肽。在实施方案中，所述阿魏酸酯酶是一种或多种(几种)选自 下组的酶：FAE(1)，FAE-A，FAE-C，和FAE-D。在实施方案中，所述工艺 包括或组成为回收经精制的经预处理的纤维素材料。在实施方案中，所述工 艺包括从经预处理的纤维素材料分离出液剂。在实施方案中，所述工艺包括 将液剂与阿魏酸酯酶相接触和再循环所述液剂从而使其与经预处理的纤维素 材料或经精制的经预处理的纤维素材料相接触。在实施方案中，所述工艺包 括将液剂再循环至用酯酶组合物进行的经预处理的纤维素材料的新的预处理 中。在实施方案中，所述工艺包括对经酶预处理、化学预处理、机械预处理 和/或物理预处理的经精制的经预处理的纤维素材料进行后处理。在实施方案 中，所述工艺包括回收经精制的经预处理的纤维素材料。在实施方案中，与 酯酶接触是用约0.0005至约5mg，例如约0.001至约5mg，约0.0025至约5 mg，约0.005至约5mg，约0.005至约4.5mg，约0.005至约4mg，约0.005 至约3.5mg，约0.005至约3mg，约0.005至约2mg，约0.005至约1mg， 约0.075至约1mg，或约0.1至约1mg酯酶每g经预处理的纤维素材料进行 的。在实施方案中，与酯酶接触是以约1%至约50%，例如约2%至约40%， 约2%至约35%，约3%至约30%，约3%至约25%，约4%至约20%，或约 5%至约10%的总固体(TS)进行的。在实施方案中，与酯酶接触是在约2至约 9，例如约3至约7.5，约3.5至约7，约4至约6.5，约4.5至约6.5，约4.5 至约6.0，约5和约6.0，或约5至约5.5的pH进行。在实施方案中，接触在 约20℃至约70℃，例如约25℃至约65℃，约30℃至约65℃，约35℃至约 65℃，约40℃至约60℃，约45℃至约55℃，或约45℃至约50℃范围的温度 进行的。在实施方案中，与酯酶接触进行5分钟至35小时，例如10分钟至 15小时，10小时至15小时，10小时至20小时，10小时至20小时，20小 时至24小时，24小时至30小时，1小时至72小时的时间。

本公开涉及用于酶法精制经预处理的纤维素材料的工艺，其包括：(a)加 工所述经预处理的纤维素材料以形成经预处理的纤维素材料的固/液混合物； (b)从经预处理的纤维素材料的固/液混合物分离出液剂；和(c)通过阿魏酸酯 酶处理来处理所述液剂。在实施方案中，所述工艺包括将经处理的液剂回送 至经预处理的纤维素材料。在实施方案中，所述工艺包括用约0.0005至约5 mg，例如约0.001至约5mg，约0.0025至约5mg，约0.005至约5mg，约 0.005至约4.5mg，约0.005至约4mg，约0.005至约3.5mg，约0.005至约 3mg，约0.005至约2mg，约0.005至约1mg，约0.075至约1mg，或约0.1 至约1mg酯酶每mL液剂进行用阿魏酸酯酶的处理。在实施方案中，用阿魏 酸酯酶处理以约1%至约50%，例如约2%至约40%，约2%至约35%，约3% 至约30%，约3%至约25%，约4%至约20%，或约5%至约10%的总固体(TS) 进行。在实施方案中，用阿魏酸酯酶处理是在约2至约9，例如约3至约7.5， 约3.5至约7，约4至约6.5，约4.5至约6.5，约4.5至约6.0，约5和约6.0， 或约5至约5.5的pH进行的。在实施方案中，用阿魏酸酯酶处理是在约20℃ 至约70℃，例如约25℃至约65℃，约30℃至约65℃，约35℃至约65℃， 约40℃至约60℃，约45℃至约55℃，或约45℃至约50℃范围的温度进行的。 在实施方案中，用阿魏酸酯酶处理进行5分钟至35小时，例如10分钟至15 小时，10小时至15小时，10小时至20小时，10小时至20小时，20小时至 24小时，24小时至30小时，1小时至72小时的时间。

本公开进一步涉及用于水解经预处理的纤维素材料的工艺，其包括用酶 组合物糖化经预处理的纤维素材料，所述纤维素材料经本文中所述的酯酶处 理和精制。在实施方案中，所述工艺包括酯酶，所述酯酶包含或组成为一种 或多种(几种)选自下组的酶：酯酶和阿魏酸酯酶。在实施方案中，所述酯酶包 含或组成为这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136，SEQ ID NO:137的成熟多肽或 其具有阿魏酸酯酶活性的片段具有至少70%，80%，90%，95%，96%，97%， 98%，99%序列同一性。在实施方案中，所述酯酶包含或组成为SEQ ID.NO: 133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136，SEQ ID NO:137 或其成熟多肽。在实施方案中，所述阿魏酸酯酶是一种或多种(几种)选自下组 的酶：FAE(1)，FAE-A，FAE-C，和FAE-D。在实施方案中，所述酶组合物 包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的 GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、 过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在实施方案中，所述纤维素是一种或多种(几 种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在实施方 案中，所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木 聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。 在实施方案中，所述工艺包括从糖化回收经糖化的经预处理的纤维素材料。 在实施方案中，所述经糖化的纤维素材料是糖。在实施方案中，所述糖选自 下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。

本公开涉及用于产生发酵产物的工艺，其包括或组成为：(a)用酶组合物 糖化经预处理的纤维素材料，其中使所述经预处理的纤维素材料与根据本公 开的酯酶接触或用所述酶处理所述材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物 发酵经糖化的经预处理的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵 产物。在实施方案中，所述酯酶包含或组成为一种或多种(几种)选自下组的酶： 酯酶和阿魏酸酯酶。在实施方案中，所述酯酶组合物包含或组成为这样的氨 基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO: 135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137的成熟多肽或其具有阿魏酸酯酶活 性的片段具有至少70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，99%序列同 一性。在实施方案中，所述酯酶组合物由SEQ ID.NO:133，SEQ ID NO:134， SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137或其成熟多肽组成。在 实施方案中，所述阿魏酸酯酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：FAE(1)， FAE-A，FAE-C，和FAE-D。在实施方案中，所述阿魏酸酯酶是FAE(1)。在 实施方案中，所述阿魏酸酯酶是FAE-A。在实施方案中，所述阿魏酸酯酶是 FAE-C。在实施方案中，所述阿魏酸酯酶是FAE-D。在实施方案中，所述酶 组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强 活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、 果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在实施方案中，所述纤维素是一种 或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。 在实施方案中，所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、 乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖 苷酶。在实施方案中，步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。在实施方 案中，所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、烷烃、环烷烃、烯烃或气 体。

本公开涉及用于发酵经预处理的纤维素材料的工艺，其包括用一种或多 种(几种)发酵微生物发酵经预处理的纤维素材料，其中依照本公开处理、精制 和/或糖化经预处理的纤维素材料。在实施方案中，发酵经预处理的纤维素材 料产生发酵产物。在实施方案中，所述工艺包括从发酵回收发酵产物。在实 施方案中，所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、烷烃、环烷烃、烯烃 或气体。

定义

纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种 或多种(几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解 酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1) 测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤 维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances24:452-481所 综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括 Whatman1号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处 理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman1号 滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and  Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities, Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。

就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解 酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的 PCS中纤维素在50℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相 比较。典型的条件为：1ml反应，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固体， 50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO₄，50℃，72小时，通过HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4- 葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤 维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin) 中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和 含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切 葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006, Biotechnology Advances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言， 根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃使 用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水 解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维 素寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解， 从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose  degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trends in  Biotechnology15:160-167;Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就 本发明而言，根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh 等,1982,FEBS Letters149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS  Letters187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述 的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，可采用Lever等的方法来评 估玉米秸秆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用于 确定对荧光二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷 (4-methylumbelliferyl-β-D-lactoside)的纤维二糖水解酶活性。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶 (beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡 萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi  等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum:production,purification and some biochemical properties,J.Basic  Microbiol.42:55-66所述的基本方法确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在 25℃,pH4.8，在含有0.01%20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的 1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离 子。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多 肽”意指GH61多肽，其催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的 增强。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维 素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强 活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤 维素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽 的蛋白质，在50℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增 强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在 一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶 (如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下 的1.5L(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)的混合物作为 纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需 的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的 水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优 选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优 选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，且最优选至少20倍。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61” 意指根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on  amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.,和 Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl  hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖基水解酶家族61的多肽。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意 指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和 Shoham,Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology,2003,6(3): 219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包 括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃 糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸 酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤 维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中 的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附接于木 质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式 需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的 糖基水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化 模块，基于其一级结构的同源性，可指派为以数字标识的GH和CE家族。一 些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例 如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在 Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据 Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752进行测量。

木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分 解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测量木聚糖分解活性的基 础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例 如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰 木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在 木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of the  Science of Food和Agriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006, Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum  commune,FEBS Letters580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova, Hirsch,Biely和Kubicek,1997,The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a  multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。

总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测 量，所述木聚糖包括例如燕麦斯佩耳特小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood) 和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木 聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法 基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen, 1992,Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity,Journal of  Biotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可在37℃在0.01% X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中用0.2%AZCL-阿拉伯木聚 糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM 磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0 微摩尔天青精。

就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常 条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解 的增加来确定的：1ml反应，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白 质/g底物，50mM乙酸钠，pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reaction  for colorimetric determination of carbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述 使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶 (1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的 内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是在37℃在0.01%X-100和 200mM磷酸钠缓冲液pH6中使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。 一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液 中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xyloside xylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短的β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide) 的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的 β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5在含有0.01%20的100mM柠檬 酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0μmol对硝 基苯酚阴离子。

酯酶：术语“酯酶“意指在用水进行的，称为水解的化学反应中，将酯分 解为酸和醇的水解酶。该术语亦指称作羧酸酯水解酶的酶，这表明酶作用于 酯键，并包括根据Enzyme Nomenclature(可在 http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme或分别从Enzyme Nomenclature  1992，Academic Press，San Diego，California，with Supplement1(1993)， Supplement2(1994)，Supplement3(1995)，Supplement4(1997)和Supplement  5，in Eur.J.Biochem.1994，223，1-5;Eur.J.Biochem.1995，232，1-6;Eur.J. Biochem.1996，237，1-5;Eur.J.Biochem.1997，250;1-6，和Eur.J.Biochem. 1999，264，610-650获得)归类于EC3.1.1羧酸酯水解酶的酶。酯酶的非限定 性实例包括羧酯酶、芳基酯酶、甘油三酯脂肪酶、乙酰酯酶、乙酰胆碱酯酶、 胆碱酯酶、托品酯酶(tropinesterase)、果胶酯酶(pectinesterase)、甾醇酯酶(sterol esterase)、叶绿素酶、L-阿拉伯糖酸内酯酶(L-arabinonolactonase)，葡糖酸内 酯酶(gluconolactonase)、尿内酯酶活性(uronolactonase)、鞣酸酶、视黄酰棕榈 酸酯酶(retinyl-palmitate esterase)、羟基丁酸二聚体水解酶 (hydroxybutyrate-dimer hydrolase)、酰基甘油脂肪酶(acylglycerol lipase)、3-氧 代己二酸烯醇内酯酶(3-oxoadipate enol-lactonase)、1,4-内酯酶、半乳糖脂肪酶 (galactolipase)、4-吡哆醇内酯酶(4-pyridoxolactonase)、酰基肉毒碱水解酶 (acylcarnitine hydrolase)、氨基酰基-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖酸内酯酶 (D-arabinonolactonase)、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷脂酶A1、6-酰基葡萄糖脱乙 酰酶(6-acetylglucose deacetylase)、脂蛋白脂肪酶、二氢香豆素脂肪酶 (dihydrocoumarin lipase)、柠檬素D环内酯酶(limonin-D-ring-lactonase)、类固 醇内酯酶(steroid-lactonase)、三乙酸内酯酶(triacetate-lactonase)、放线菌素内 酯酶(ctinomycin lactonase)、苔色酸缩酚酸水解酶(orsellinate-depside hydrolase)、头孢菌素C脱乙酰酶(cephalosporin-C deacetylase)、氯原酸水解酶 (chlorogenate hydrolase)、α-氨基酸酯酶、4-甲基草酰乙酸酯酶、羧甲烯丁烯羟 酸内酯酶(carboxymethylenebutenolidase)、脱氧柠檬酸A环内酯酶 (deoxylimonate A-ring-lactonase)、2-乙酰基-1-烷基甘油磷酸胆碱酯酶 (2-acetyl-1-alkylglycerophosphocholine esterase)、镰孢氨酸-C鸟氨酸酯酶 (fusarinine-C ornithinesterase)、芥子碱酯酶(sinapine esterase)、蜡酯水解酶 (wax-ester hydrolase)、大戟二萜醇酯水解酶(phorbol-diester hydrolase)、磷酯酰 肌醇脱酰酶(phosphatidylinositol deacylase)、唾液酸O-乙酰酯酶(sialate  O-acetylesterase)、乙酰氧丁炔基二噻吩脱乙酰酶(acetoxybutynylbithiophene  deacetylase)、乙酰水杨酸脱乙酰酶(acetylsalicylate deacetylase)、甲基伞形酮乙 酸脱乙酰酶(methylumbelliferyl-acetate deacetylase)、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯 酶(2-pyrone-4,6-dicarboxylate lactonase)、N乙酰半乳糖胺聚糖脱乙酰酶 (N-acetylgalactosaminoglycan deacetylase)、保幼激素酯酶(juvenile-hormone  esterase)、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯酶(bis(2-ethylhexyl)phthalate esterase)、 蛋白质-谷氨酸甲基酯酶(protein-glutamate methylesterase)、11-顺-视黄酰棕榈 酸水解酶(11-cis-retinyl-palmitate hydrolase)、全反视黄酰棕榈酸水解酶 (all-trans-retinyl-palmitate hydrolase)、L-鼠李糖酸-1,4-内酯酶 (L-rhamnono-1,4-lactonase)、5-(3,4-二乙酰氧丁-1-炔基)-2,2’-二噻吩脱乙酰酶 (5-(3,4-diacetoxybut-1-ynyI)-2,2'-bithiophene deacetylase)、脂肪酰乙基酯合酶 (fatty-acyl-ethyl-ester synthase)、木糖酸-1,4-内酯酶(xylono-1,4-lactonase)、N- 乙酰葡糖胺基磷酯酰肌醇脱乙酰酶(N-acetylglucosaminylphosphatidylinositol  deacetylase)、西曲酸苄基酯酶(cetraxate benzylesterase)、乙酰基烷基甘油乙酰 水解酶(acetylalkylglycerol acetylhydrolase)和乙酰木聚糖酯酶。酯酶的非限定 性实例包括根据Enzyme Nomenclature(可从具有地址 www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme的网站获得)归类为EC3.1.1.1至EC 3.1.1.85(含)的羧酸酯水解酶。酯酶具有广泛的特异性；并可水解维生素A酯。 酯酶亦可来自微粒体，其亦催化EC3.1.1.2，EC3.1.1.5，EC3.1.1.6，EC 3.1.1.23，EC3.1.1.28，EC3.1.2.2，EC3.5.1.4，和EC3.5.1.13的反应。

乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)， 其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯 (alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发 明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEEN^TM20的50mM乙酸 钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木 聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子 (p-nitrophenolate anion)的酶量。

阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉 桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯 化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3- 甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉 桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。 下文给出了用来依照本公开使用的阿魏酸酯酶的非限定性实例。平[]就本发明 而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝 基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分 钟释放出1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。

α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛 酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化 α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷 酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α- 葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放出1μmol葡糖醛酸或4-O- 甲基葡糖醛酸的酶量。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋 喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非 还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有 (1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作 用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉 伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋 喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L- 阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH5 中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd., Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分 析来确定的。

纤维素材料：术语“纤维素材料”可为包含纤维素的任何材料。生物质的 初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维 素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生， 其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是 脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括 多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖， 具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的 纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其 它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。来自死亡植物的细胞亦可 称作纤维或纤维素纤维。细胞壁分为层，其由纤维、半纤维素和木质素装配 成。纤维主要由纤维素构成，含有少量的半纤维素和木质素。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木 材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、 城市固体废物、废纸、和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等,1995, 于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis, Washington D.C.;Wyman,1994,Bioresource Technology50:3-16;Lynd,1990, Applied Biochemistry and Biotechnology24/25:695-719;Mosier等,,1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40, Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的 木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材 料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素。

在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农 业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维 素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面， 纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。

在另一个方面，纤维素材料是硬木。在另一个方面，纤维素材料是硬木 刨花。在另一个方面，纤维素材料是硬木浆。在另一个方面，纤维素材料是 软木。在另一个方面，纤维素材料是软木刨花。在另一个方面，纤维素材料 是软木浆。

在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂的副产品。在另一个方面， 纤维素材料是纸浆和造纸厂的原始纤维副产品。在另一个方面，纤维素材料 是纸浆和造纸厂的回收副产品。

在另一个方面，纤维素材料是含纤维素纤维。在另一个方面，纤维素材 料是含纤维素纤维材料。

在在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料 是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维 素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素 材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方 面，纤维素材料是芒草属。另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。

在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料 是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面， 纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是无定形的、 磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。

纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，使用本领域已知的常规 方法，如本文所述。在一个优选的方面，纤维素材料经过预处理。

纤维素材料可在其产生的任何阶段至少干燥一次，然后进行酶协助的精 制工艺。纤维素材料可在进行酶协助的精制工艺之前从未干燥过。

经预处理的纤维素材料：术语经预处理的纤维素材料意指任何经处理以 预备进一步加工的纤维素材料。经预处理的纤维素材料的非限定性实例包括 用一种或多种化学、酶法、机械或物理预处理步骤步骤处理以预备酶水解的 纤维素材料。

经预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“经预处理的玉米秸秆”意指通过用热 和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。

分离的或纯化的：术语“分离的”或“纯化的”意指从与其天然结合的至少一 个组分移出的多肽或多核苷酸，举例而言，如通过SDS-PAGE确定的，多肽可 为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少 60%纯，至少80%纯，至少90%纯，或至少95%纯；而如通过琼脂糖电泳确定 的，多核苷酸可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至 少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，或至少95%纯。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最 终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸 化等。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种 不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端)的混合物。成熟多肽可使用 SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)来预测。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有 生物活性活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽编码序列可使用SignalP程 序(Nielsen等,1997,见上)来预测。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸 序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS 软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice 等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0或更高版本的Needle程序中 所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48: 443-453)来确定。使用的任选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口 延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS 版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使 用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS 软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice 等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的 Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的 任选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4 的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用 -nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

多肽片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失一个 或多个(几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物活性。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或 3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有生物 活性的片段。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的 基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可 导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以 编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编 码的多肽。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。 编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其 它起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA 结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞或原核细胞的 成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相 应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA 的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA 出现。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自 天然存在的基因或其受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的 方式含有核酸的区段，或其为合成的。当核酸构建体包含本发明的编码序列 表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码多肽的多核苷酸 表达是必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是 天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调 控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号 肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终 止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特 异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列 置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的 表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、 转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码 多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的其它核苷酸可操作 地连接。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用 包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的 (susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发 生的突变而不与亲本细胞完全相同。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含一个或多个(几个)氨 基酸残基的改变，即取代、插入和/或缺失的的多肽。取代意指将占据某位置 的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入 意指在邻接某位置的氨基酸之后添加一个或多个(几个)氨基酸，例如1至5 个氨基酸。

酯：术语“酯“指具有--C(O)O--，--C(O)O—R_j，--R_kC(O)O--R_j--，或 --R_kC(O)O--结构的基团，其中O并不结合于氢，且R_j和R_k可独立地选自烷 氧基，芳氧基，烷基，烯基，炔基，酰胺基，氨基，芳基，芳烷基，环烷基， 醚，甲酰基，卤代烷基，卤素，杂芳基，杂环基，酮，磷酸酯，硫醚基，亚 磺酰基，磺酰基，磺酸和硫酮。R_k可为氢，但R_j不可为氢。所述酯可为环状 的，例如碳原子和R_j，氧原子和和R_k，或R_j和R_k可连接形成3-至12-元环。 示例性酯包括但不限于烷基酯，其中R_j或R_k至少一个是烷基，如烷基 -C(O)--O--，--C(O)--O-烷基-，-烷基-C(O)--O-烷基-等。示例性酯亦包括芳基 或杂芳基酯，例如其中R R_j或R_k至少一个是杂芳基基团如吡啶、哒嗪、嘧啶 和吡嗪，如烟酸酯。示例性酯亦包括具有--R_k C(O)O--结构的反酯(reverse  ester)，其中氧结合于母体分子基团。示例性反酯包括琥珀酸酯、D-精氨酸酯、 L-精氨酸酯、L-赖氨酸酯和D-赖氨酸酯。酯亦包括羧酸酐和酰卤。

烷氧基：术语“烷氧基”如用于本文中指附于氧的烷基基团(--O-烷基-)。“烷 氧基”基团亦包括附于氧的烯基基团(“烯氧基”)或附于氧的炔基基团(“炔氧 基”)。示例性烷氧基基团包括但不限于具有1-22，1-8或1-6个碳原子的烷基， 烯基或炔基基团的基团，在本文中分别称作(C₁-C₂₂)烷氧基，(C₁-C₈)烷氧基， 和(C₁-C₆)烷氧基。示例性烷氧基基团包括但不限于甲氧基、乙氧基等。

芳氧基：如用于本文中指附于氧原子的芳基基团。示例性芳氧基基团包 括但不限于具有单环芳环系统的芳氧基，其中所述环包含6个碳原子，在本 文中称作“(C₆)芳氧基”。

烷基：术语“烷基”如用于本文中指饱和的直链或支化的烃，如1-22，1-8 或1-6个碳原子的的直链或支化基团，在本文中分别称作(C₁-C₂₂)烷基，(C₁-C₈) 烷基，和(C₁-C₆)烷基。示例性烷基基团包括但不限于甲基，乙基，丙基，异 丙基，2-甲基-1-丙基，2-甲基-2-丙基，2-甲基-1-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲 基-3-丁基，2,2-二甲基-1-丙基，2-甲基-1-戊基，3-甲基-1-戊基，4-甲基-1-戊 基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，2,2-二甲基-1-丁基，3,3- 二甲基-1-丁基，2-乙基-1-丁基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新 戊基，己基，庚基，辛基等。

烯基：术语“烯基”如用于本文中指具有至少一个碳碳双键的不饱和直链 或支化的烃，如2-22，2-8，或2-6个碳原子的直链或支化基团，在本文中分 别称作(C₁-C₂₂)烯基，(C₂-C₈)烯基，和(C₂-C₆)烯基。示例性烯基基团包括但不 限于乙烯基，烯丙基，丁烯基，戊烯基，己烯基，丁二烯基，戊二烯基，己 二烯基，2-乙基己烯基，2-丙基-2-丁烯基，4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基等。

炔基：术语“炔基”如用于本文中指具有至少一个碳碳三键的不饱和直链 或支化的烃，如2-22，2-8，或2-6个碳原子的直链或支化基团，在本文中分 别称作(C₂-C₂₂)炔基，(C₂-C₈)炔基，和(C₂-C₆)炔基。示例性炔基基团包括但不 限于乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔基，甲基丙炔基，4-甲基-1-丁 炔基，4-丙基-2-戊炔基，和4-丁基-2-己炔基等。

酰胺基：术语“酰胺基”如用于本文指--R_aC(O)N(R_b)--，--R_aC(O)N(R_b)R_c--， 或--C(O)NR_bR_c形式的基团，其中R_b和R_c各自独自选自烷氧基，芳氧基，烷 基，烯基，炔基，酰胺基，氨基，芳基，芳烷基，氨基甲酸酯，羧基，氰基， 环烷基，酯，醚，甲酰基，卤素，卤代烷基，杂芳基，杂环基，氢，羟基， 酮，硝基，磷酸酯，硫醚基，亚磺酰基，磺酰基，磺酸，磺胺基(sulfonamide) 和硫酮。酰胺基可通过碳，氮，R_b，R_c，或R_a附于其它基团。酰胺基亦可为 环状，例如R_b和R_c，R_a和R_b，或R_a和R_c可连接形成3-至12-元环，如3- 至10-元环或5-至6-元环。术语“酰胺基”涵盖下述基团如磺胺基，脲，氨基甲 酸酯，氨基甲酸，及其环状型式。术语“酰胺基”亦涵盖附于羧基基团的酰胺 基，如-酰胺基-COOH，或盐如-酰胺基-COONa等，附于羧基的氨基基团，例 如-氨基-COOH，或盐如-氨基-COONa等。

氨基：术语“胺”或“氨基”在本文中用于指--N R_d R_e，--N(R_d)R_e--，或--R_eN(R_d)R_f--形式的基团，其中R_d，R_e，和R_f独立选自烷氧基，芳氧基，烷基， 烯基，炔基，酰胺基，氨基，芳基，芳烷基，氨基甲酸酯，羧基，氰基，环 烷基，酯，醚，甲酰基，卤素，卤代烷基，杂芳基，杂环基，氢，羟基，酮， 硝基，磷酸酯，硫醚基，亚磺酰基，磺酰基，磺酸，磺胺基和硫酮。氨基可 通过氮，，R_d，R_e或R_f附于母体分子基团。所述氨基亦可为环状的，例如R_a， R_b，和R_c的任意两个可连接在一起或与N连接形成3-至12-元环，例如吗啉 代或哌啶基。术语氨基亦包括任何氨基基团对应的季铵盐，例如 --[N(R_d)(R_e)(R_f)]⁺。示例性氨基基团包括氨基烷基基团，其中R_d，R_e，或R_f至少一个是烷基基团。

芳基：术语“芳基”如用于本文中指单、双或其它多碳环芳环系统。芳基 基团可任选地稠合于一个或多个选自下组的环：芳基，环烷基，和杂环基。 本发明的芳基基团可用选自下组的基团取代：烷氧基，芳氧基，烷基，烯基， 炔基，酰胺基，氨基，芳基，芳烷基，氨基甲酸酯，羧基，氰基，环烷基， 酯，醚，甲酰基，卤素，卤代烷基，杂芳基，杂环基，羟基，酮，硝基，磷 酸酯，硫醚基，亚磺酰基，磺酰基，磺酸，磺胺基和硫酮。示例性芳基基团 包括但不限于苯基，甲苯基，蒽基，芴基，茚基，薁基，和萘基，以及苯并 稠合碳环模块如5,6,7,8-四氢萘基。示例性芳基基团亦包括但不限于单环芳环 系统，其中所述环包含6个碳原子，在本文中称作“(C₆)芳基”。

芳烷基：术语“芳烷基”如用于本文中指具有至少一个烷基取代基的芳基 基团，例如-芳基-烷基-。示例性芳烷基基团包括但不限于具有单环芳环系统 的芳烷基，其中所述环包含6个碳原子，在本文中称作“(C₆)芳烷基”。

环烷基：术语“环烷基”如用于本文中指3-12个碳，或3-8个碳的一价饱 和/或不饱和环状，双环或桥联双环烃基基团，在本文中称作“(C₃-C₈)环烷基”， 其衍生自环烷烃。示例性环烷基基团包括但不限于环己烷，环己烯，环戊烷， 和环戊烯。环烷基基团可由烷氧基，芳氧基，烷基，烯基，炔基，酰胺基， 氨基，芳基，芳烷基，氨基甲酸酯，羧基，氰基，环烷基，酯，醚，甲酰基， 卤素，卤代烷基，杂芳基，杂环基，羟基，酮，硝基，磷酸酯，硫醚基，亚 磺酰基，磺酰基，磺酸，磺胺基和硫酮取代。环烷基基团可稠合于其它环烷 基，芳基，或杂芳基基团。

醚：术语“醚”至具有–R₁O--R_m--结构的基团，其中R₁和R_m可独立地为烷 基，烯基，炔基，芳基，环烷基，杂环基，或醚。醚可通过R₁或R_m附于母 体分子基团。示例性醚包括但不限于烷氧基烷基和烷氧基芳基基团。醚亦包 括多醚，例如其中R₁和R_m之一或两者是醚。

醛基或甲酰基：术语“醛基”或“甲酰基”如用于本文中指基团-CHO。

卤代烷基：术语“卤代烷基”如用于本文中指用一个或多个卤素原子取代 的烷基基团。“卤代烷基”亦涵盖用一个或多个卤素原子取代的烯基或炔基基 团。

卤素：术语“卤”或“卤素”或“Hal”如用于本文中指F，Cl，Br，或I。

杂芳基：术语“杂芳基”如用于本文中指含有一个或多个杂原子，例如1 至3个杂原子如氮，氧和硫的单、双或多环芳环系统。杂芳基可用一个或多 个下组的取代基取代：烷氧基，芳氧基，烷基，烯基，炔基，酰胺基，氨基， 芳基，芳烷基，氨基甲酸酯，羧基，氰基，环烷基，酯，醚，甲酰基，卤素， 卤代烷基，杂芳基，杂环基，羟基，酮，硝基，磷酸酯，硫醚基，亚磺酰基， 磺酰基，磺酸，磺胺基和硫酮。杂芳基亦可稠合于非芳环。杂芳基基团的说 明性实例包括但不限于吡啶基，哒嗪基，嘧啶基(pyrimidyl)，吡唑基(pyrazyl)， 三嗪基，吡咯基，吡唑基(pyrazolyl)，咪唑基，(1,2,3,)-和(1,2,4)-三唑基，吡嗪 基，嘧啶基(pyrimidilyl)，四唑基，呋喃基，噻吩基，异噁唑基，噻唑基，呋 喃基，苯基，异噁唑基，和噁唑基。示例性杂芳基基团包括但不限于单环芳 环，其中所述环包含2至5个碳原子和1至3个杂原子，在本文中称作“(C₂-C₅) 杂芳基”。

杂环基：术语“杂环”，“杂环基”，或“杂环的”如用于本文中指含有一个、 两个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的饱和/或不饱和3-，4-，5-，6-或 7-元环。杂环可为芳性(杂芳基)或非芳性的。杂环可用一种或多种下述取代基 取代：烷氧基，芳氧基，烷基，烯基，炔基，酰胺基，氨基，芳基，芳烷基， 氨基甲酸酯，羧基，氰基，环烷基，酯，醚，甲酰基，卤素，卤代烷基，杂 芳基，杂环基，羟基，酮，硝基，磷酸酯，硫醚基，亚磺酰基，磺酰基，磺 酸，磺胺基和硫酮。

酮：术语“酮”如用于本文中指具有--C(O)--R_n结构的基团，如乙酰基， --C(O)CH₃)或--R_n--C(O)—R_o--。酮可通过R_n或R_o附于另一个基团。R_n或 R_o可为烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环基或芳基，或R_n或R_o可连接形成 3-至12-元环。

磷酸酯：术语“磷酸酯”如用于本文中指具有--OP(O)O₂--，--R_xOP(O)O₂--， --OP(O)O₂R_y--，或--R_xOP(O)O₂R_y--结构的基团，其中Rx和R_y可为烷基，烯 基，炔基，烷氧基，酰胺基，氨基，芳基，芳氧基，羧基，氰基，环烷基， 酯，醚，卤素，杂环基，氢，羟基，酮，硝基，磺酸，磺酰基，和硫代。

硫醚基：术语“硫醚基”如用于本文中指具有R_zS--结构的基团，其中R_z可为烷氧基，芳氧基，烷基，烯基，炔基，酰胺基，氨基，芳基，芳烷基， 氨基甲酸酯，羧基，环烷基，酯，醚，甲酰基，卤代烷基，杂芳基，杂环基， 和酮。术语“烷基硫醚基”如用于本文中指附于硫原子的烷基基团。

亚磺酰基：术语“亚磺酰基”如用于本文中指具有--S(O)O--，--R_p(O)O--， --R_pS(O)OR_q--，或--S(O)OR_q--结构的基团，其中R_p和R_s可为烷氧基，芳氧基， 烷基，烯基，炔基，酰胺基，氨基，芳基，芳烷基，环烷基，酯，醚，甲酰 基，卤素，卤代烷基，杂芳基，杂环基，羟基，酮，硝基，磷酸酯，硫醚基， 磺酰基，磺酸，磺胺基和硫酮。示例性亚磺酰基基团包括但不限于烷基亚磺 酰基，其中R_p或R_q至少一个是烷基，烯基或炔基。

磺酰基：术语“磺酰基”如用于本文中指具有R_uSO₂--结构的基团，其中 R_u可为烷基，烯基，炔基，氨基，酰胺基，芳基，环烷基，和杂环基，例如 烷基磺酰基。术语“烷基磺酰基”如用于本文中指附于磺酰基基团的烷基基团。 “烷基磺酰基”基团可任选地含有烯基或炔基基团。

磺酸：术语“磺酸”指--SO₃H--基团及其对应的盐，例如–SO₃K--，--SO₃Na--。

硫酮：术语“硫酮”指具有--R_v--C(S)--R_w--结构的基团。酮可通过R_v或R_w附于另一个基团。R_v或R_w可为烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环基或芳基， 或R_v或R_w可连接形成3-至12-元环。

羟基(Hydroxy和hydroxyl)：术语“羟基”如用于本文中指--OH基团。

饱和和不饱和烃：“烷基”，“烯基”和“炔基”基团，统称作“饱和和不饱和 烃”，可用至少一个选自下组的基团取代或分隔：烷氧基，芳氧基，烷基，烯 基，炔基，酰胺基，氨基，芳基，芳烷基，氨基甲酸酯，羧基，氰基，环烷 基，酯，醚，甲酰基，卤素，卤代烷基，杂芳基，杂环基，羟基，酮，硝基， 磷酸酯，硫醚基，亚磺酰基，磺酰基，磺酸，磺胺基，硫酮，和N。

发明详述

本发明涉及用于酶法精制经预处理的纤维素材料的工艺，其包括：(a)将 经预处理的纤维素材料与酯酶和/或酯酶组合物相接触以形成经精制的经预 处理的纤维素材料。在实施方案中，优选的酯酶或酯酶酶组合物是阿魏酸酯 酶和/或阿魏酸酯酶组合物。

本发明亦涉及用于酶法精制经预处理的纤维素材料的工艺，其包括：

(a)加工所述经预处理的纤维素材料以形成经预处理的纤维素材料的固/ 液混合物；

(b)从经预处理的纤维素材料的固/液混合物分离出液剂；和

(c)通过阿魏酸酯酶处理来处理所述液剂。

在一个方面，本公开的工艺包括酶和/或酶组合物，其包含一种或多种选 自下组的酶：酯酶和阿魏酸酯酶。合适的阿魏酸酯酶的非限定性实例包括与 SEQ ID NO:133，134，135，136和137的成熟多肽或其具有阿魏酸酯酶活性 的片段具有至少70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，99%序列同一 性的酶。合适的阿魏酸酯酶的非限定性实例包括具有氨基酸的酶，所述氨基 酸包含或组成为SEQ ID NOS:133，134，135，136或137的成熟多肽或其具 有阿魏酸酯酶活性的片段。

本公开的一个方面涉及用于水解经预处理的纤维素材料的工艺，包括用 含有酯酶和/或阿魏酸酯酶的酶或酶组合物糖化根据本公开处理和精制的经 预处理的纤维素材料。在实施方案中，所述工艺包括从糖化回收经糖化的经 预处理的纤维素材料。在实施方案中，所述经糖化的纤维素材料是糖如葡萄 糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。

本公开的一个方面涉及用于产生发酵产物的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化经预处理的纤维素材料，其中所述经预处理的纤维素 材料是根据本公开用酯酶和/或阿魏酸酯酶处理和精制的；

(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的经预处理的纤维素材 料以产生发酵产物；和

(c)从发酵回收发酵产物。在实施方案中，所述酶组合物包含一种或多种 (几种)选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半 纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、 蛋白酶和膨胀素。在实施方案中，所述纤维素是一种或多种(几种)选自下组的 酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在实施方案中，所述半 纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿 魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

本公开的另一个方面涉及用于发酵经预处理的纤维素材料的工艺，其包 括用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经预处理的纤维素材料，其中依照本公 开用酯酶和/或阿魏酸酯酶处理、精制和/或糖化经预处理的纤维素材料。在实 施方案中，发酵经预处理的纤维素材料产生发酵产物。在实施方案中，包括 从发酵回收发酵产物的步骤。在实施方案中，发酵产物是醇、有机酸、酮、 氨基酸、烷烃、环烷烃、烯烃或气体。

纤维素材料的预处理

适于依照本公开使用的纤维素材料用本领域已知的任何合适方法预处 理。在实施方案中，在水解和发酵之前，可根据本公开预处理纤维素材料和/ 或含木素纤维素材料。预处理的目标是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/ 或木质素，这样会改善酶促水解的速率。

不拘于本公开，认为常规预处理在经预处理的纤维素材料中产生杂质， 并对纤维素酶和/或酶水解具有有害作用。对于纤维素酶的杂质或毒素的非限 定性实例包括经预处理的纤维素材料中的一种或多种酯。本公开提供了用于 加工经预处理的纤维素材料以改善经预处理的纤维素材料的水解的工艺。

纤维素材料的预处理指任何本领域中已知的常规预处理步骤。预处理可 在水性浆料中进行，或可直接施用于天然形式(raw form)的纤维素材料。在实 施方案中，含木素纤维素材料可以以预处理反应物的总重量的10-80wt.%， 例如20-50wt.%的量存在。

化学、机械和/或生物预处理

根据本公开的纤维素材料的预处理的非限定性实例包括在水解和/或发 酵之前化学、机械和/或生物预处理纤维素材料。机械预处理(通常称作物理预 处理)可单独使用或与后续或同时的水解特别是酶促水解组合使用，以促进纤 维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

在实施方案中，所述化学、机械和/或生物预处理在水解和/或发酵之前进行。 或者，所述化学、机械和/或生物预处理与水解同时进行，如同时添加一种或多 种纤维素分解酶或下文提及的其他酶活性，以释放可发酵的糖如葡萄糖和/或麦 芽糖。

在本公开的一个实施方案中，依照本公开在水解步骤之前、之中或之后 对经预处理的纤维素材料进行洗涤和/或解毒。这可改善例如经稀酸水解的含 木素纤维素材料如玉米秸秆的可发酵性。依照本公开，解毒通过将经预处理 的纤维素材料与含有酯酶和/或阿魏酸酯酶的酶或酶组合物相接触以形成经 精制的经(酶)预处理的纤维素材料来进行。

依照本公开，解毒通过将经预处理的纤维素材料与含有酯酶和/或阿魏酸 酯酶的酶或酶组合物相接触以形成经精制的经(酶)预处理的纤维素材料来进 行。

化学预处理

根据本公开，“化学预处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/ 或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的非限定性实例包括用例如稀 酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行处理。此外，湿氧化和 pH控制的水热解亦认为是化学预处理。

在实施方案中，所述化学预处理是酸预处理，例如连续稀酸处理和/或弱酸 (mild acid)处理，如用硫酸或另一种有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或 其混合物的处理。亦可使用其它酸。弱酸处理在本公开的上下文中意指处理pH 在1-5，例如pH1-3的范围。在一个具体实施方案中，酸浓度在0.1至2.0wt.% 酸，例如硫酸的范围。可将所述酸与根据本公开的待发酵的材料混合或接触，并 可将混合物保持在160-220℃，例如165-195℃的范围，进行数分钟至数秒，例如 1-60分钟，例如2-30分钟或3-12分钟的时段。可施用强酸如硫酸的添加以去除 半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。

已显示，根据本公开亦考虑到的纤维素溶剂处理将约90%的纤维素转化为 葡萄糖。亦显示当木素纤维素结构受破坏时，酶水解可大为增强。碱性H₂O₂、 臭氧、有机溶剂(使用含水醇中的路易斯酸，FeCl₃，(Al)₂SO₄)、甘油、二噁烷、 酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等,Bioresource  Technology96(2005):673-686页)。

本公开的范围亦包括用碱，例如NaOH、Na₂CO₃和/或氨等进行的碱性化 学预处理。使用氨的预处理方法描述于WO2006/110891、WO2006/110899、 WO2006/110900和WO2006/110901，其通过全文提述并入本文。

湿法氧化技术涉及氧化剂如基于亚硫酸盐的氧化剂等的使用。

溶剂预处理的非限定性实例包括用DMSO(二甲亚砜)等进行的处理。化 学预处理通常进行1至60分钟如5至30分钟，但可根据待预处理的材料进 行更短或更长时间。

其它合适预处理方法的非限定性实例描述于Schell等,2003,Appl. Biochem and Biotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource  Technology96:673-686,以及美国公开号2002/0164730，其均通过全文提述并 入本文。

依照本公开，解毒通过将经预处理的纤维素材料与含有酯酶和/或阿魏酸 酯酶的酶或酶组合物相接触以形成经精制的经(酶)预处理的纤维素材料来进 行。

机械预处理

如用于本公开的上下文中，术语“机械预处理”指促进纤维素、半纤维素 和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械或物理预处理。机 械预处理的非限定性实例包括多种类型的磨制、辐照、汽蒸/蒸汽爆炸和水热 解。

机械预处理包括粉碎(机械减小粒径)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨 (vibratory ball milling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本公开 的一个实施方案中，高压意指在300到600psi，例如400到500psi的量，例 如约450psi的压强。在本公开的一个实施方案中，高温意指在约100到300℃， 例如约140到235℃的量的温度。在实施方案中，机械预处理是分批过程的蒸 汽枪水解器系统，其使用如上定义的高压和高温。可为此使用Sunds Hydrolyzer (可从Sunds Defibrator AB(Sweden)获得)。

依照本公开，解毒通过将经预处理的纤维素材料与含有酯酶和/或阿魏酸 酯酶的酶或酶组合物相接触以形成经精制的经(酶)预处理的纤维素材料来进 行。

组合的化学和机械预处理。

在本公开的实施方案中，进行了化学和机械预处理两者，其涉及例如， 稀酸或弱酸预处理以及高温和高压处理。所述化学和机械预处理可根据需要 顺序或同时进行。

相应地，在实施方案中，对含纤维素材料进行化学和机械预处理以促进 纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

在实施方案中，所述预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在实 施方案中，预处理作为氨纤维爆炸(fiber explosion)步骤(或AFEX预处理步骤) 进行。

依照本公开，解毒通过将经预处理的纤维素材料与含有酯酶和/或阿魏酸 酯酶的酶或酶组合物相接触以形成经精制的经(酶)预处理的纤维素材料来进 行。

生物预处理

如用于本公开中，术语“生物预处理”指促进从含木素纤维素材料分离和/ 或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可 涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of  biomass,in Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E. 编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh,P.和Singh,A.,1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of  lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994, Pretreating lignocellulosic biomass:a review,in Enzymatic Conversion of Biomass  for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编,ACS  Symposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC,chapter15; Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from  renewable resources,in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241;Olsson, L.和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for  ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331;以及Vallander,L.和 Eriksson,K.-E.L.,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。

在实施方案中，生物预处理涉及向木质素或经预处理的材料施用木质素 降解酶。合适的木质素降解酶的非限定性实例包括一种或多种木质素分解酶， 一种或多种氧还酶，及其组合。木质素分解酶的非限定性实例包括锰过氧化 物酶，木质素过氧化物酶和纤维二糖脱氢酶，及其组合。合适的预处理酶的 非限定性实例亦包括一种或多种漆酶，纤维二糖脱氢酶及其组合。

在实施方案中，木质素过氧化物酶如“木质素酶”，EC编号1.14.99，适于 依照本公开使用。

在一个实施方案中，可从Zymetis获得的Ethazyme^TM Pre适于在预处理 中依照本公开使用。

依照本公开，解毒通过将经预处理的纤维素材料与含有酯酶和/或阿魏酸 酯酶的酶或酶组合物相接触以形成经精制的经(酶)预处理的纤维素材料来进 行。

经预处理的纤维素材料的处理

本公开亦涉及用于酶法精制经预处理的纤维素材料的工艺，其包括或组 成为：(a)将经预处理的纤维素材料与酯酶或酯酶组合物相接触以形成经精制 的经预处理的纤维素材料。不拘于本公开，认为纤维素材料的预处理增加了 纤维素材料内的杂质，其可削弱所述材料的酶水解。例如，在经预处理的纤 维素材料中可存在足以对水解中使用的纤维素酶具有不利作用的量的酯。本 公开提供了用于处理、去除或消除经预处理的纤维素材料中的毒素的酶和酶 组合物以及方法。所述工艺包括将预决量的酯酶施用于需要处理的经预处理 的纤维素材料，所述材料包括其中含有纤维素已知量的酯的经预处理的纤维 素材料。

相应地，依照本公开的酯酶和/或酯酶组合物提供了对酯和/或毒素的处 理，其中主要的活性成分是酯酶如阿魏酸酯酶。在实施方案中，依照本公开 的组合物含有为商业上可获得的形式的阿魏酸酯酶。

在实施方案中，依照本公开的酯酶或酯酶组合物可施用于需要改善的经 预处理的纤维素材料，所述改善如例如减少或消除不合意的毒素如一种或多 种酯。如用于本文中，词语“处理(treat,treating或treatment)”指预防性地使用 本公开的一种或多种酯酶或酯酶组合物以防止毒素如酯在经预处理的纤维素 材料中的蓄积，或缓解已存在的毒性状况，和/或促进或延长用于水解经预处 理的纤维素材料的纤维素酶的纤维素酶活性。现可进行多种不同处理，其从 经预处理的纤维素材料和/或从所述经预处理的纤维素材料分离的液剂减少 和/或消除毒素。

依照本公开的处理将纤维素材料，或从其分离的一部分如液体流，与一 种或多种依照本公开为有效量的活性酯酶如阿魏酸酯酶相接触，以改善毒性 状况。在实施方案中，通过将毒性材料与依照本公开的一种或多种阿魏酸酯 酶相接触来处理经预处理的纤维素材料或从其分离的一部分。施用酯酶成分 或组合物直至获得处理目标。然而，处理时间可取决于毒性状况的严重程度 或样品中存在的酯的量而变化。例如，处理可持续数分钟至数日，取决于处 理的目标是减少还是消除毒性状况。

在实施方案中，所述酯酶或酯酶组合物包含或组成为一种或多种(几种) 选自下组的酶：酯酶和阿魏酸酯酶。所述酯酶组合物可包含任何可用于对经 预处理的纤维素材料进行解毒的酯酶蛋白。

在实施方案中，阿魏酸酯酶适于依照本公开使用，其通常指4-羟基-3-甲 氧基肉桂酰糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基 团从酯化的糖的水解以产生阿魏酸(4-羟基甲氧基肉桂酸)，所述糖在“自然”物 质中通常为阿拉伯糖。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟 基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。 依照本公开使用的阿魏酸酯酶的非限定性实例在下文中列出。就本发明而言， 阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯 作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放 出1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。

可用于本发明中的酯酶的非限定性实例包括但不限于来自腐质霉属 (Humicola)的FAE-I，来自黑曲霉(Asp.Niger)的FAE，来自米曲霉(Asp.Oryzae) 的FAE，来自球毛壳菌(Chaetomium globusam)的FAE，和来自米曲霉的酯酶， 或它们具有酯酶或阿魏酸酯酶活性的片段。

依照本公开使用的酯酶的其它非限定性实例包括描述于美国专利公开号 2010/0122380A1，EP1752533-A1和WO9814594-A2(其均通过全文提述并入 本文)中的阿魏酸酯酶。合适的酯酶包含氨基酸序列，其与美国专利公开号 2010/0122380A1，EP1752533-A1和WO9814594-A2中每一个的阿魏酸酯酶 具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%， 至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少 96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%序列同一性，或为其具 有阿魏酸酯酶活性的活性片段。

在本公开的一个方面，所述酯酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:133， SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137的成 熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至 少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少 95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的序列同 一性程度，或为其具有酯酶活性或阿魏酸酯酶活性的活性片段。在实施方案 中，适于依照本公开使用的酯酶包括SEQ ID NO:133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137的成熟多肽或其具有酯酶活 性的活性片段。在实施方案中，适于依照本公开使用的酯酶包括SEQ ID NO: 133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137 的两个或更多个的组合。

在一个方面，本公开的酯酶是人工变体，其包含SEQ ID NO:133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137的成熟多肽 的一个或多个(或几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，或其同源序列。

优选地，氨基酸改变可为性质上较不重要的(of a minor nature)，即保守的 氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约 30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残 基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促 进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic  epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨 酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、 疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨 酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。 通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例 如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中 描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、 Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、 Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如， 氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法 (Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需 氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且 就纤维素分解增强活性测试所得突变分子以鉴定对于所述分子的活性关键的 氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活 性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以 下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接 触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312； Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309: 59-64。必需氨基酸的身份也能够从与相关于亲本多肽的多肽的同一性分析来 推断。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由 Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl. Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或者WO95/22625所公开的那些， 进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包 括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837; 美国专利号5,223,409;WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed  mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene46:145;等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的 经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。 编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方 法迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

在实施方案中，SEQ ID NO:133，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:135， SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插 入总数不多于10个，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个。

在实施方案中，适于依照本公开使用的酯酶组合物包含或组成为SEQ ID. NO:133，SEQ ID.NO:134，SEQ ID.NO:135，SEQ ID.NO:136或SEQ ID NO: 137或其具有酯酶活性的活性片段。

在实施方案中，适于依照本公开使用的酯酶包括或组成为FAE(1)， FAE-A，FAE-C，和FAE-D或其具有酯酶活性的活性片段。

依照本公开使用的酯酶或酯酶组合物的一个或多个(几个)成分可为野生 型蛋白，重组蛋白，或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一个或多个(几 个)组分可为细胞的天然蛋白，所述细胞用作宿主细胞重组表达酯酶组合物的 一个或多个(几个)其它组分。酯酶组合物的一个或多个(几个)组分可作为单组 分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分 蛋白制备物的组合。

用于本公开的工艺的酯酶可为任何适于使用的形式，如例如去除或未去 除细胞的粗发酵液，具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的 酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无 粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酯酶制备物可根 据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或 其他有机酸来稳定化。

所述酯酶可来源于或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、 植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指所述酯酶可分离自将所述酯 酶作为天然酶天然地产生的生物体。术语“获得”在本文中亦意指所述酶可已 在宿主生物中采用本文中所述的方法重组产生，其中所述重组产生的酯酶对 于宿主生物是天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如具有一个或 多个(几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为突变体和/ 或天然氨基酸序列的片段或通过本领域中已知的核酸改组工艺产生的酶。天 然酶的含意中涵盖天然变体，而外源酶的含意中涵盖重组地(如定位诱变或改 组)获得的变体。

在实施方案中，依照本公开的处理包括从经预处理的纤维素材料分离液 剂或液体部分的步骤。不拘于本公开，认为来自经预处理的纤维素材料的液 体级分或液剂可包含毒素如对于水解和/或纤维素酶有毒的酯。依照本公开， 酯酶组合物包含或组成为一种或多种(几种)选自下组的酶：酯酶和阿魏酸酯 酶，或可将其具有酯酶活性的活性片段施用于液体分离物或液剂。然后可将 所述液剂重新加至经预处理的纤维素材料以供其有效处理。例如，可以将液 剂与阿魏酸酯酶接触并再循环液剂。将经再循环和处理的液剂再循环至用酯 酶组合物对经预处理的纤维素材料进行的新的预处理，或单独用于水解和/或 发酵的目的。

依照本公开的处理并不限于对经预处理的纤维素材料的直接处理。认为 依照本公开的工艺包含，包括或组成为对经酶法预处理、化学预处理、机械 预处理和/或物理预处理的经精制的经预处理的纤维素材料进行后处理。

在实施方案中，依照本公开的处理包含，包括或组成为回收经精制的经 酶预处理的纤维素材料。经精制的经预处理的纤维素材料作为供水解的底物 具有改善的品质。

在实施方案中，用酶组合物如酯酶和阿魏酸酯酶进行的接触或处理用充 足量的酶每克(g)经预处理的纤维素材料进行。在实施方案中，依照本发明使 用的组合物以改善经预处理的有效量含有酯酶如阿魏酸酯酶。如用于本文中 “有效量”指依照本公开足以对经预处理的纤维素材料组合物或其部分诱导特 定有利作用的酯酶或具有酯酶成分的酯酶组合物的量。所述有利作用可与毒 素相关，或可更涉及酶水解的特性，或可为两者组合。在实施方案中，所述 有利作用通过将经预处理的纤维素材料或其部分与酯酶或酯酶组合物相接触 以改善经预处理的纤维素材料条件以改善其水解性能来达成。例如，依照本 公开添加的酶量包括足以使得经预处理的纤维素材料解毒从而可改善其水解 的量。改善的非限定性实例包括经预处理的纤维素材料中酯毒素的减少和/或 在所述材料水解过程中形成的糖的量的增加。在实施方案中，经预处理的纤 维素材料中的酯和/或毒素的量减少1-10%，20%，30%，40%，50%，60%， 70%，80%，90%或100%的量。酯和毒素的减少可通过任何本领域中已知的 合适分析方法如HPLC来测量。在实施方案中，在经预处理的纤维素材料中 的酯和/或毒素的量减少存在的酯或毒素总量的10-30%，存在的酯或毒素的总 量的20-40%，存在的酯或毒素的总量的40-50%，存在的酯或毒素的总量的 50-60%，存在的酯或毒素的总量的60-70%，存在的酯或毒素的总量的 70-80%，存在的酯或毒素的总量的80-90%，或存在的酯或毒素的总量的 90-100%。在实施方案中，所述改善可指增加量的水解产物，如糖，其与使用 经水解但未依照本公开处理的经预处理的纤维素材料时产生的水解产物的量 相比更大。在实施方案中，水解产物或糖的量与使用经水解但未依照本公开 处理的经预处理的纤维素材料时产生的水解产物的量相比增加至1.1，1.2， 1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9或2倍。在实施方案中，水解产物或糖的 量与使用经水解但未依照本公开处理的经预处理的纤维素材料时产生的水解 产物的量相比增加至3，4，5，6，7，8，8，9或10倍。依照本公开使用的 酶如酯酶和阿魏酸酯酶的非限定性合适量包括约0.0005至约5mg，例如约 0.001至约5mg，约0.0025至约5mg，约0.005至约5mg，约0.005至约4.5 mg，约0.005至约4mg，约0.005至约3.5mg，约0.005至约3mg，约0.005 至约2mg，约0.005至约1mg，约0.075至约1mg，或约0.1至约1mg酶每 g经预处理的纤维素材料，或每mL从经预处理的纤维素材料分离的液剂。在 实施方案中，依照本公开使用的酶如酯酶和阿魏酸酯酶的合适量包括约 0.0005至约5mg，例如约0.001至约5mg，约0.0025至约5mg，约0.005至 约5mg，约0.005至约4.5mg，约0.005至约4mg，约0.005至约3.5mg， 约0.005至约3mg，约0.005至约2mg，约0.005至约1mg，约0.075至约1 mg，或约0.1至约1mg酶每mL从经预处理的纤维素材料分离的液剂。

在实施方案中，依照本公开的处理包括、组成为或包含在其它反应中充 分有用的经预处理的纤维素材料的量。例如，经预处理的纤维素材料的处理 和接触用使得处理以约1%至约50%，例如约2%至约40%，约2%至约35%， 约3%至约30%，约3%至约25%，约4%至约20%，或约5%至约10%的总固 体(TS)进行的经预处理的纤维素材料的量进行。在实施方案中，处理用1%， 2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%， 15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%， 27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%， 39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%或50% 的总固体(TS)进行。

在实施方案中，用酯酶或酯酶组合物接触或处理经预处理的纤维素材料 在适于酯酶的pH进行。合适的pH的非限定性实例包括在约2至约9，例如 约3至约8，约3至约7.5，约3.5至约7，约4至约6.5，约4.5至约6.5，约 4.5至约6.0，约5至约6.0，或约5至约5.5的pH用酯酶组合物接触或处理。 在实施方案中，所述pH是2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9， 3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4， 4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9， 6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4， 7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9 或9.0。在实施方案中，合适的pH的实例包括在2至9，例如3至8，3至 7.5，3.5至7，4至6.5，4.5至6.5，4.5至6.0，5至6.0，或5至5.5的pH用 酯酶组合物接触或处理。

在实施方案中，用酯酶组合物接触或处理经预处理的纤维素材料在适于 所述酯酶的温度进行。合适的温度的非限定性实例包括在约20℃至约70℃， 例如约25℃至约65℃，约30℃至约65℃，约35℃至约65℃，约40℃至约 60℃，约45℃至约55℃，或约45℃至约50℃范围的温度。在实施方案中， 合适的温度为46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃， 55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃， 66℃，67℃，68℃，69℃，70℃。

在实施方案中，用酯酶组合物接触或处理经预处理的纤维素材料进行适 于所述酯酶对在经预处理的纤维素材料组合物中的酯或毒素反应的时间。合 适时间的非限定性实例包括5分钟至35小时，例如10分钟至15小时，10 小时至15小时，10小时至20小时，10小时至24小时，20小时至24小时， 24小时至30小时的时间。在实施方案中，所述时间为1，2，3，4，5，6，7， 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24， 25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，48，72小时。

所述酯酶处理通常在罐中在控制的pH、温度和如本文中所述的条件下进 行。在实施方案中，用酯酶或酶组合物接触或处理经预处理的纤维素材料用 本文中所述的经预处理的纤维素材料的量，用本文中所述的酶如酯酶和阿魏 酸酯酶的量，在依照本公开的pH、温度和时间下进行。可使用对本文中使用 的量的多种修饰以优化酯酶去除毒素和/或增加酶水解产率的性能。在实施方 案中，酯酶处理优选在合适水性环境中在可由本领域技术人员方便地确定的 条件下进行。在一个优选的方面，酯酶处理在适于所述酯酶活性，即对于所 述酯酶最优的条件下进行。酯酶处理可作为补料分批或连续工艺进行，其中 将经预处理的纤维素材料(底物)逐渐给料于例如含有酯酶的溶液。

在实施方案中，本公开的工艺包括酶法精炼经预处理的纤维素材料的工 艺，其包括、组成为或包含：

(a)加工所述经预处理的纤维素材料以形成经预处理的纤维素材料的固/ 液混合物；

(b)从经预处理的纤维素材料的固/液混合物分离出液剂；和

(c)通过阿魏酸酯酶处理来处理所述液剂。

在实施方案中，所述工艺进一步包含、包括或组成为将经处理的液剂回 送至经预处理的纤维素材料。在此，可重复本公开的工艺，从而合并多个液 剂分离物以构成批次。

在实施方案中，本公开涉及用于水解经预处理的纤维素材料的工艺，其 包括糖化经预处理的纤维素材料，所述纤维素材料经根据包括本公开的酯酶 或酯酶组合物的本公开的工艺处理和精制。在实施方案中，所述水解使用酶 组合物进行，所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆 酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在实施方案中， 所述纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水 解酶和β-葡糖苷酶。在实施方案中，所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选 自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、 木糖苷酶、β-木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

在实施方案中，所述工艺进一步包括从糖化回收经糖化的经预处理的纤 维素材料的步骤。在实施方案中，所述经糖化的纤维素材料是糖。糖的非限 定性实例包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。

在实施方案中，本公开涉及用于产生发酵产物的工艺，其包括或组成为： (a)糖化经预处理的纤维素材料，其中所述经预处理的纤维素材料依照本公开 用酯酶或酯酶组合物处理。在此，糖化使用适于糖化的酶组合物进行。在实 施方案中，适于糖化的酶包括一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、具 有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、 木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在实施方案中，纤 维素是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β -葡糖苷酶。在实施方案中，半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶： 木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和 葡糖醛酸糖苷酶。下一步骤包括(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖 化的经预处理的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。在 实施方案中，步骤(a)(糖化经预处理的纤维素材料，其中依照本公开使与酯酶 接触、处理或精制所述经预处理的纤维素材料)和(b)(用一种或多种(几种)发 酵微生物发酵经糖化的经预处理的纤维素材料以产生发酵产物)在同时糖化 和发酵中同时进行。在实施方案中，所述发酵产物是醇，有机酸，酮，氨基 酸，烷烃，环烷烃，烯烃，或气体。

本公开进一步涉及用于发酵经预处理的纤维素材料的工艺，其包括或组 成为用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经预处理的纤维素材料，其中所述经 预处理的纤维素材料根据本公开处理、精制和/或糖化。在实施方案中，经预 处理的纤维素材料的发酵产生发酵产物。在实施方案中，所述工艺包括或组 成为从发酵回收发酵产物的步骤。在实施方案中，所述发酵产物是醇、有机 酸、酮、氨基酸、烷烃、环烷烃、烯烃或气体。

在实施方案中，本公开的工艺优选用于非木质经预处理的纤维素材料或 非木质原料。非木质经预处理的纤维素材料的非限定性实例包括经预处理的 植物茎、叶、壳、皮和穗轴，或叶。所述非木质纤维素材料可为，但不限于 草本材料，农业残余物，专用能源作物，城市化，废纸，以及纸浆和造纸厂 残余物。在一个方面，所述纤维素材料是非木质草本材料。在另一个方面， 所述纤维素材料是非木质农业残余物。在一个方面，所述纤维素材料是非木 质能源作物。在本发明的一个方面，依照本公开排除木质原料作为合适的原 料或纤维素材料使用。

糖化

在水解(也称作糖化)步骤中，将纤维素材料，即经预处理的纤维素材料水解 以将纤维素以及或者也将半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木 糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶组合物以 酶法进行。组合物的酶和蛋白组分可顺序加入。

酶水解优选在容易由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境 中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下 进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，其中将经预处理的纤维素材 料(底物)逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。

糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进 行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。 例如，糖化可持续长达200小时，但是通常进行优选约12至约96小时，更 优选约16至约72小时，和最优选约24至约48小时。温度在优选约25℃至 约70℃，更优选约30℃至约65℃，和最优选约40℃至60℃的范围，特别是 约50℃。pH在优选约3至约8，更优选约3.5至约7，和最优选约4至约6 的范围，特别是约pH5.0。干固体含量在优选约5至约50wt%，更优选约 10至约40wt%，和最优选约20至约30wt%的范围。

酶的最优量取决于几种因素，包括但不限于组分纤维素分解酶的混合物， 纤维素材料，纤维素材料的浓度，纤维素材料的预处理，温度，时间，pH和 发酵生物的包含(例如用于同时糖化和发酵的酵母)。

在一个方面，纤维素分解或半纤维素分解酶蛋白对纤维素材料的有效量 为约0.5至50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选 约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg， 且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。

在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽对纤维素材料的 有效量为约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约 30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01 至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优 选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至 约1.25mg，且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。

在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽对纤维素分解酶 蛋白的有效量为约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15 至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选 约0.1至约0.5g，且最优选约0.05至0.2g每g纤维素分解酶蛋白。

发酵

可通过一种或多种(几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵 微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法” 指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇 工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的 发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域 的技术人员容易地确定。

在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖， 通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化) 和发酵可以是单独或同时的。

术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如， 由糖化过程产生的培养基，以及同时糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”指适用于合意的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物， 包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C₆和/或C₅发酵生物体，或它们 的组合。C₆和C₅发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如 葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或 间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。

可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl. Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。

能发酵C₆糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选 的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母。

能发酵C₅糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。 优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis) 的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属(Candida)，优选博伊丁假丝 酵母(Candida boidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母 (Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母 (Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis)的菌株；汉逊酵母属(Hansenula)，如异常汉逊酵母 (Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，如脆壁克鲁维酵 母的菌株(K.fragilis)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S. pombe)的菌株；大肠杆菌，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠 杆菌菌株；梭菌属(Clostridium)，如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)， 热纤维梭菌(Chlostridium thermocellum)和Chlostridium phytofermentans；地芽 孢杆菌属菌种(Geobacillus sp.)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如 Thermoanaerobacter saccharolyticum；和芽孢杆菌属(Bacillus)，如凝结芽孢杆 菌(Bacillus coagulans)。

在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种(Saccharomyces spp.)。在一个更 优选的方面，酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在另一个更优选的 方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面， 酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克 鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。 在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是 博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个 更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是假 热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优 选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是 葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人 掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属 (Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen  tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的 方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香酵母属 (Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母 (Bretannomyces clausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion  technology,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C. E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。

能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌， 丙酮丁醇梭菌，热纤维梭菌，Chlostridium phytofermentans，地芽孢杆菌属菌 种，Thermoanaerobacter saccharolyticum和凝结芽孢杆菌(Philippidis,1996,见 上文)。

在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运 动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方 面，细菌是热纤维梭菌。

商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOL RED^TM酵母(可 从Red Star/Lesaffre,USA获得)、FALI^TM(可从Fleischmann’s Yeast,Burns Philp  Food Inc.,USA获得)、SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从 Ethanol Technology,WI,USA获得)、BIOFERM^TMAFT和XR(可从NABC-North  American Bioproducts Corporation,GA,USA获得)、GERT STRAND^TM(可从Gert  Strand AB,Sweden获得)和FERMIOL^TM(可从DSM Specialties获得)。

在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能 力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化 成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving the  expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等,1998,Genetically engineered  Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl. Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentation by  Saccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson  等,1995,Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the  TKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes  transketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper  等,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient  anaerobic xylose fermentation:a proof of principle,FEMS Yeast Research4: 655-664;Beall等,1991,Parametric studies of ethanol production from xylose and  other sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303; Ingram等,1998,Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等,1995,Metabolic engineering of a  pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis,Science267: 240-243;Deanda等,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonas  mobilis strain by metabolic pathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62: 4465-4470;WO2003/062430,xylose isomerase)。

在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个 优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选 的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经 过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优 选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属菌种。

本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。

通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，且发酵进行约8至 约96小时，如约24至约60小时。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约 32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，如约pH4-5、6或7。

在一个优选的方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物， 且发酵进行约12至约96小时，如通常24-60小时。在一个优选的方面，温度 优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃至约 50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，优选约pH4-7。 然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微 生物优选以约10⁵-10¹²，优选约10⁷-10¹⁰，特别是约2x10⁸活细胞计数每ml发 酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,Nottingham University Press, United Kingdom1999)中找到，其通过提述并入本文。

对于乙醇生产，在发酵后蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的工 艺获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，可饮用的中性酒， 或工业乙醇。

发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工 艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵 刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发 酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛 酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对 氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore 等,Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，其通过 提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所 述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。

发酵产物

发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可为，不限于，醇(例如， 阿拉伯醇、丁醇，乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机 酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、 甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、 衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)； 酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸 和苏氨酸)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二 烷)，环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)，烯烃(例如戊烯、己烯、 庚烯和辛烯)；和气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))。 发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。

在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含 一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另 一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。 在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面， 所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在 另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是 木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol  production from renewable resources,于Advances in Biochemical  Engineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany,65:207-241;Silveira,M.M.和Jonas,R.2002,The biotechnological  production of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam,P.和 Singh,D.,1995,Processes for fermentative production of xylitol–a sugar  substitute,Process Biochemistry30(2):117-124;Ezeji,T.C.,Qureshi,N.和 Blaschek,H.P,2003,Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridium  beijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping,World Journal of  Microbiology and Biotechnology19(6):595-603。

在另一个优选的方面，发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述 有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优 选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏 血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面， 所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。 在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面， 所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另 一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有 机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更 优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳 酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面， 所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个 更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥 珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen,R., 和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid  production from cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。

在另一个优选的方面，发酵产物是酮。应理解的是术语“酮”涵盖包含 一个或多个酮模块的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见， 例如Qureshi和Blaschek，2003，见上文。

在另一个优选的方面，发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有 机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优 选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。 在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨 基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard,A.,和Margaritis,A.,2004,Empirical modeling  of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial  biopolymers,Biotechnology and Bioengineering87(4):501-515。

在另一个优选的方面，发酵产物是烷烃。所述烷烃可为非支化的或支化的烷 烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷 烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面， 所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的 方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个 更优选的方面，所述烷烃是十二烷。

在另一个优选的方面，发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环 烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选 的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。

在另一个优选的方面，发酵产物是烯烃。所述烯烃可为非支化或支化的烯烃。 在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是 己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述 烯烃是辛烯。

在另一个优选的方面，发酵产物是气体。在另一个更优选的方面，所述 气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H₂。在另一个更优选的方 面，所述气体是CO₂。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如 Kataoka,N.,A.Miya和K.Kiriyama,1997,Studies on hydrogen production by  continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,Water  Science and Technology36(6-7):41-47；以及Gunaseelan,1997,Biomass and  Bioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobic digestion of biomass for  methane production:A review。

所述发酵产物可任选地使用任何本领域中已知的方法从发酵培养基回收，所 述方法包括但不限于层析，电泳方法，差示溶解度，蒸馏，或提取。例如，通过 常规的蒸馏方法将醇从经发酵纤维素材料分离并纯化。可获得具有高至约96 vol%的纯度的乙醇，其可用作例如例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，可饮用的中 性酒，或工业乙醇。

水解酶组合物

酶组合物可包含任何可用于糖化纤维素材料的蛋白。

在一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)选自下组 的蛋白：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶、 棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨 胀素。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一种或多种(几种)选自下组的酶： 内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维 素酶优选为一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖 酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳 糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚 糖酶和木糖苷酶。

在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)纤维素分解酶。在另 一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)半纤维素分解 酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(种)纤维素分解酶和一种或 多种(几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几 种)选自下组的酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶 组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解 酶。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶 组合物包含具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物 包含内切葡聚糖酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述 酶组合物包含纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个 方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在 另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个 方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述 酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物 包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在 另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分 解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶、β- 葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物 包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶，和具有纤维素分解增强 活性的多肽。

在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面， 所述酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉 伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉 伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物 包含香豆酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一个 方面，所述酶组合物包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和或β-半乳糖苷酶)。 在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷 酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，所述 酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露糖苷酶(例 如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选 的方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包 含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。

在另一个方面，所述酶组合物包含棒曲霉素。在另一个方面，所述酶组 合物包含酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含漆酶。在另一个方面，所 述酶组合物包含木质素分解酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是 锰过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是木质素过氧化物 酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是产生H₂O₂的酶。在另一个方 面，所述酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，所述酶组合物包含过氧化物 酶。在另一个方面，所述酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，所述酶组合 物包含膨胀素。

在本发明的工艺中，酶可在发酵之前或之中，例如在糖化过程中或在发酵 微生物的繁殖过程中或之后添加。

所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生 型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(几种)组分可为细胞的天然蛋白， 其用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(几种)其他组分。酶组合物 的一种或多种(几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。 所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。

用于本发明工艺中的酶可为任何适于在本文中所述的工艺中使用的形 式，例如去除或未去除细胞的粗发酵液，具有或不具有细胞碎片的细胞裂解 液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物 可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。 液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多 元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。

酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺 乳动物来源。术语“获得”在本文中意指该酶可从天然产生该酶作为天然酶 的生物分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中 所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的， 或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(几个)缺失、插入和/或取 代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通 过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变 体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体

具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是具有酶活性 的革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链 霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、 乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽 孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或具有酶活性 的革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌 属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆 菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟 氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有纤维素分解酶 活性或木聚糖降解酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus  alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌 (Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus  clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、 灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌 (Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌 (Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌 (Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉 菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌 (Streptomyces lividans)多肽。

具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选具有酶活性的酵母多 肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属 (Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍 霉属(Yarrowia)多肽；或更优选具有酶活性的丝状真菌多肽如枝顶孢霉属 (Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、 短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属 (Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞 属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属 (Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、 Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属 (Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、 Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、 毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、 脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革 菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属 (Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属 (Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌 属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属 (Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属 (Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces  carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces  diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母 (Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母 (Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉 (Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉 (Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus  foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲 霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium  keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium  tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌 (Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium  zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库 威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢 (Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium  heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、 多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢 (Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢 (Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium  torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium  venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉 状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor  miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora  crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、 黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、 Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、 Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳 (Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈 茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉 (Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉 (Trichoderma viride)或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。

还可以使用具有酶活性的多肽经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。

所述酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可以是重组组分，亦即，通过 克隆编码所述单组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中 表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)而产生。所述宿主优选是异 源宿主(酶对宿主是异源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对 宿主是天然的)。单组分纤维素分解酶还可以通过从发酵液中纯化这样的蛋白 来制备。

在一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包括商业性纤维素分解 酶制备物。适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如， CELLIC^TMCtec(Novozymes A/S)、CELLIC^TMCtec2(Novozymes A/S)、 CELLUCLAST^TM(Novozymes A/S)、NOVOZYM^TM188(Novozymes A/S)、 CELLUZYME^TM(Novozymes A/S)、CEREFLO^TM(Novozymes A/S)和 ULTRAFLO^TM(Novozymes A/S)，ACCELERASE^TM(Genencor Int.)、 LAMINEX^TM(Genencor Int.)、SPEZYME^TMCP(Genencor Int.)，ROHAMENT^TM7069W(GmbH)，LDI(Dyadic International,Inc.)、 LBR(Dyadic International,Inc.)或150L(Dyadic International,Inc.)。纤维素酶以固体的约0.001到约5.0wt%，更优选固体的 0.025到约4.0wt%，且最优选固体的约0.005到约2.0wt%的有效量添加。 纤维素酶以固体的约0.001至约5.0wt%，更优选固体的约0.025至约4.0wt %，且最优选固体的约0.005至约2.0wt%的有效量添加。

在本发明的工艺中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的GH61多肽， 如上文中所述的那些多肽。

可用于本发明工艺的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维 热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO93/15186; 美国专利5,275,944；WO96/02551；美国专利号5,536,655，WO00/70031， WO05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和 Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。

可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉 内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene45:253-263)；里氏木霉Cel7B内切葡 聚糖酶I；GENBANK^TM登录号M15665；SEQ ID NO:2)；里氏木霉内切葡聚 糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene63:11-22；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II； GENBANK^TM登录号M19373；SEQ ID NO:4)；里氏木霉内切葡聚糖酶III (Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANK^TM登录号 AB003694；SEQ ID NO:6)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994, Molecular Microbiology13:219-228；GENBANK^TM登录号Z33381；SEQ ID NO: 8)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research18:5884)；川 地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶 (Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号 L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号 AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号 MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)； 特异腐质霉内切葡聚糖酶V(SEQ ID NO:10)；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡 聚糖酶(SEQ ID NO:12)；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶 (SEQ ID NO:14)；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:16)；土生 梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:18)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:20)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C 内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:22；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶 (SEQ ID NO:24)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶(SEQ ID NO: 26)；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:28)；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30； GENBANK^TM登录号M15665)。上述SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24， SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，和SEQ ID NO:30的内切葡聚糖酶分别由 SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9， SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，和 SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列所编码。

可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉纤维 二糖水解酶I(SEQ ID NO:32)；里氏木霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:34)； 特异腐质霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:36)、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶 II(SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40)、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A) (SEQ ID NO:42)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I (SEQ ID NO:44)以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:46)，烟曲霉 纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:48)，和烟曲霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO: 50)。上述SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38， SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO: 48，和SEQ ID NO:50的纤维二糖水解酶分别由SEQ ID NO:31，SEQ ID NO: 33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，和SEQ ID NO:49的成熟多肽 编码序列所编码。

可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶 (SEQ ID NO:52)；烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:54)；巴西青霉(Penicillium  brasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:56)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:58)；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:60)。上述SEQ ID NO:52， SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，和SEQ ID NO:60的β-葡 糖苷酶分别由SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO: 57，和SEQ ID NO:59的成熟多肽编码序列所编码。

可用于本发明的其它β-葡糖苷酶包括SEQ ID NO:62的米曲霉β-葡糖苷 酶变体融合蛋白或SEQ ID NO:64的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的β-葡糖苷酶融合蛋白分别由SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63所编码。

米曲霉β-葡糖苷酶可根据WO2002/095014获得。烟曲霉β-葡糖苷酶可根 据WO2005/047499获得。巴西青霉β-葡糖苷酶可根据WO2007/019442获得。 黑曲霉β-葡糖苷酶可根据Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980获得。棘 孢曲霉β-葡糖苷酶可根据Kawaguchi等,1996,Gene173:287-288获得。

其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根据 Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid  sequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat B.和Bairoch A., 1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem. J.316:695-696的分类公开于许多糖基水解酶家族中。

其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP495,257、EP531,315、EP 531,372、WO89/09259、WO94/07998、WO95/24471、WO96/11262、WO 96/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、 WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、 WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、WO 2000/009707、WO2002/050245、WO2002/0076792、WO2002/101078、WO 2003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056、WO 2003/052057、WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、WO 2004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050、WO 2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO2007/071818、WO 2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美国专利No.4,435,307、 美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、 美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254以及美国专利No.5,776,757。

在本发明的工艺中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

在第一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽具有下述基序：

[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和 [FW]-[TF]-K-[AIV],

其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5个连续位置的任何氨基酸，和 X(4)是在4个连续位置的氨基酸。

包含上述标示的基序的多肽可进一步包含：

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，

其中X是任何氨基酸，X(1,2)是在1个位置或2个连续位置的任何氨基 酸，X(3)是在3个连续位置的任何氨基酸，和X(2)是在2个连续位置的任何 氨基酸。在上述基序中，使用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

在一个优选的方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽进一步包含 H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一个优选的方面，所述具有纤维素分 解增强活性的分离的多肽进一步包含 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一个优选的方面，所述具有 纤维素分解增强活性的多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。

在第二个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含下述基序：

[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]，

其中其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5个连续位置的任何氨基酸， 和X(3)是在3个连续位置的任何氨基酸。在上述基序中，使用公认的IUPAC 单字母氨基酸缩写。

在第三个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含氨基酸序列， 所述氨基酸序列与SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:80， SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO: 90，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO: 108，SEQ ID NO:110，SEQ ID NO:112，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:116， SEQ ID NO:118，SEQ ID NO:120，SEQ ID NO:122，SEQ ID NO:124，SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:128的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%， 至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少 92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%， 至少99%，或至少100%的同一性程度。

在第四个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所 述多核苷酸在至少非常低严格条件，优选至少低严格条件，更优选至少中等严 格条件，更优选至少中-高严格条件，甚至更优选至少高严格条件，和最优选 至少非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO: 87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO: 105，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:109，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:113， SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:119，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:123，SEQ ID NO:125，或SEQ ID NO:127的成熟多肽编码序列，(ii)包 含于SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:75，或SEQ ID NO:79的 成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:67， SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO: 85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:109，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:113，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:119，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:123，SEQ ID NO:125，或SEQ ID NO:127的成熟 多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii) 的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989，见上文)。SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:73， SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO: 83，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101， SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:109，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:113，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO: 119，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:123，SEQ ID NO:125，或SEQ ID NO:127 的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续核苷酸或优选至少200个连 续核苷酸。而且，所述有效量可编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

在第五个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码， 所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:65， SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:93， SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:109，SEQ ID NO: 111，SEQ ID NO:113，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:119， SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:123，SEQ ID NO:125，或SEQ ID NO:127的 成熟多肽编码序列具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%， 更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%， 最优选至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，和甚至最 优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%同一性程度。

在第六个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQ ID NO:66， SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO: 76，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:94， SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:108，SEQ ID NO:110，SEQ ID NO: 112，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:118，SEQ ID NO:120， SEQ ID NO:122，SEQ ID NO:124，SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:128的 成熟多肽的包含一个或多个(或几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的人工变 体；或其同源序列。

优选地，氨基酸改变是性质上较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨 基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30 个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基； 多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化 的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或 结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨 酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、 疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨 酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。 通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例 如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中 描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、 Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、 Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸改变具有这样的性质：使多肽的物理化学性质改变。例如， 氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法 (Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需 氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且 测试所得突变分子的纤维素分解增强活性以鉴定对于所述分子的活性关键的 氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活 性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以 下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接 触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312； Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309: 59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所 述多肽与参照的亲本多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法接着进行有关的筛选 方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie 和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插 入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991, Biochemistry30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定 向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145；Ner等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞 表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17: 893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用 本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残 基的重要性。

SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:82， SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:90，SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:108，SEQ ID NO: 110，SEQ ID NO:112，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:118， SEQ ID NO:120，SEQ ID NO:122，SEQ ID NO:124，SEQ ID NO:126，或 SEQ ID NO:128的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过4个， 例如1，2，3，或4个。

在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在 WO2008/151043中所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下 使用。

在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧化合物、 二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材 料(如经预处理的玉米秸秆(PCS))获得的液体的存在下使用。

所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一 些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述 二氧化合物可包括一个或多个(几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟 基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二 酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；连 苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6- 二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯 二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二 醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’- 三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟 基丙酮；乙酰丙烯醛(acrolein acetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和 甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。

所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述 化合物可包含一个或多个(几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环 数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合 物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任 选取代的花色离子(flavylium ion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色 苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲 皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)； 桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素 (isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)； kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。

所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含 杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模 块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷 基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元 杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是 选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、 噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、 二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并 噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑 基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、 苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉 基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、氮杂环庚三 烯基(azepinyl)、硫杂环庚三烯基(thiepinyl)、哌啶基和氧杂环庚三烯基(oxepinyl)。 在另一个方面所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取 代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃 -2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃 -2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯 (aldohexuronicaldohexuronic acid γ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二 氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡 喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。

所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个 方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮 化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2- 苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤； 6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。

所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合 物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5- 甲基-1,4-苯醌或辅酶Q₀；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基 蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2- 苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。

所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个 方面，所述含硫化合物包含选自如下的模块：亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰， 磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯。含硫化合物的非限定 性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2- 二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。

在一个方面此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，作为对纤维素 糖单元的摩尔比例为约10^-6至约10，例如约10^-6至约7.5，约10^-6至约5，约10^-6至约2.5，约10^-6至约1，约10^-5至约1，约10^-5至约10^-1，约10^-4至约10^-1，约 10^-3至约10^-1，或约10^-3至约10^-2。在另一个方面，此种如上所述的化合物的有 效量为约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M， 约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至 约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM， 或约0.1mM至约1mM。

在实施方案中，术语液剂(liquor)指在本文中所述的条件下，通过处理浆料 中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等， 所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内含物。用于GH61 多肽的纤维素分解增强的液剂可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在 有机溶剂的存在下，且任选与所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/或压 力来处理纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液与残余固体分离来产 生。此类条件决定在通过纤维素酶制备物水解纤维素材料过程中，通过液剂和 GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液剂可使用本领域中 的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。

在一个方面，所述液剂对纤维素的有效量为约10^-6至约10g每g纤维素， 例如约10^-6至约7.5g，约10^-6至约5，约10^-6至约2.5g，约10^-6至约1g，约10^-5至约1g，约10^-5至约10^-1g，约10^-4至约10^-1g，约10^-3至约10^-1g，或约10^-3至约10^-2g每g纤维素。

在一个方面，所述一种或多种(几种)半纤维素分解酶包含商业的半纤维素 分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括， 例如SHEARZYME^TM(Novozymes A/S)、CELLIC^TMHTec(Novozymes A/S)、 CELLIC^TMHtec2(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、 (Novozymes A/S)、HC(Novozymes A/S)、 Xylanase(Genencor)、TX-200A(AB Enzymes)、 HSP6000Xylanase(DSM)、DEPOL^TM333P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)、 DEPOL^TM740L.(Biocatalysts Limit,Wales,UK)和DEPOL^TM762P(Biocatalysts  Limit,Wales,UK)。

可用于本发明工艺的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillus  aculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)、烟曲霉(Aspergillus  fumigatus)木聚糖酶(WO2006/078256；xyl3SEQ ID NO:129[DNA序列]和 SEQ ID NO:130[推导的氨基酸序列])和土生梭孢霉(Thielavia terrestris) NRRL8126木聚糖酶(WO2009/079210)。

可用于本发明工艺的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉β-木糖苷 酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458),埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii) (SwissProt登录号Q8X212；SEQ ID NO:131[DNA序列]和SEQ ID NO:132 [推导的氨基酸序列])和粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)。

可用于本发明工艺的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌 (Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖 酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号 Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号 AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录 号Q0UHJ1)和特异腐质霉DSM1800乙酰木聚糖酯酶(WO2009/073709)。

可用于本发明工艺的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM 1800阿魏酸酯酶(WO2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号 Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号 A1D9T4)。

可用于本发明工艺的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉 DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO2009/073383)和黑曲霉(Aspergillus niger)阿 拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。

可用于本发明工艺的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉 (Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉α- 葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌α-葡糖醛酸糖苷酶 (UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号 Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号 Q0CJP9)和烟曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。

用于本发明工艺的酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营 养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(编), More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)发酵上述指出的 微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组成制 备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其 他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.,Biochemical  Engineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986)。

所述发酵可以是任何其结果为酶表达或分离的培养细胞的方法。因此， 发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条 件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连 续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培 养基回收并通过常规方法纯化。

核酸构建体

可以以多种方式操作编码多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH多 肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的分离的多核苷酸，以提供多肽的表 达，即构建包含编码多肽的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可 操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导编码序列在合适 的宿主细胞中在与所述调控序列相容的条件下的表达。依赖于表达载体，在 将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用 重组DNA方法修饰多核苷酸的序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可为启动子序列，其是由用于表达编码多肽的多核苷酸的宿主 细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。 启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变 的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外 或胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实 例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢 杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽 孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、 枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶 基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the  National Academy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等, 1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins  from recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94 中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的 实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉 酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉 TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶 样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria (WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉脂肪酶、曼赫根 毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏 木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、 里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶 V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及 NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基 因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译 的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自在黑曲霉中编码 中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉和米曲霉中编码丙 糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和 杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶 (ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱 氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫 蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启 动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转 录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可 以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻 氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀 粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化 酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母 宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻 译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的 5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉 TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇 化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱 氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地 连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录 的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米 曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰 孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol. Cellular Biol.15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽， 并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包 含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在 翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源 的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编 码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽 编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细 胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号 肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆 菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、 嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外 的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的 信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀 粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂 肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的 基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多 肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原 (zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割 从前多肽转化为活性多肽。前肽编码序列可从如下酶的基因获得：枯草芽孢 杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶 (WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接 着(next to)多肽的N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽 的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节 化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac 和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状 真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子 和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序 列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二 氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在 这些情况下，编码多肽的多核苷酸可与调节序列可操作地连接。

表达载体

多种核苷酸和上述调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述 表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入 或取代编码多肽(例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，纤维素分解酶， 半纤维素分解酶等)的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达 的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。 在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适 当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重 组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体 与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体， 其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体 (minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段 (means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并 且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或 质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整 DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

所述载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转 化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗 性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因， 或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉 素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、 MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于 amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin) 乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、 pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC (硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它 们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG 基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细 胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或 用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体 可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染 色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足 够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000 碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。 整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外， 整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同 源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的 宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子 (replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指 能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、 pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒 pUB110、pE194、pTA1060和pAMB1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4, ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等, 1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于 WO00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核 苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入 宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通 过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基 因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的 (参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

包含编码多肽(例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、纤维素分解 酶、半纤维素分解酶等)的多核苷酸的重组宿主细胞可有利地用于多肽的重组 产生。将包含此种多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使载体如前所述 作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包 括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。 宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真 核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细 菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌 属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰 氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、 螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解 淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、 坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、 酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉 菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化 (参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感 受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或 Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例 如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如， Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将 DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J. Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例 如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha) 49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171: 3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电 穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参 见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过 如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural  competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32: 1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68: 189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65: 3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然 而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门 (Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门 (Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定 义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和 所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母 (ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母 (basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲 (Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言， 将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和 Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、 毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克 鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和 卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。 丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、 甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而 碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞 菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属 (Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、 隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、 新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射 脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜 热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲 霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis  aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis  pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌 (Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、 Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、 Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰 盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰 孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、 尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫 色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米 黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete  chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、 土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、 哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方 法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023，Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474和Christensen 等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法 由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下 文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I. 编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153: 163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。

产生方法

产生多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、纤维素分解酶、 半纤维素分解酶等的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞， 所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优 选的方面，所述细胞是曲霉属细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是烟曲 霉。

或者，产生多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、纤维素 分解酶、半纤维素分解酶等的方法包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养 重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

在产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养 基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽 的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包 括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合 适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适 的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型 培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述 培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些 检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如， 酶试验(enzyme assay)可用于测定多肽的活性。具有纤维素分解增强活性的多 肽是使用本文中所述的方法检测的。

所得的培养液可按原样使用或可以使用本领域已知的方法回收多肽。例 如，可以通过常规方法从营养培养基中回收多肽，所述常规方法包括但不限 于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述 方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、 电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉 淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars  Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。

在可选的方面，不回收多肽，而将表达多肽的宿主细胞用作多肽的来源。

下述非限定性实施例进一步说明依照本公开的组合物、方法和处理。应 注意本公开并不限于实施例中体现的具体细节。

实施例

实施例1：酯酶用于对经预处理的纤维素材料的解毒。

经预处理的纤维素材料

玉米秸秆在U.S.Department of Energy National Renewable Energy  Laboratory(NREL)使用稀硫酸预处理。根据NREL，经预处理的玉米秸秆(PCS) 中的水不溶性固体含有57.5%纤维素，7.0%半纤维素和27.2%木质素，其根 据NREL Laboratory Analytical Procedure(LAP)“Determination of Structural  Carbohydrates and Lignin in Biomass”确定。PCS的总固体(TS)为28.9%，而不 溶性固体的级分(FIS)，作为总固体中不溶性固体的级分(%，w/w)，为61.5%。 TS和FIS基于NREL LAP“Determination of Total Solids in Biomass and Total  Dissolved Solids in Liquid Process Samples”确定。

预处理液剂的收集

从酸性、经蒸汽爆炸的玉米秸秆收集液剂。将PCS在环境温度混合下在 水中制浆至15wt%的终总固体(TS)水平，并通过藉由玻璃纤维滤器(Whatman  GF/D)的真空过滤收集液剂。在实验之前，将pH调整至5.0。

经洗涤的PCS

经洗涤的PCS(wPCS)通过彻底洗涤PCS直至滤过物呈现中性pH而获 得。

用酯酶对PCS液剂进行解毒

在50mL玻璃烧瓶中，pH5.0条件下在用下述以100ppm(酶溶液中的蛋 白对液剂)的下述酶将20mL体积的PCS液剂处理16小时：(1)来自腐质霉 属的阿魏酸酯酶(FAE)，(2)来自黑曲霉的FAE(SEQ ID NO:133)，(3)来自米 曲霉的FAE(SEQ ID NO:134)，(4)来自球毛壳菌的FAE(SEQ ID NO:135)或 (5)来自米曲霉的酯酶(SEQ ID NO:136)。

在解毒的经预处理的液剂存在下wPCS的水解

在24孔(5mL)聚丙烯细胞生长板(Whatman Uniplate)中，在75mmol/L乙 酸缓冲液中以及经酶解毒的经处理的液剂以及对应的对照(未经处理的液剂) 存在下进行wPCS的酶水解。将2.5g量的8%wPCS浆料(pH预调整至5并 预混于150mmol/L乙酸缓冲液中)与2.5mL的经酶解毒的经处理的液剂和62 μL包含里氏木霉纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的橙橘嗜热子囊菌 GH61多肽(WO2005/074656A2)，以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)混合，至终浓度为5mg蛋白/g纤维素。将4%TS的水解反应在 50℃在振荡下(150rpm)温育120小时。所有报道的实验进行一式三次。

葡萄糖产率确定

在水解之后，将样品使用0.20μm注射器式滤器(Millipore，Bedford，MA， USA)过滤，并如下所述对滤过物分析糖含量。当不立即使用时，将过滤的等 分试样冻结于-20℃。使用4.6x250mmHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)，通过用0.005M H₂SO₄在65℃以 0.6ml每分钟的流速洗脱来测量稀释于0.005M H₂SO₄的样品的糖浓度，并通 过对来自折射率检测(，1100HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)、通过纯糖样品校正的葡萄糖、纤维二 糖和木糖信号积分来进行定量。使用所得的葡萄糖和纤维二糖当量计算每个 反应的纤维素转化百分比。

分别测量葡萄糖、纤维二糖和木糖。测得的糖浓度针对合适的稀释因子 进行调整。在所述情况下，通过针对在零时点时对应的背景糖浓度来调整测 得的糖浓度，确定酶产生的糖的净浓度。所有的HPLC数据处理使用 MICROSOFT EXCEL^TM软件(Microsoft，Richland，WA，USA)进行。

纤维素转化为葡萄糖的程度使用下述公式计算：%葡萄糖产率=葡萄糖 浓度/限制消化中的葡萄糖浓度。

限制消化中的葡萄糖浓度通过考虑经预处理的材料的组分分析，不溶性 固体，和水解中的液体体积来确定。其使用下述公式：

限制消化中的葡萄糖浓度=[经预处理的生物质的重量x%经预处理的 生物质中的不溶性固体x%纤维素x1.111x0.1]/[水解中浆料的重量-水解 中的总固体]。

所述1.111因子考虑了当纤维素转化为葡萄糖时的质量增加。0.1因子是 为了将%换算为g/L。在分母中，我们有水解中液剂的重量，且若假定密度为 1，其为含有糖(sugars)的水解液剂的体积。将两次重复数据点取平均值并计 算标准偏差。

结果

在经本公开的酯酶处理的PCS液剂存在下，wPCS的酶水解的改善呈现 于表1(在经酯酶处理的PCS液剂的存在下，以5mg蛋白/g纤维素在4%TS wPCS，pH5.5和50℃进行120小时的wPCS的水解)。

表1

应理解的是，可对本文中公开的实施方案进行多种修饰。因此，上述描 述不应视作限制性的，但仅为实施方案的示例。本领域技术人员会想到所附 权利要求的范围和精神内的其它修饰。