CTx在制备诊断结直肠癌药物中的用途

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种细胞外基质组分I型胶原的羧基端肽CTx在制备诊断结直肠癌药物中的用途。本发明提供CTx在制备诊断结直肠癌药物、筛选诊断结直肠癌药物、以及筛选治疗结直肠癌药物中的用途。本发明选取结直肠癌组织、血清临床标本，研究I型胶原及CTx在结直肠癌发生发展以及分期预后等方面的临床价值。通过大量实验，本发明发明人发现CTx在不同分期结直肠癌病人血清中，表达水平的变化与病理分期呈现正相关，且CTx与现有消化道肿瘤癌胚抗原相比较，能够更好的区分转移与非转移结直肠癌病人。此外，发明人还发现CTx与结直肠癌病人3年无瘤生存率相关，其高表达预示着结直肠癌病人3年无瘤生存预后不良。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种细胞外基质组分I型胶原的羧基端肽CTx在 制备诊断结直肠癌药物中的用途。

背景技术

胶原作为细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的最主要成分之一，在大多数结缔组 织中对于维持ECM的结构稳定性起着重要作用，与许多纤维性疾病如肝纤维化等相关（Lai, K.K.,Shang,S.,Lohia,N.,etc.Extracellular matrix dynamics in hepatocarcinogenesis:a  comparative proteomics study of PDGFC transgenic and Pten null mouse models.PLoS Genet., 2011,7(6):e1002147.）。近来的报道也指出胶原对于肿瘤细胞的侵袭与转移也非常重要（Sund, M.,Kalluri,R.Tumor stroma derived biomarkers in cancer.Cancer Metastasis Rev.,Jun,2009,28 (1-2):177-83.）。目前已报道在人体内共有28种胶原存在或者可能存在，而其中I型胶原是 人体内含量最多分布最广的一种胶原。

I型胶原是由两条α1链以及一条α2链形成的三股螺旋结构，一般由成纤维细胞合成，作 为肿瘤微环境的一部分，在肿瘤细胞增殖、转移过程中发挥重要作用。在结直肠癌研究中发 现，I型胶原高表达于呈现浸润生长的肿瘤细胞中（Oku Y,Shimoji T,Takifuji K,etc. Identification of the molecular mechanisms for dedifferentiation at the invasion front of colorectal  cancer by a gene expression analysis.Clin Cancer Res,2008,14:7215–7222.）。在体外细胞系中 能降低E-cadherin和β-catenin表达使细胞与细胞间粘附下降，促使细胞出现干细胞样表型（SC  Kirkland.Type I collagen inhibits differentiation and promotes a stem cell-like phenotype in human  colorectal carcinoma cells.Br J Cancer.2009,101(2):320-6.），并且能降低Cdx2表达从而抑制 细胞分化（Brabletz,T.,Spaderna,S.,Kolb,J.,etc.Down-regulation of the homeodomain factor  Cdx2in colorectal cancer by collagen type I:an active role for the tumor environment in malignant  tumor progression.Cancer Res.,2004,64(19):6973-7.）。此外，I型胶原能通过与a2β1integrin 作用促进胰腺癌细胞的恶性转变（Grzesiak J,Bouvet M.The a2β1integrin mediates the  malignant phenotype on type I collagen in pancreatic cancer cell lines.Br J Cancer,2006,94: 1311–1319），同时也是17个与肿瘤转移密切相关的基因之一（Ramaswamy S,Ross KN,Lander  ES,etc.A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.Nat Genet.2003, 33(1):49-54.）。尽管上述在细胞模型中I型胶原对肿瘤的作用已被广泛研究，但目前对于I 型胶原自身在恶性肿瘤组织中的表达研究较少。

当发生基质重构（ECM remodeling）时，I型胶原会发生降解，其N端及C端的端肽 （N-telopeptides and C-telopeptides）会释放到血液中。CTx就是I型胶原C端端肽上一段8 个氨基酸的片段（EKAHDGGR），能够作为I型胶原降解的指标在血清中通过ELISA进行 检测（Bonde,M.,Garnero,P.,Fledelius,C.,etc.Measurement of bone degradation products in  serum using antibodies reactive with an isomerized form of an8amino acid sequence of the  C-telopeptide of type I collagen.J Bone Miner Res,1997,12(7):1028-34.）。对于CTx的研究在 骨病理学中研究较多，而且CTx也是目前作为判断骨吸收（Bone resorption）比较好的一个 生物标志物（Rosen,H.N.,Moses,A.C.,Garber,J.,etc.Serum CTX:a new marker of bone  resorption that shows treatment effect more often than other markers because of low coefficient of  variability and large changes with bisphosphonate therapy.Calcif Tissue Int,2000,66(2):100-3. Marx,R.E.,Cillo,J.E.,Jr.,Ulloa,J.J.Oral bisphosphonate-induced osteonecrosis:risk factors, prediction of risk using serum CTX testing,prevention,and treatment.J Oral Maxillofac Surg,2007, 65(12):2397-410.）。目前关于其与肿瘤相关性的报道中，血液中CTx的上调在乳腺癌（Cloos, P.A.,Christgau,S.,Lyubimova,N.,etc.Breast cancer patients with bone metastases are  characterised by increased levels of nonisomerised type I collagen fragments.Breast Cancer Res, 2003,5(4):R103-9.）、前列腺癌（Garnero,P.,Buchs,N.,Zekri,J.,etc.Markers of bone turnover for  the management of patients with bone metastases from prostate cancer.Br J Cancer,2000,82(4): 858-64.）以及肺癌（Leeming,D.J.,Koizumi,M.,Byrjalsen,I.,etc.The relative use of eight  collagenous and noncollagenous markers for diagnosis of skeletal metastases in breast,prostate,or  lung cancer patients.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2006,15(1):32-8.）骨转移病人中都有 报道。但是除了作为判断肿瘤骨转移的标准，CTx在其它的肿瘤发展进程中以及结直肠癌诊 断预后等方面的临床价值并未见报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种细胞外基质组分I型胶原的 羧基端肽CTx在制备或筛选诊断结直肠癌药物中的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供CTx在制备诊断结直肠癌药物、 筛选诊断结直肠癌药物、以及筛选治疗结直肠癌药物中的用途。

所述筛选诊断结直肠癌药物具体指使用CTx，对可能作为诊断结直肠癌药物使用的物质 进行生物活性、药理作用及药用价值的评估。

所述筛选治疗结直肠癌药物具体指使用CTx，对可能作为治疗结直肠癌药物使用的物质 进行生物活性、药理作用及药用价值的评估。

本发明中的CTx为I型胶原α1链羧基端的8个氨基酸肽段，其氨基酸序列为EKAHDGGR （Seq ID No.1）。当处于某些生理或病理状态下细胞发生基质重构时，胞外基质中的I型胶 原会发生降解，其N端和C端的端肽会释放到血液中，所述CTx为I型胶原降解时所释放的 I型胶原C端端肽片段之一。

优选的，所述诊断结直肠癌具体指对结直肠癌术前诊断分期或对结直肠癌预后判断。（主 要有助于在手术前不需要通过病理检测即可对分期有预见性判断）

按照并根据国际抗癌联盟（UICC）和美国肿瘤联合会（AJCC）联合制定的TNM （tumor-node-metastasis）分期法，结直肠癌可分为I-IV期四个阶段，所述结直肠癌分期具体 指区分结直肠癌按照所述TNM分期法处于哪个阶段。

所述对结直肠癌预后判断具体指对结直肠癌病人的病程和结局进行预后判断，更具体为 对结直肠癌病人的无瘤生存率进行预后判断。

优选的，所述结直肠癌为人结直肠癌。

优选的，所述CTx为生物标志物。

更优选的，所述CTx为血清生物标志物。

优选的，所述CTx为基质重构时I型胶原降解时所释放的I型胶原C端端肽片段。

更优选的，所述I型胶原来源于人。

由于在临床诊断学上I、II期属于结直肠癌的早期阶段，此时若发现肿瘤大多可以通过手 术切除得到治愈，III期病人已经开始发现淋巴结转移，IV期病人发生远端转移，四个时期五 年存活率依次降低、愈后复发率递增。由于CTx正可作为早期特异生物标志物，其发现对于 结直肠癌的预测预后有重要意义。

本发明第二方面提供一种诊断结直肠癌用生物标志物，所述生物标志物为CTx，所述CTx 的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

优选地，所述生物标志物为血清生物标志物。

优选的，所述诊断结直肠癌具体指对结直肠癌术前诊断分期或对结直肠癌预后判断。

优选的，所述结直肠癌为人结直肠癌，所述生物标志物CTx为基质重构时I型胶原（人 源）降解时所释放的I型胶原C端端肽片段。

本发明选取结直肠癌组织、血清临床标本，研究I型胶原及CTx在结直肠癌发生发展以 及分期预后等方面的临床价值。通过大量实验，本发明发明人发现CTx在不同分期结直肠癌 病人血清中，表达水平的变化与病理分期呈现正相关，且CTx与现有消化道肿瘤癌胚抗原 （Carcinoembryonic antigen，CEA）相比较，能够更好的区分转移与非转移结直肠癌病人。此 外，发明人还发现CTx与结直肠癌病人3年无瘤生存率相关，其高表达预示着结直肠癌病人 3年无瘤生存预后不良。

此外，本发明中发明人进一步提供了生成CTx这个端肽的蛋白I型胶原在结直肠癌组织 中表达情况，为深入了解细胞外基质在结直肠癌发生发展过程中的作用提供参考依据，并由 此发现，生成CTx这个端肽的蛋白I型胶原的表达水平的变化与病理分期并无明显相关性， 由此进一步证实了CTx在制备诊断结直肠癌药物中的应用价值。

附图说明

图1表示I型胶原在不同分期结直肠癌组织mRNA水平的表达。

图2表示I型胶原在不同分期结直肠癌组织蛋白水平的表达。

图3表示I型胶原在不同分期结直肠癌组织免疫组化染色结果。

图4表示I型胶原降解指标CTx及随机降解小片段COL1在正常及不同分期结直肠癌病 人血清中ELISA检测。

图5表示CTx与CEA相比可更好区分转移与非转移结直肠癌病人。

图6表示CTx与结直肠癌病人3年无瘤生存率相关，其高表达预示着结直肠癌病人3年 无瘤生存预后不良。

图7表示CTx与结直肠癌病人3年无瘤生存率相关，其表达量与结直肠癌病人3年无瘤 生存率呈负相关关系。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指 出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常 规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor  Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN  MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series  METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN  STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS  IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic  Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin  Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

发明人在前期结直肠癌蛋白质组学工作中发现，I型胶原在不同分期结直肠癌病人血清中 高表达，表明I型胶原可能与结直肠癌密切相关。发明人在不同分期结直肠癌组织中发现了I 型胶原的高表达，并进一步在血清中检测I型胶原不同片段在不同分期结直肠癌病人中的表 达，发现其羧基端降解端肽CTx与结直肠癌病人分期及预后相关，在此基础上完成了本发明。 一、I型胶原在组织中的检测

实施例1：不同分期结直肠癌病人样本及正常样本的收集

2009年5月至2010年5月，我们共收集91例结直肠癌病人的组织和血清样本（病人已 通过组织病理学检测明确诊断其患结直肠癌，并根据国际抗癌联盟（UICC）和美国肿瘤联合 会（AJCC）联合制定的TNM（tumor-node-metastasis）分期法确定了病理分期，其中I期21 人，II期41人，III期22人，IV期7人，所有病人均进行了腹腔镜手术治疗），同时收集了 33例无消化道疾病和炎症性疾病的健康人体血清样本。所有病人在术后的前2年内每3个月 进行跟踪回访，术后第3年每6个月进行跟踪回访，至术后第41个月停止，记录病人的复发 或死亡时间点。病人临床信息如表1所示。

表1病人临床信息

^a AC,升结肠;TC,横结肠;DC,降结肠;SC,乙状结肠;RC,直肠;

实施例2：I型胶原在不同分期结直肠癌组织RNA及蛋白水平的表达

1、组织RNA提取及实时荧光定量PCR（Realtime PCR）检测：

我们提取了肿瘤组织和相应正常结直肠组织的总mRNA，并分别检测了其I型胶原的 mRNA表达水平。以Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取组织的总mRNA，使用Takara公司 的PrimeScript RT reagent Kit试剂盒从2mg的RNA反转录合成20ml cDNA，使用Applied  Biosystems公司的7500实时荧光定量PCR仪和相应SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进 行实时荧光定量PCR（采用2-△△Ct分析法分析表达丰度，GAPDH作为内参基因）。PCR反 应使用的引物序列如表2所示。（结果如图1和表3所示）

表2PCR反应使用的引物序列

2、组织蛋白提取及蛋白印迹法（Western Blot）检测

为进行肿瘤组织和正常结直肠组织的蛋白表达分析，将冷冻的组织样本100mg加入RIPA 裂解液（50mM Tris-HCl(pH7.4),0.4wt%sodium deoxycholate,150mM NaCl,1wt%Triton,1 mM PMSF）后在冰上进行约30分钟均浆破碎和裂解，之后在4℃、16,000×g条件下离心30 分钟，用BCA方法进行溶液的蛋白定量。使用β-actin作为上样定量内参，将各样本的等量 蛋白(50mg/条带)进行8wt%SDS-PAGE电泳分离，之后转移至GE公司的硝酸纤维素膜上， 封闭后使用一抗4℃孵育过夜（anti-collagen I(1:5000,ab34710;Abcam)。免疫反应阳性条带使 用Li-COR公司Odyssey Infrared Imaging System进行观察和拍照，并使用Quantity One进行 定量。（结果如图2）

3、组织免疫组化检测

3–5mm的组织石蜡切片使用4wt%胃蛋白酶于37℃反应20min，进行抗原修复，之后与 一抗4℃反应过夜(anti-collagen I，1:500，ab34710；Abcam)，使用DAKO公司的Envision  detection system进行观察和拍照。（结果如图3）

4、结果分析

表3I型胶原在不同分期结直肠癌组织的实时荧光定量PCR检测结果原始数据

样品编号 病理分期 COL1A1（肿瘤/正常） COL1A2（肿瘤/正常） 88 I 17.09 5.99 51 I 3.04 1.81 74 I 3.01 1.57 101 I 1.81 1.12 72 I 1.69 0.91 116 I 266.35 30.92 67 II 124.16 33.06 48 II 113.29 32.96 79 II 16.42 10.02 59 II 15.11 7.22 84 II 11.31 7.03 75 II 7.61 4.91

47 II 7.11 1.04 55 III 18.33 14.49 17 III 4.81 3.22 68 III 4.36 2.93 82 III 3.18 2.00 62 III 1.91 1.86 39 III 1.34 1.74 81 III 1.14 0.98 94 IV 3.43 3.34 61 IV 1.21 1.58 53 IV 1.27 1.04 103 IV 0.94 0.59 44 IV 1.41 0.44

从表3和图1，图2的结果可见，无论在mRNA水平还是蛋白水平，在各期结肠癌肿瘤 组织中I型胶原表达均比正常组织高，说明当癌症发生时I型胶原在肿瘤组织中确实是上调 表达。但是，从图1和图2的结果中可看出，I型胶原在非转移期（I期和II期）比转移期（III 期和IV期）肿瘤组织中高表达，尤其是在蛋白水平上，具有显著性差异（p<0.05）。

I型胶原表达在II期肿瘤组织中表达最高，在蛋白水平上，COL1A1以及COL1A2其肿 瘤组织与正常组织比值分别达到22.54和7.19倍。在临床诊断学上I、II期属于早期阶段，此 时若发现肿瘤大多可以通过手术切除得到治愈，III期病人已经开始发现淋巴结转移，IV期病 人发生远端转移，四个时期五年存活率依次降低、愈后复发率递增。因此，在临床中早期阶 段，尤其是II期在结直肠癌的发展过程中是个关键阶段，临床分期诊断生物标志物的发现有 助于预测预后，在临床应用中具有重要意义。此外，一些II期高表达的蛋白很可能与肿瘤细 胞的侵袭性迁移有关。

二、CTx在血清中的检测

实施例3：I型胶原降解指标CTx及随机降解小片段COL1在正常及不同分期结直肠癌病人血 清中ELISA检测：

1、ELISA检测试剂盒及方法

血清中的COL1和CTx水平可使用商业试剂盒(Uscn Life Science&Technology Co., Houston,TX,USA)进行ELISA检测，血清CTx使用线性EKAHDGGR肽段（I型胶原的α1 链羧基端肽的片段）的特异单克隆抗体进行竞争性抑制ELISA检测，简而言之，就是生物素 标记的合成CTx肽段和血清中未标记的CTx与预先包被好的特异CTx抗体进行竞争性抑制 反应，每个反应微孔中加入辣根过氧化物亲和素，孵育，具体检测方法参照试剂盒说明书。 加入底物溶液后，反应混合液的颜色与血清中CTx的浓度呈负相关。血清中CEA水平使用 商业试剂盒进行检测（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany），具体检测方法参照试剂盒说 明书。

2、检测结果分析

CTx从I期到IV期的平均血清含量分别为2.19,3.16,3.58和4.58ng/ml，其表达水平的 变化与结直肠癌的病理分期呈现正相关关系。晚期癌症（III+IV期）中CTx的水平显著高于 早期癌症（I+II期）中CTx的相应水平（p=0.003,Mann–Whitney U test）。（结果如图4）

3、CTx与结直肠癌分期及预后关系分析

由于CTx与结直肠癌的病理分期间存在良好的正相关，而分期与癌症病人的早期诊断、 治疗效果及预后信息都密切相关，因此我们进而对CTx进行了受试者操作特征曲线（Receiver  operating characteristic，ROC）以及3年无瘤生存率分析（Disease-free survival，DFS），用 以对CTx潜在的临床价值做出评估。结果可看出，CTx对于早期、晚期病人的区分效果（AUC: 0.696）要优于CEA的区分效果（AUC:0.584）。（结果如图5）

此外我们评估了CTx与结直肠癌无瘤生存之间的联系，以所有患者CTx的平均值 4.08ng/ml为界，将病人分为两组。Kaplan-Meier生存分析结果显示，CTx的高表达组3年无 瘤生存率明显低于另一组（log rank test,p=0.006），将CTx进行Cox比例风险模型分析也说 明CTx能够为结直肠癌病人的预后判断提供重要信息。(结果如图6)

进一步的，将受试者按CTx的血清含量分为3组，分别为0<CTx≤2，2<CTx≤4，4<CTx； （log rank test,p=0.022），Kaplan-Meier生存分析结果显示，随着CTx表达浓度的逐渐提升， 结直肠癌病人的3年无瘤生存率逐渐降低，两者呈现负相关关系，进一步证实了CTx能够为 结直肠癌病人的预后判断的重要价值。（结果如图7所示）

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技 术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡 所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等 效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。