一种用于脂溶性农药残留非竞争检测的肽配体制备方法

摘要

本发明公开了一种用于脂溶性农药残留非竞争检测的肽配体制备方法。先将β-环糊精（β-CD）与牛血清白蛋白（BSA）偶联，偶联产物产物包被固相载体用于包合毒死蜱；再采用“正负交替筛选”策略对商业化的噬菌体展示多肽库进行四轮筛选；从第四轮筛选洗脱产物中分离挑选出单个噬菌体克隆，并利用ELISA方法鉴定出能够特异识别“β-CD-农药”复合物的噬菌体克隆；最后对所鉴定出的噬菌体克隆进行测序以确定其有多肽片段插入并获得多肽的氨基酸序列信息。本发明的优点是：不需对检测对象进行分子改造；所获得的肽配体可用于构建农药残留的非竞争检测模式。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于脂溶性农药残留非竞争检测的肽配体制备方法，属于生物技术领域和分析检测技术领域。

背景技术

农药残留问题是被广泛关注的食品安全和环境安全问题之一，对其进行控制的前提是建立有效的检测技术体系。利用快速检测方法对食品或环境中可能存在的农药残留对象进行初筛，被国内外同行公认为是农药残留检测体系中的重要一环。虽然针对农药残留免疫学快速检测开展了许多的研究，但至今其实际应用的实例并不多。抗体制备过程繁琐、分析检测模式单一，是限制农药残留免疫检测技术发展的主要瓶颈因素。针对农药分子进行抗体制备时必须先根据靶标分子设计一系列半抗原，然后再将其与载体蛋白偶联进行抗体制备，最后再筛选出最佳的抗体，这使得抗体制备过程极为繁琐，并且成本极高。虽然有学者提出利用计算机模拟来辅助设计半抗原，但其效果仍然有限。由于农药小分子抗原表位单一，现有的农药残留免疫检测主要采用竞争检测模式，但该检测模式需要多步孵育，过程较为繁琐。此外，理论研究也早已表明，竞争免疫检测模式与非竞争模式相比，在检测灵敏度、精确度以及检测线性范围等方面要存在许多不足。基于以上背景，研究农药小分子高质量抗体的制备、探索构建农药残留非竞争检测模式是改进农药残留快速检测的重要突破口。

环糊精（Cyclodextrin）是由6~8个葡萄糖分子以糖苷键结合而成的闭环低聚物，呈“外亲水，内疏水”的圆筒形立体结构，能以其内部空间包合脂溶性分子形成超分子复合物。在建立金属离子的免疫检测技术时，一般是将金属离子与螯合剂——乙二胺四乙酸（EDTA）结合形成复合物后，再偶联至载体蛋白用于抗体制备，即制备针对“EDTA-金属离子”复合物的特异性抗体。由此启发，在农药残留的免疫检测中也可制备针对“环糊精-农药”复合物的特异性抗体。该思路只需制备“环糊精-载体蛋白”偶联产物就可以用于所有可包合农药分子的抗体制备，免除了复杂而繁琐的半抗原设计、合成、偶联等过程。针对小分子半抗原难以建立非竞争检测模式的问题，国内外学者开展了许多卓有成效的工作，并提出了许多相应的检测模式。但这些检测模式都仍需制备农药分子的特异性抗体，并且同时还需要制备其它特殊的抗体或抗体片段。若获得针对“环糊精-农药”复合物的特异性抗体，则也可建立针对农药分子的非竞争检测模式。

采用传统的多克隆抗体或单克隆抗体制备技术来进行“环糊精-农药”复合物的抗体制备存在许多的困难。近年来，噬菌体展示技术作为一种体外筛选技术，已广泛应用于各类特异性抗体的制备。利用噬菌体展示技术制备抗体的过程中，通常需要先构建高容量的噬菌体展示抗体库，然而抗体库构建的过程通常较为繁琐，且高容量的要求通常难以达到。已有研究表明，一些非抗体的短肽类分子也具有类似于抗体的特异识别性能，并且已有一些商品化的噬菌体展示多肽库面市。利用商品化的噬菌体展示多肽库进行配体筛选，可省去复杂而繁琐的噬菌体抗体库构建过程，从而大大提高特异识别分子筛选与制备的效率。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明提供一种用于农药残留非竞争检测的肽配体制备方法。

一种用于脂溶性农药残留非竞争检测的肽配体制备方法，其特征在于，该方法借助环糊精对农药分子的包合效应，采用“正负交替筛选”策略在商业化的噬菌体展示多肽库中进行筛选，具体包括下列步骤：

（1）制备β-CD-BSA偶联物：将β-环糊精与牛血清蛋白进行偶联，制备出β-CD-BSA偶联物，并包被固相载体用于脂溶性农药的包合。

β-CD-BSA偶联物的具体制备过程是将0.5 g 牛血清蛋白（BSA）和0.3 gβ-环糊精（β-CD）溶解于50 mL硼酸盐缓冲溶液( 50 mmol/L pH = 8.7) 中，再加入0. 25 mL乙二醇二缩水甘油醚（EGDE），混合溶液在37 ^oC、200~300r/min条件下反应3~6 h；反应完成后将反应液冷却到室温，再用透析袋除去反应液中的盐及其它小分子，最后将除盐后的溶液冷冻干燥得到固体偶联产物，偶联效果采用常规SDS-PAGE电泳鉴定。

所述的固相载体是指6孔细胞培养板（康宁Costar），其材质为聚苯乙烯（PS）。

（2）噬菌体展示多肽库筛选：采用“正负交替筛选”策略对商业化的噬菌体展示多肽库进行四轮筛选。

第一轮筛选：用试剂盒说明书所述的0.1 M NaHCO₃（pH 8.6）缓冲液配制浓度为0.4~0.6 mg/mL的β-CD-BSA偶联物溶液，在6孔细胞培养板的两孔中各加入1.0~1.5 mL该溶液，4 ^oC包被过夜；次日，每孔加入2mL试剂盒说明书所述的封闭液，4 ^oC封闭2 h；然后，将10 μL试剂盒所提供的噬菌体展示多肽库与990 μL试剂盒说明书所述的TBST（0.1%）溶液混合，并加入到上述两孔中的其中一孔中（负筛选孔）；同时，将80~120nmol的农药与试剂盒说明书所述的TBS溶液混合，并加入至另一孔中（正筛选孔）；两孔同时在37 ^oC、300 r/min振荡条件下孵育1.5~2 h后，将正筛选孔中的样液除去，再将负筛选孔中的样液转移至正筛选孔；继续在37 ^oC、300 r/min的振荡条件下孵育1~1.5h后，除去样液，并用试剂盒说明书所述的TBST（0.1%）溶液洗涤正筛选孔10~15次；再于正筛选孔中加入1mL试剂盒说明书所述的0.2 M Glycine-HCl（pH 2.2，并含1 mg/mL的BSA）洗脱缓冲液；37 ^oC、300 r/min的振荡条件下洗脱10~15min后，将洗脱液转移至150 μL试剂盒所述的1 M Tris-HCl（pH 9.1）缓冲液中进行中和；按试剂盒说明书所述方法对中和后的洗脱液进行噬菌体低度测定；按试剂盒说明书所述方法对洗脱的噬菌体进行扩增和滴度测定，用于下一轮筛选。

第二~四轮筛选：后续轮次筛选与第一轮基本一致，区别之处在于，每轮所加入的噬菌体展示多肽库为前一轮洗脱产物扩增而得的扩增库，加入的噬菌体数量约为10¹¹ pfu；正筛选孔中农药的添加量逐轮降低；噬菌体展示多肽库在正向筛选孔中孵育的时间逐轮缩短；正向筛选孔的洗脱过程为，先用试剂盒说明书所述的TBST（0.5%）溶液洗涤，再用洗脱缓冲液快速洗涤，且洗涤次数逐轮增加。

上述农药的添加量逐轮降低的幅度、孵育的时间逐轮缩短幅度及洗涤次数逐轮增加幅度不等，只需依次满足逐轮降低、逐轮缩短及逐轮增加即可。

（3）噬菌体单克隆分离与鉴定：从第四轮筛选产物中分离挑选出单个噬菌体克隆，并利用ELISA方法鉴定出能够特异识别“β-CD-农药”复合物的噬菌体克隆。

ELISA鉴定方法如下：

取两块96孔酶标板，每孔加入100~200 μL浓度为0.4~0.6 mg/mL的β-CD-BSA偶联物溶液，4 ^oC包被过夜；

倾去β-CD-BSA偶联物溶液，每孔再加入100~200 μL试剂盒说明书所述的封闭液，4 ^oC封闭2 h；

将两块酶标板分别用“+”和“-”标记，标记为“+”的酶标板每孔加入200 μL用试剂盒说明书所述的TBS缓冲液配制的一定浓度的农药，标记为“-”的酶标板每孔加入200 μL试剂盒说明书所述的TBS缓冲液，两块酶标板同时在37 ^oC、300 r/min的条件下孵育2h；

倾去两块酶标板中的溶液，单个噬菌体克隆进行编号后将其扩增液分别对应加入倒“+”和“-”酶标板的孔中，每孔100 μL，37 ^oC、300 r/min的条件下孵育1h；

倾去两块酶标板中的溶液，用试剂盒说明书所述的TBST（0.1%）溶液洗板3次后，每孔加入100 μL HRP标记的抗M13二抗，37 ^oC、300 r/min的条件下孵育1h；

按常规ELISA方法显色、终止反应、读取OD₄₅₀。

分析ELISA数据，将在“+”孔和“-”孔中的OD₄₅₀读数比值大于2.1的噬菌体克隆定义为阳性克隆，即能够特异识别“β-CD-农药”复合物的噬菌体克隆。

（4）阳性克隆的测序：采用试剂盒说明书所述的步骤对所鉴定出的阳性克隆进行测序以确定其有多肽片段插入，并由测得的DNA序列翻译出氨基酸序列。

上述的商业化噬菌体展示多肽库是指Ph.D.-12 Library试剂盒 (New England BioLabs)。

本发明提供的用于脂溶性农药残留非竞争检测的肽配体制备方法，所带来的技术效果是：

1、通过SDS-PAGE电泳对β-CD-BSA偶联效果进行鉴定，其操作简便有效，与光谱鉴定法相比成本更低；

2、通过β-CD-BSA包合农药小分子，从而免除对农药小分子的改造和偶联等步骤；

3、采用噬菌体展示技术制备特异识别分子，其制备周期比传统的多抗和单抗制备技术大为缩短，并且一旦获得后可无限大量制备；

4、从商业化的噬菌体展示多肽中筛选肽配体，从而免除构建噬菌体展示库的复杂过程；

5、采用“正负筛选”策略，从而提高筛选效率，增大获得目标肽配体的机率；

6、在筛选过程中，对洗涤过程进行了改进，洗脱之前先用洗脱液进行快速洗涤，能除去亲和活性较弱的噬菌体克隆，使高亲和力的噬菌体克隆得到富集；

7、制备特异识别“β-CD-农药”复合物的肽配体，其能够用于构建农药残留的非竞争检测技术；

8、所提供的方法，易于实现高通量制备，即针对多种农药对象同时制备用于残留检测的肽配体。

附图说明

图1 用于脂溶性农药残留非竞争检测的肽配体识别原理；

图2 β-CD-BSA偶联效果的SDS-PAGE鉴定图；

图3每轮筛选的效率（噬菌体产出/投入比）；

图4 五个阳性克隆的ELISA鉴定结果；

图5 五个阳性克隆的氨基酸序列。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

毒死蜱是目前应用较为广泛的一种有机磷农药，其残留问题也受到重视。在以下的实施例中，发明人给出一种用于毒死蜱残留非竞争检测的肽配体制备方法，该方法在制备β-CD-BSA偶联产物的基础上，借助环糊精对毒死蜱的包合效应，采用“正负交替筛选”策略从商业化的噬菌体展示多肽库中筛选出能够特异识别“β-CD-毒死蜱”复合物的肽配体，并获得了其氨基酸序列。

具体按下列步骤操作：

首先制备β-CD-BSA偶联产物，制备过程为：将0.5 g BSA和0.3 g β-CD溶解于50 mL硼酸盐缓冲溶液( 50 mmol/L pH = 8.7) 中，再加入0. 25 mL EGDE，混合液在37 ^oC、250 r/min条件下反应4 h；反应完成后将反应液冷却到室温，再用透析袋除去反应液中的盐及其它小分子，最后将除盐后的溶液冷冻干燥得到固体偶联产物，产物经SDS-PAGE电泳鉴定后用于噬菌体展示筛选。筛选采用“正负交替筛选”策略，利用Ph.D.-12 Library试剂盒 (New England BioLabs)，共进行四轮筛选。第一轮筛选：用试剂盒说明书所述的0.1 M NaHCO₃（pH 8.6）缓冲液配制浓度为0.5 mg/mL的β-CD-BSA偶联物溶液，在6孔细胞培养板的两孔中各加入1.5 mL该溶液，4 ^oC包被过夜；次日，每孔加入2mL试剂盒说明书所述的封闭液，4 ^oC封闭2 h；然后，将10μL试剂盒所提供的噬菌体展示多肽库与990 μL 试剂盒说明书所述的TBST（0.1%）溶液混合，并加入到上述两孔中的其中一孔中（负筛选孔）；同时，将100 nmol的毒死蜱与试剂盒说明书所述的TBS溶液混合，并加入至另一孔中（正筛选孔）；两孔同时在37 ^oC、300 r/min振荡条件下孵育2 h后，将正筛选孔中的样液除去，再将负筛选孔中的样液转移至正筛选孔；继续在37 ^oC、300 r/min的振荡条件下孵育1h后，除去样除去，并用试剂盒说明书所述的TBST（0.1%）溶液洗涤正筛选孔10次；再于正筛选孔中加入1mL试剂盒说明书所述的0.2 M Glycine-HCl（pH 2.2，并含1 mg/mL的BSA）洗脱缓冲液；37 ^oC、300 r/min的条件下洗脱15min后，将样液转移至150 μL试剂盒所述的1 M Tris-HCl（pH 9.1）缓冲液中进行中和；按试剂盒说明书所述方法对中和后的洗脱液进行噬菌体低度测定；按试剂盒说明书所述方法对洗脱的噬菌体进行扩增和滴度测定，用于下一轮筛选。第二~四轮筛选：后续轮次筛选与第一轮基本一致，区别之处在于，每轮所加入的噬菌体展示多肽库为前一轮洗脱产物扩增而得的扩增库，加入的噬菌体数量约为10¹¹ pfu；正筛选孔中农药的添加量逐轮降低，依次为75、50、25 nmol；噬菌体展示多肽库在正向筛选孔中孵育的时间逐轮缩短，依次为45、30、15 min；正向筛选孔的洗脱过程为，先用试剂盒说明书所述的TBST（0.5%）溶液洗涤，再用洗脱缓冲液快速洗涤，且洗涤次数逐轮增加，TBST的洗涤次数依次为15、20、30次，洗脱液快速洗脱次数依次为2、4、6次。筛选结束后，从第四轮筛选产物中分离挑选出48个噬菌体单克隆，并利用ELISA方法鉴定出能够特异识别“β-CD-农药”复合物的噬菌体克隆。取两块96孔酶标板，每孔加入150 μL 浓度为0.5 mg/mL的β-CD-BSA偶联物溶液，4 ^oC包被过夜；倾去β-CD-BSA偶联产物溶液，每孔再加入200 μL试剂盒说明书所述的封闭液，4 ^oC封闭2 h；将两块酶标板分别用“+”和“-”标记，标记为“+”的酶标板每孔加入200 μL含20 nmol毒死蜱的试剂盒所述的TBS缓冲液，标记为“-”的酶标板每孔加入200 μL试剂盒说明书所述的TBS缓冲液，两块酶标板同时在37 ^oC、300 r/min的条件下孵育2h；倾去两块酶标板中的溶液，单个噬菌体克隆进行编号后将其扩增液分别对应加入倒“+”和“-”酶标板的孔中，每孔100 μL，37 ^oC、300 r/min的条件下孵育1h；倾去两块酶标板中的溶液，用试剂盒说明书所述的TBST（0.1%）溶液洗板3次后，每孔加入100 μL HRP标记的抗M13二抗，37 ^oC、300 r/min的条件下孵育1h；按常规ELISA方法显色、终止反应、读取OD₄₅₀。分析ELISA数据，将在“+”孔和“-”孔中的OD₄₅₀读数比值大于2.1的噬菌体克隆定义为阳性克隆，即能够特异识别“β-CD-毒死蜱”复合物的噬菌体克隆。对鉴定出的阳性克隆，按试剂盒说明书所述的步骤进行测序，并由测得的DNA序列翻译出氨基酸序列。

在本实施例中，用于脂溶性农药残留非竞争检测的肽配体识别原理如图1所示；β-CD-BSA偶联效果的SDS-PAGE鉴定结果如图2所示；针对毒死蜱的四轮噬菌体展示筛选效率如图3所示；针对毒死蜱的5个阳性克隆ELISA鉴定结果如图4所示；针对毒死蜱的5个阳性克隆氨基酸序列如图5所示。