结合B7-H1和PD-1的抗体和其他分子

摘要

本发明涉及能够与B7-H1或PD-1免疫特异性结合的抗体和它们的抗原结合片段和其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1或B7-DC与PD-1结合的能力或能够影响B7-H1或PD-1的信号传导活性。本发明另外涉及此类分子在癌症和其他疾病的诊断和治疗中的用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求美国专利申请号61/477,414（2011年4月20日提交；处 理中）的优先权，通过引用将该申请整体并入本文。

序列表的引用

本申请根据37C.F.R.1.821et seq.包括一个或多个序列表，其以纸质和 计算机可读介质两种形式被公开，并通过引用将该纸质和计算机可读公开 形式整体并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及能够与B7-H1或PD-1免疫特异性结合的抗体和它们的抗 原结合片段和其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1 或B7-DC与PD-1结合的能力或能够影响B7-H1或PD-1的信号传导活性。 本发明另外涉及此类分子在癌症和其他疾病的诊断和治疗中的用途。

相关领域的描述

A.细胞介导的免疫应答

人类和其他哺乳动物的免疫系统负责提供抗感染和疾病的保护。此保 护由体液免疫应答和细胞介导的免疫应答二者提供。体液应答导致能够识 别并中和外来靶标（抗原）的抗体和其他生物分子的产生。相比之下，细 胞介导的免疫应答包括通过T细胞活化巨噬细胞、天然杀伤细胞（NK） 和抗原特异性细胞毒性T-淋巴细胞，和响应于抗原识别释放多种细胞因子 （Dong,C.等人(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory  Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48）。

T细胞最佳介导针对抗原的免疫应答的能力要求两种不同的信号传导 互作（Viglietta,V.等人(2007)“Modulating Co-Stimulation,”Neurotherapeutics  4:666-675；Korman,A.J.等人(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer  Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339)。第一，已排列在抗原呈递细胞 （APC）表面的抗原必须被呈递至抗原特异性的幼稚CD4⁺T细胞。此呈 递通过T细胞受体（TCR）递送指导T细胞启动将对所呈递的抗原特异性 的免疫应答的信号。第二，通过APC和不同的T细胞表面分子之间的互 作介导的一系列共刺激和抑制信号，触发了T细胞的第一活化和增殖及最 后它们的抑制。因此，第一信号给予免疫应答的特异性而第二信号则用来 确定应答的性质、程度和持续时间。

免疫系统由共刺激和共抑制配体和受体严格控制。这些分子提供了用 于T细胞活化的第二信号并提供了正信号和负信号的平衡网络以最大化抗 感染的免疫应答同时限制对自身的免疫（Wang,L.等人（2011年3月7日） “VISTA,A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T  Cell Responses,”J.Exp.Med.10.1084/jem.20100619:l-16；Lepenies,B.等人 (2008)“The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,” Endocrine,Metabolic&Immune Disorders-Drug Targets8:279-288)。抗原呈 递细胞的B7.1（CD80）和B7.2（CD86）配体和CD4⁺T-淋巴细胞的CD28 和CTLA-4受体之间的结合特别重要（Sharpe,A.H.等人(2002)“The  B7-CD28Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126；Dong,C.等人(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res. 28(l):39-48；Lindley,P.S.等人(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting  CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev.229:307-321)。B7.1或B7.2 与CD28的结合刺激T细胞活化；B7.1或B7.2与CTLA-4的结合则抑制 此活化（Dong,C.等人(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory  Molecules,”Immunolog.Res.28(l):39-48；Lindley,P.S.等人(2009)“The  Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev. 229:307-321；Greenwald,R.J.等人(2005)“The B7Family Revisited,”Ann.Rev. Immunol.23:515-548）。CD28在T细胞的表面组成型表达（Gross,J.，等 人(1992)“Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor  CD28In The Mouse,”J.Immunol.149:380-388），而CTLA4的表达在T细胞 活化之后被快速上调（Linsley,P.等人(1996)“Intracellular Trafficking Of  CTLA4And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535-543）。由于CTLA4是较高亲和力的受体（Sharpe,A.H.等人(2002) “The B7-CD28Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126），结合首先启 动了T细胞的增殖（经由CD28）并随后抑制增殖（经由CTLA4的新生表 达），从而当增殖不再被需要时抑制该作用。

CD28受体的配体的进一步的研究已导致一组B7相关的分子（“B7超 家族”）的鉴定和表征（Coyle,A.J.等人(2001)“The Expanding B7 Superfamily:Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell  Function,”Nature Immunol.2(3):203-209；Sharpe,A.H.等人(2002)“The  B7-CD28Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126；Greenwald,R.J.等 人(2005)“The B7Family Revisited,”Ann.Rev.Immunol.23:515-548；Collins, M.等人(2005)“The B7Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol. 6:223.1-223.7；Loke,P.等人(2004)“Emerging Mechanisms Of Immune  Regulation:The Extended B7Family And Regulatory T Cells.”Arthritis Res. Ther.6:208-214；Korman,A.J.等人(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer  Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339；Flies,D.B.等人(2007)“The New B7s:Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,”J.Immunother.30(3): 251-260；Agarwal,A.等人(2008)“The Role Of Positive Costimulatory  Molecules In Transplantation And Tolerance,”Curr.Opin.Organ Transplant. 13:366-372；Lenschow,D.J.等人(1996)“CD28/B7System of T Cell  Costimulation,”Ann.Rev.Immunol.14:233-258；Wang,S.等人(2004) “Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28Family In Positive And Negative  Regulation Of T Lymphocyte Responses,”Microbes Infect.6:759-766)。目前具 有家族的几个已知成员：B7.1（CD80）、B7.2（CD86）、可诱导的共刺激 因子配体（ICOS-L）、程序性死亡-1配体（PD-Ll；B7-H1）、程序性死亡-2 配体（PD-L2；B7-DC）、B7-H3、B7-H4和B7-H6（Collins,M.等人(2005)“The  B7Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol.6:223.1-223.7； Flajnik,M.F.等人(2012)“Evolution Of The B7Family:Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30,Identification Of A New B7Family Member,B7H7,And Of B7's  Historical Relationship With The MHC,”Immunogenetics epub  doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2)。

B.B7-H1/PD1互作

1.B7-H1

B7-H1（PD-L1，CD274）是B7超家族的特别重要的成员，由于其关 键性地参与塑造对肿瘤的免疫应答（Flies,D.B.等人(2007)“The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,”J.Immunother.30(3):251-260；美 国专利号6,803,192；7,794,710；美国专利申请公布号2005/0059051； 2009/0055944；2009/0274666；2009/0313687；PCT公布号WO01/39722； WO02/086083）。B7-H1是约33kDa的1型跨膜蛋白。已推测其在特定事 件诸如妊娠、组织同种异体移植、自身免疫疾病和其他疾病状态诸如肝炎 期间抑制免疫系统中发挥主要作用。

B7-H1在不同的人和小鼠组织，诸如在该两种物种的心脏、胎盘、肌 肉、胎肝、脾、淋巴结和胸腺，和仅在小鼠中的肝、肺和肾中广泛表达 （Martin-Orozco,N.等人(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor  Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298）。在人中，B7-H1蛋白表达已 发现于人内皮细胞（Chen,Y.等人(2005)“Expression of B7-H1in  Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,”Nephron.Exp.Nephrol. 102:e81-e92；de Haij,S.等人(2005)“Renal Tubular Epithelial Cells Modulate  T-Cell Responses Via ICOS-L AndΒ7-Η1,”Kidney Int.68:2091-2102；Mazanet, M.M.等人(2002)“B7-H1Is Expressed By Human Endothelial Cells And  Suppresses T Cell Cytokine Synthesis,”J.Immunol.169:3581-3588）、心肌 （Brown,J.A.等人(2003)“Blockade Of Programmed Death-1Ligands On  Dendritic Cells Enhances T Cell Activation And Cytokine Production,”J. Immunol.170:1257-1266）、合胞滋养层（Petroff,M.G.等人(2002)“B7Family  Molecules:Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface,” Placenta23:S95-S101）、一些组织的定居巨噬细胞，或在已用干扰素（IFN） -γ或肿瘤坏死因子（TNF）-α活化的巨噬细胞中（Latchman,Y.等人(2001) “PD-L2Is A Second Ligand For PD-1And Inhibits T Cell Activation,”Nat. Immunol2:261-268）、和在肿瘤中（Dong,H.(2003)“B7-HI Pathway And Its  Role In The Evasion Of Tumor Immunity,”J.Mol.Med.81:281-287）。在小鼠 中，B7-H1蛋白表达发现于心脏内皮、胰腺的胰岛细胞、小肠和胎盘中 （Martin-Orozco,N.等人(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor  Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298）。

2.PD-1

程序性死亡-1（“PD-1”）是B7-H1和B7-DC的受体。PD-1是T细胞 调节因子的扩展的CD28/CTLA4家族的约31kD的I型跨膜蛋白成员 （Ishida,Y.等人(1992)“Induced Expression Of PD-1,A Novel Member Of The  Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon Programmed Cell Death,”EMBO J. 11:3887-3895；美国专利申请公布号2007/0202100；2008/0311117； 2009/00110667；美国专利号6,808,710；7,101,550；7,488,802；7,635,757； 7,722,868；PCT公布号WO01/14557）。与CTLA4相比，PD-1更广泛地 负调节免疫应答。

PD-1在经活化的T细胞、B细胞和单核细胞上表达（Agata,Y.等人(1996) “Expression Of The PD-1Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And  B Lymphocytes,”Int.Immunol.8(5):765-772；Yamazaki,T.等人(2002) “Expression Of Programmed Death1Ligands By Murine T Cells And APC,”J. Immunol.169:5538-5545）并在天然杀伤（NK）T细胞中处于低水平 （Nishimura,H.等人(2000)“Facilitation Of Beta Selection And Modification  Of Positive Selection In The Thymus Of PD-l-Deficient Mice,”J.Exp.Med. 191:891-898；Martin-Orozco,N.等人(2007)“Inhibitory Costimulation And  Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298）。

PD-1的胞外区由与CTLA4中等同的域具有23%同一性的单个免疫球 蛋白（Ig）V域组成（Martin-Orozco,N.等人(2007)“Inhibitory Costimulation  And Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298）。胞外IgV域 之后是跨膜区和细胞内尾部（tail）。细胞内尾部包含位于基于免疫受体酪 氨酸的抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）和基于免 疫受体酪氨酸的转换基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif）的 两个磷酸化位点，其表明PD-1负调节TCR信号（Ishida,Y.等人(1992) “Induced Expression Of PD-1,A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene  Superfamily,Upon Programmed Cell Death,”EMBO J.11:3887-3895；Blank, C.等人(2006年12月29日电子出版)“Contribution Of The PD-Ll/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion:An Update On Implications For Chronic  Infections And Tumor Evasion Cancer,”Immunol.Immunother. 56(5):739-745）。

已报道了能够与鼠（murine）PD-1免疫特异性结合的抗体（见，例如， Agata,T.等人(1996)“Expression Of The PD-1Antigen On The Surface Of  Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,”Int.Immunol.8(5):765-772)。

C.B7-H1和PD-1的互作

已发现B7-H1和PD-1的互作向T细胞和B细胞提供重要的负的共刺 激信号（Martin-Orozco,N.等人(2007)“Inhibitory Costimulation And  Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298）并行使细胞死亡诱 导因子的功能（Ishida,Y.等人(1992)“Induced Expression Of PD-1,A Novel  Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon Programmed Cell  Death,”EMBO J.11:3887-3895；Subudhi,S.K.等人(2005)“The Balance Of  Immune Responses:Costimulation Verse Coinhibition,”J.Molec.Med. 83:193-202）。

低浓度的PD-1受体和B7-H1配体之间的互作导致强烈抑制抗原特异 性CD8⁺T细胞的增殖的抑制信号的传递；在高浓度与PD-1的互作则不抑 制T-细胞增殖但显著减少多种细胞因子的产生（Sharpe,A.H.等人(2002) “The B7-CD28Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126)。已发现可溶 性B7-H1-Fc融合蛋白抑制T细胞增殖和由静息和先前被活化的CD4和 CD8T细胞二者，和甚至来自脐带血的幼稚T细胞的细胞因子产生 （Freeman,G.J.等人(2000)“Engagement Of The PD-1Immunoinhibitory  Receptor By A Novel B7Family Member Leads To Negative Regulation Of  Lymphocyte Activation,”J.Exp.Med.192:1-9；Latchman,Y.等人(2001) “PD-L2Is A Second Ligand For PD-1And Inhibits T Cell Activation,”Nature  Immunol.2:261-268；Carter,L.等人(2002)“PD-l:PD-L inhibitory pathway  affects both CD4(+)and CD8(+)T cells and is overcome by IL-2,”Eur.J. Immunol.32(3):634-643；Sharpe,A.H.等人(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126）。

B7-H1-PD-1互作导致G0-G1中细胞周期停滞但不会增加细胞死亡 （Latchman,Y.等人(2001)“PD-L2Is A Second Ligand For PD-1And Inhibits  T Cell Activation,”Nature Immunol.2:261-268；Carter,L.等人(2002) “PD-l:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+)and CD8(+)T cells and is  overcome by IL-2,”Eur.J.Immunol.32(3):634-643）。因此，当抗原刺激是弱 的或有限的时，B7-H1-PD-1复合具有拮抗B7-CD28信号的能力并在下调 T细胞应答中发挥关键作用。

由B7-H1和PD-1介导的信号转导是复杂的。两种分子另外都与其他 蛋白结合。B7-H1能够与B7-1（CD80）结合（Butte,M.J.等人(2008) “Interaction of PD-Ll and B7-1,”Molecular Immunol.45:3567-3572)；PD-1 能够与B7-DC（PD-L2）结合（Lázár-Molnár,E.等人(2008)“Crystal Structure  Of The Complex Between Programmed Death-1(PD-1)And Its Ligand  PD-L2,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)105(30):10483-10488）。B7-1与CD28 互作以递送在免疫应答的早期阶段中是重要的用于T细胞活化的共刺激信 号（Elloso,M.M.等人(1999)“Expression and Contribution of B7-1(CD80) and B7-2(CD86)in the Early Immune Response to Leishmania major  Infection,”J.Immunol.162:6708-6715）。B7-DC是T细胞的强的刺激因子， 增强T细胞增殖和IFN-γ产生。然而，其通过其与PD-1的互作还呈现对 免疫应答的抑制效应（Ishiwata,K.等人(2010年1月10日电子出版) “Costimulator Responses Induced by Nippostrongylus brasiliensis,”J.Immunol. 184:2086-2094）。微生物和肿瘤似乎利用PD-1和B7-H1以逃避被免疫系统 清除。与PD-1和B7-H1互作的不同的受体和配体的结合亲和力的不同已 被提出以提供疾病模型中PD-1和B7-H1的阻断的不同的功能结果（Butte, M.J.等人(2008)“Interaction of PD-Ll and B7-1,”Molecular Immunol. 45:3567-3572）。还暗示PD-1通路在慢性感染过程的免疫功能的损害（“T 细胞耗竭（T cell exhaustion）”）中发挥关键作用，且阻断PD-1功能能够 恢复许多T细胞功能（Rodríquez-García,M.等人(2010年11月19日) “Expression Of PD-Ll And PD-L2On Human Macrophages Is Up-Regulated  By HIV-1And Differentially Modulated By IL-10,”J.Leukocyte Biol.89: doi:10.1189/jlb.0610327:1-9）。

B7-H1和PD-1在抑制T细胞活化和增殖中的作用已表明这些生物分 子可能用作用于炎症和癌症治疗的治疗靶标。已提出使用抗-PD1抗体以治 疗感染和肿瘤并上调适应性免疫应答（见，美国专利申请公布号 2010/0040614；2010/0028330；2004/0241745；2008/0311117；2009/0217401； 美国专利号7,521,051；7,563,869；7,595,048；PCT公布号WO2004/056875； WO2008/083174）。相反地，已表明调节PD-1与B7-H1互作的因子（agent） 在上调或下调免疫应答中具有效用（见，美国专利号7,029,674；7,488,802； 美国专利申请公布号2007/0122378；2009/0076250；2009/0110667； 2009/0263865；2009/0297518；PCT公布号WO2006/133396）。同样，已 提出使用抗-B7-H1抗体以治疗感染和肿瘤并上调适应性免疫应答（美国专 利申请公布号2009/0055944；2009/0274666；2009/0317368；美国专利号 6,803,192；7,794,710；PCT公布号WO01/39722；WO02/086083）。

然而，尽管所有的此类进展，对能够调节B7-H1和PD-1之间的互作 的组合物仍有需求。本发明涉及此类组合物和它们治疗癌症和其他疾病和 病症的用途。

发明概述

本发明涉及能够与B7-H1或PD-1免疫特异性结合的抗体和它们的抗 原结合片段及其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1 与PD-1结合的能力或能够影响B7-H1或PD-1的信号传导活性。本发明另 外涉及此类分子在癌症和其他疾病的诊断和治疗中的用途。

详细地，本发明提供了包含与B7-H1或PD-1、且特别是人B7-H1或 人PD-1免疫特异性结合的抗体的抗原结合片段，优选以内源或转染的浓 度在活细胞表面表达的分子。本发明特别涉及此分子的实施方案，其中抗 原结合片段与B7-H1结合，且其中活细胞是肿瘤细胞、病原体感染的细胞 或抗原呈递细胞，和此分子的实施方案，其中抗原结合片段与PD-1结合 且其中活细胞是T细胞。

本发明涉及能够与B7-H1或PD-1免疫特异性结合的抗体和它们的抗 原结合片段和其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1 与PD-1结合的能力或能够影响B7-H1或PD-1的信号传导活性。本发明另 外涉及此类分子在癌症和其他疾病的诊断和治疗中的用途。

详细地，本发明提供了包含与B7-H1或PD-1、且特别是人B7-H1或 人PD-1免疫特异性结合的抗体的抗原结合片段，优选以内源或转染的浓 度在活细胞表面表达的分子。本发明特别涉及此分子的实施方案，其中抗 原结合片段与B7-H1结合，且其中活细胞是肿瘤细胞、病原体感染的细胞 或抗原呈递细胞，和此分子的实施方案，其中抗原结合片段与PD-1结合 且其中活细胞是T细胞。

本发明还涉及此类分子的实施方案，其中该分子是单克隆抗体、人抗 体、嵌合抗体或人源化抗体。本发明包括其中此类抗体是单特异性、双特 异性、三特异性或多特异性的实施方案。

本发明还涉及与B7-H1结合的此类分子或抗体的实施方案，且其中其 抗原结合片段包含6个CDR，其中CDR包含抗-B7-H1抗体1E12、1F4、 2G11、3B6和3D10的CDR的至少一个共有CDR和选自以下的所有剩余 CDR：

（A）抗-B7-H1抗体1E12的三条轻链和三条重链CDR；

（B）抗-B7-H1抗体1F4的三条轻链和三条重链CDR；

（C）抗-B7-H1抗体2G11的三条轻链和三条重链CDR；

（D）抗-B7-H1抗体3B6的三条轻链和三条重链CDR；或

（E）抗-B7-H1抗体3D10的三条轻链和三条重链CDR。

本发明还涉及与B7-H1结合的此类分子或抗体的实施方案，且其中其 抗原结合片段包含6个CDR，其中6个CDR是：

（A）抗-B7-H1抗体1E12的三条轻链和三条重链CDR；

（B）抗-B7-H1抗体1F4的三条轻链和三条重链CDR；

（C）抗-B7-H1抗体2G11的三条轻链和三条重链CDR；

（D）抗-B7-H1抗体3B6的三条轻链和三条重链CDR；或

（E）抗-B7-H1抗体3D10的三条轻链和三条重链CDR。

本发明还涉及此类抗体的实施方案，其中抗体与B7-H1结合并包含抗 体h3D10Var1、h3D10Var2、h3D10Var3、h3D10Var4、h3D10Var5、 h3D10Var6、h3D10Var7、h3D10Var8、h3D10Var9、h3D10Var10、h3D10 Var11、h3D10Var12、h3D10Var13或h3D10Var14的可变域。

本发明还涉及以上描述的分子或抗体的实施方案，其中分子或抗体与 PD-1结合，且其中抗原结合片段包含6个CDR，其中CDR包含抗-PD-1 抗体1E3、1E8和1H3的CDR的至少一个共有CDR和选自以下的所有剩 余CDR：

（A）抗-PD-1抗体1E3的三条轻链和三条重链CDR；

（B）抗-PD-1抗体1E8的三条轻链和三条重链CDR；或

（C）抗-PD-1抗体1H3的三条轻链和三条重链CDR。

本发明还涉及此类抗体的实施方案，其中6个CDR是：

（A）抗-PD-1抗体1E3的三条轻链和三条重链CDR；

（B）抗-PD-1抗体1E8的三条轻链和三条重链CDR；或

（C）抗-PD-1抗体1H3的三条轻链和三条重链CDR。

本发明还涉及此类抗体的实施方案，其中抗体与PD-1结合并包含抗 体h1H3Var1、h1H3Var2、h1H3Var3、h1H3Var4、h1H3Var5、h1H3Var 6、h1H3Var7、h1H3Var8、h1H3Var9、h1H3Var10、h1H3Var11、h1H3 Var12、h1H3Var13或h1H3Var14的可变域。

本发明还涉及以上描述的分子或抗体的实施方案，其中分子或抗体被 可检测地标记或包含缀合的毒素、药物、受体、酶、受体配体。

本发明还涉及以上所描述的分子或抗体的实施方案，其中该分子或抗 体：

（A）调节由B7-H1或PD-1介导的信号转导；

（B）减弱B7-H1与B7-H1受体结合的能力或减弱PD-1与PD-1配体 结合的能力；

（C）促进（agonize）B7-H1或PD-1介导的信号转导；

（D）介导T细胞增殖；或

（E）增强IFN-γ产生。

本发明还涉及包含治疗有效量的任何以上描述的分子或抗体和生理 上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本发明还涉及此药物组合物在癌 症、自身免疫疾病、传染病或影响T细胞数目或健康的疾病的治疗中的用 途。本发明还涉及此药物组合物的用途，其中治疗是预防性的，并在癌症、 自身免疫疾病、传染病或影响T细胞数目或健康的疾病的任何症状之前提 供，或用于移植易发生的病症的治疗。

本发明还涉及任何以上描述的分子或抗体用于通过测定受试者的细 胞关于它们与B7-H1或PD-1结合的能力，诊断受试者中的癌症、自身免 疫疾病（特别是移植物抗宿主病）、传染病（特别是慢性病毒疾病）或影 响T细胞数目或健康的疾病的用途。

本发明特别涉及此类分子、抗体和组合物的实施方案，其中B7-H1是 人B7-H1且PD-1是人PD-1。

本发明特别涉及用于诊断受试者中疾病（特别是癌症）的方法，包括 测定受试者的细胞关于它们与任何以上描述B7-H1结合分子结合的能力， 其中该方法提供了用于诊断受试者中疾病存在的细胞学分析。

本发明另外涉及用于诊断受试者中疾病（特别是影响T细胞数目和/ 或健康的疾病）的方法，包括测定该受试者的细胞关于它们与PD-1结合 分子结合的能力，其中该方法提供了用于诊断受试者中疾病的存在和/或进 展、或用于评价受试者对治疗的响应的细胞学分析。

附图简述

图1显示所检测的与B7-H1结合的抗体的杂交瘤上清液的结合。阳性 对照（PC）：来自用于杂交瘤制备的小鼠的1:1000稀释的血清；阴性对照 （NC）：5%牛奶/PBS。显示关于与B7-H1-Fc结合和用抗-小鼠IgG的检测 的数据。

图2显示关于确定经分离的抗-B7-H1抗体是否能够调节B7-H1与 PD-1结合的实验的结果。阳性对照：克隆MIH-1和29E.2A3（两者都是抗 -人CD274（B7-H1））；两个阴性对照：来自不相关的杂交瘤（随机Ab） 的条件培养基和载体对照（VC）。

图3显示所检测的抗-B7-H1抗体与CHO-hB7-H1结合的中值荧光强度 （MFI）。没有发现所检测的克隆与亲本CHO系交叉反应，显示所表达的 抗体是人B7-H1免疫特异性的。

图4显示所选择的抗-人B7-H1抗体的表达人B7-H1的CHO细胞结合 测定的中值荧光强度（MFI）结果。

图5比较了抗-人B7-H1抗体5H1和1E12的表达人B7-H1的CHO细 胞结合测定的中值荧光强度（MFI）结果。

图6显示经分离的抗-人PD-1抗体的抗原结合和同种型。

图7A-7B显示表明几种经分离的杂交瘤表达中和抗-人PD-1抗体的实 验的结果。

图8显示所检测的抗-PD-1抗体与CHO-hPD-1结合的中值荧光强度 （MFI）。没有发现所检测的克隆与亲本CHO系交叉反应，显示所表达的 抗体是人PD-1特异性的。

图9显示所选择的抗-人PD-1抗体的表达人PD-1的CHO细胞结合测 定的中值荧光强度（MFI）。阳性对照：EH12（从BioLegend商业可得的 抗-人PD-1抗体）；mIgG1：鼠IgG阴性对照。

图10显示不同浓度的抗-人PD-1抗体的基于细胞竞争试验的中值荧光 强度（MFI）结果。

图11显示20μg/ml浓度的抗-人PD-1抗体的基于细胞竞争试验的中 值荧光强度（MFI）结果。

图12显示如下实验的结果：其中将用人全长PD-1转染的CHO细胞 与饱和剂量的抗-人PD-1单克隆抗体（mAb）或对照Ig一起预孵育，然后 用生物素标记的hB7-H1-FC或hB7-DC mIg染色。

图13，图A-B显示以下的比较结合：（A）商业可得的抗-PD-1抗体 EH12与（B）具有嵌合（“ch”）鼠抗-人PD-1Fab区和人IgG1Fc区的鼠 单克隆抗体。

图14，图A-B显示本发明的抗-PD-1抗体对生物素化的B7-H1-Fc和 生物素化的B7-DC-Fc与PD-1结合发挥阻断效应的能力。

图15显示1H3抗-人PD-1嵌合抗体与CHO.hPD-1细胞的结合曲线， 如通过抗-hIg抗体所检测的。

图16A-16B显示相对于阴性对照抗体（帕利珠单抗；Medimmune,Inc.），1H3抗-人PD-1嵌合抗体与人的原代T细胞CD8+（图 16A）及CD4+（图16B）结合的能力的研究的结果。

图17显示本发明的抗体增强抗原特异性T细胞应答的能力，如当破 伤风毒素（TT）回忆（recall）时通过CFSE稀释所测量的。

图18A-18D说明人源化的1H3变体（h1H3Var1-h1H3Var14）与 CHO.hPD1细胞结合的能力。

图19A-19B说明人源化的抗-PD-1抗体阻断hPD-1-Fc和表达B7-H1 （图19A）或B7-DC（图19B）的HEK293细胞之间的互作的能力。

图20显示h1H3Var1-h1H3Var6的结合曲线。

发明详述

本发明涉及能够与B7-H1或PD-1免疫特异性结合的抗体和它们的抗 原结合片段和其他分子。在一些实施方案中，此类分子另外能够调节B7-H1 或B7-DC与PD-1结合的能力或能够影响B7-H1或PD-1的信号传导活性。 本发明另外涉及此类分子在癌症和其他疾病的治疗中的用途。

将一个分子称为能够与第二分子“免疫特异性结合”，如果此结合呈现 抗体与其相应的抗原的特异性和亲和力。将抗体称为能够与抗原（且尤其， 抗原：B7-H1或PD-1）的靶区或构象（“表位”）“免疫特异性结合”，如果 此结合涉及免疫球蛋白分子的抗原识别位点。与特定抗原免疫特异性结合 的抗体可与其他抗原以较低的亲和力结合，如果该其他抗原具有被抗原识 别位点识别的一些序列或构象相似性，如，例如，通过本领域已知的免疫 测定、测定或其他测定所确定的，但将不会与完全不相关的抗 原结合。然而，优选地，抗体（和它们的抗原结合片段）将不会与其他抗 原交叉反应。凭借未被包含在抗原识别位点的分子的其他区/域中的结合 域，诸如Fc区，抗体还可以以非免疫特异性的方式与其他分子诸如与FcR 受体结合。

如本文所用的，术语“调节”涉及改变作用或结果的能力。特别地，本 发明涉及能够调节B7-H1和PD-1之间的结合和/或调节作为B7-H1-PD-1 结合的结果发生的信号转导的分子（特别是免疫特异性结合人B7-H1或人 PD-1的抗体或它们的抗原结合片段）。此调节可导致B7-H1与PD-1结合 的能力的减弱或完全阻断。在另外的实施方案中，此调节可减弱或完全中 和B7-H1或PD-1介导信号转导的能力。在另外的实施方案中，此调节可 通过以下增强或另外促进通过B7-H1或PD-1的信号转导：1）增强B7-H1 和PD-1之间的互作并推动B7-H1-PD-1结合或ii）直接与B7-H1和PD-1 结合并因此模拟内源配体的活性，等。在仍然另外的实施方案中，此调节 可改变B7-H1和PD-1之间互作的性质以致改变所引起的信号转导的性质。 例如，本发明的分子能够通过与B7-H1或PD-1结合改变此类分子与其他 配体和受体结合的能力（例如，影响PD-1与B7-DC结合的能力或B7-H1 与B7-1（CD80）结合的能力）并从而改变它们的整体活性。优选地，此 调节将提供可测量的免疫系统活性至少10%的变化，更优选地，此活性至 少50%的变化，或至少2倍、5倍、10倍，或仍然更优选地，此活性至少 100倍的变化。

如本文所用的，术语“抗体”意图指具有“可变区”抗原识别位点的免疫 球蛋白分子。术语“可变区”意图将免疫球蛋白的此域与由抗体广泛共享的 域（诸如抗体Fc域）区别。可变区包含其残基负责抗原结合的“高变区”。 高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基（即，典型在轻链可 变域中的约残基24-34（L1）、50-56（L2）和89-97（L3）和在重链可变域 中的约残基27-35（H1）、50-65（H2）和95-102（H3）；Kabat等人，Sequences  of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National  Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)）和/或那些来自“高变环”的残基 （即，轻链可变域中残基26-32（L1）、50-52（L2）和91-96（L3）和重链 可变域中26-32（H1）、53-55（H2）和96-101（H3）；Chothia,C.等人(1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,"J. Mol.Biol.196:901-917）。“构架区”或“FR”残基是除本文所定义的高变区残 基之外的可变域残基。术语抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、 人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体（camelized antibodies）（见 例如，Muyldermans等人，2001，Trends Biochem.Sci.26:230；Nuttall等人， 2000,Cur.Pharm.Biotech.1:253；Reichmann和Muyldermans,1999,J. Immunol.Meth.231:25；国际公布号WO94/04678和WO94/25591；美国 专利号6,005,079）、单链Fv（scFv）（见，例如，see Pluckthun in The  Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷，Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag,New York,第269-315页（1994））、单链抗体、二硫键连接 的Fv（sdFv）、胞内抗体（intrabodies）和抗-独特型（抗-Id）抗体（包括， 例如，本发明抗体的抗-Id和抗-抗-Id抗体）。特别地，此类抗体包括任何 类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类（例如，IgG₁、IgG₂、 IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂）或亚类的免疫球蛋白分子。

如本文所用的，术语抗体的“抗原结合片段”指的是包含抗体的互补决 定区（“CDR”）和任选包含抗体的“可变区”抗原识别位点的构架残基，并 呈现免疫特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个部分。此类片段包括 Fab'、F(ab')₂、Fv、单链（ScFv）和其突变体、天然存在的变体和包含抗体 “可变区”抗原识别位点和外源蛋白（例如，毒素、用于不同抗原的抗原识 别位点、酶、受体或受体配体，等）的融合蛋白。如本文所用的，术语“片 段”指的是包含至少5个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、 至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个 连续的氨基酸残基、至少40个连续的氨基酸残基、至少50个连续的氨基 酸残基、至少60个连续的氨基酸残基、至少70个连续的氨基酸残基、至 少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续的氨基酸残基、至少100个连 续的氨基酸残基、至少125个连续的氨基酸残基、至少150个连续的氨基 酸残基、至少175个连续的氨基酸残基、至少200个连续的氨基酸残基或 至少250个连续的氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。

人的、嵌合的或人源化抗体是用于人的体内使用特别优选的，然而， 可方便地采用鼠抗体（murine antibodies）或其他物种的抗体用于许多用途 （例如，体外或原位检测分析、急性体内使用，等）。完全人抗体是用于 人受试者治疗处理特别期望的。

可通过本领域已知的多种方法制备人抗体，包括以上描述的使用源自 人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法（见美国专利号4,444,887 和4,716,111；和国际公布号WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、 WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741）。可使用不 能够表达功能性内源免疫球蛋白、但能够表达人免疫球蛋白基因的转基因 小鼠制备人抗体。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机引 入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除了人重链和轻链基因 之外，可将人可变区、恒定区和多变区（diversity region）引入小鼠胚胎干 细胞。可单独地或与通过同源重组引入人免疫球蛋白位点（loci）同时地 使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能。特别地，J_H区的纯合性缺失 阻止了内源抗体的产生。扩增经修饰的胚胎干细胞并显微注射入胚泡以制 备嵌合小鼠。随后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合的后代。用所选 择的抗原，例如，本发明的多肽的整体或部分，使用常规方法免疫转基因 小鼠。可使用常规杂交瘤技术从被免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单 克隆抗体（见，例如，美国专利号5,916,771）。由转基因小鼠携带的人免 疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并随后经受类别转换和体细胞 突变。因此，使用此技术，制备治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体是 可能的。关于用于制备人抗体的该技术的综述，见Lonberg和Huszar（1995, Int.Rev.Immunol.13:65-93，其通过引用整体并入本文）。关于用于制备人 抗体和人单克隆抗体的该技术和用于制备此类抗体的操作说明的详细讨 论，见，例如，国际公布号WO98/24893、WO96/34096、和WO96/33735； 和美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、 5,545,806、5,814,318和5,939,598，其通过引用整体并入本文。另外，可 雇佣公司诸如Abgenix,Inc.（Freemont,CA）和Medarex（Princeton,NJ） 以使用与以上描述相似的技术提供针对所选择的抗原的人抗体。

“嵌合抗体”是其中抗体的不同部分源自不同的免疫球蛋白分子的分 子，诸如具有源自非人抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于 制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。见例如，Morrison,1985,Science 229:1202；Oi等人，1986,BioTechniques4:214；Gillies等人，1989,J.Immunol. Methods125:191-202；和美国专利号6,311,415、5,807,715、4,816,567和 4,816,397。可使用本领域已知的多种技术，包括例如，CDR-移植（EP 239,400；国际公布号WO91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101 和5,585,089）、镶饰（veneering）或表面再塑（resurfacing）（EP592,106； EP519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology28(4/5):489-498；Studnicka 等人，1994,Protein Engineering7:805；和Roguska等人，1994,Proc.Natl. Acad.Sci.USA91:969）、和链改组（chain shuffling）（美国专利号5,565,332） 制备包含来自非人物种的一个或多个CDR和来自人免疫球蛋白分子的构 架区的嵌合抗体。

本发明特别涉及“人源化抗体”（见，例如，欧洲专利号EP239,400、 EP592,106和EP519,596；国际公布号WO91/09967和WO93/17105；美 国专利号5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886和6,407,213； 和Padlan,1991,Molecular Immunology28(4/5):489-498；Studnicka等人， 1994,Protein Engineering7(6):805-814；Roguska等人，1994,PNAS 91:969-973；Tan等人，2002,J.Immunol.169:1119-25；Caldas等人，2000, Protein Eng.13:353-60；Morea等人，2000,Methods20:267-79；Baca等人， 1997,J.Biol.Chem.272:10678-84；Roguska等人，1996,Protein Eng. 9:895-904；Couto等人，1995,Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s；Couto 等人，1995,Cancer Res.55:1717-22；Sandhu,1994,Gene150:409-10； Pedersen等人，1994,J.Mol.Biol.235:959-73；Jones等人，1986,Nature 321:522-525；Reichmann等人，1988,Nature332:323-329；和Presta,1992, Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596）。如本文所用的，术语“人源化抗体”指包 含人构架区和来自非人（通常小鼠或大鼠）免疫球蛋白的一个或多个CDR 的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”且提供构架的人 免疫球蛋白被称为“受体（acceptor）”。恒定区不需要存在，但如果它们存 在的话，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即，至少约85%-90% 相同、优选约95%相同或更多相同。因此，除了可能地CDR，人源化免疫 球蛋白的所有部分与天然的人免疫球蛋白序列的对应部分基本上相同。人 源化抗体是包含人源化的轻链和人源化的重链免疫球蛋白的抗体。例如， 人源化抗体将不包含典型的嵌合抗体，因为，例如，嵌合抗体的整个可变 区是非人的。有人说通过“人源化（humanization）”过程“人源化 （humanized）”供体抗体，因为所得人源化抗体期望与提供CDR的供体抗 体结合相同的抗原。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体 （recipient）抗体），其中受体的高变区残基被具有所需的特异性、亲和力 和能力的来自非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动 物的高变区残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区（FR）残基 被相应的非人残基所代替。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或在供体 抗体中未被发现的残基。作出这些修饰以进一步改善抗体效能。通常，人 源化的抗体将包含至少一个且典型两个可变域中的基本上所有可变域 （substantially all of at least one,and typically two,variable domains），其中所 有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区且所有或基本 上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含免疫球 蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，典型地与FcγRIIB多肽免疫特异性结合、 通过氨基酸残基取代、缺失或添加（即，突变）的引入被改变的人免疫球 蛋白的一部分。

用于本发明方法的抗体可以是单特异性的。还感兴趣的是除了B7-H1 或PD-1之外与不同的靶标呈现特异性的双特异性抗体、三特异性抗体或 更高的多特异性抗体。在优选的实施方案中，此类多特异性抗体将对不同 的免疫细胞靶标呈现特异性。例如，此类抗体可与B7-H1和B7-DC二者 结合并因此调节二者的PD-1依赖的应答。相反地，此类抗体可与PD-1和 B7-1结合并干扰二者的B7-H1依赖的应答。在另一个实施方案中，多特异 性抗体与参与可选的免疫调节通路的分子（受体或配体），诸如CTLA4、 TIM3、TIM4、OX40、CD40、GITR、4-1-BB、B7-H4、LIGHT或LAG3 结合以增强免疫调节作用。此外，多特异性抗体可与效应子分子诸如细胞 因子（例如，IL-7、IL-15、IL-12、IL-4TGF-β、IL-10、IL-17、IFNg、Flt3、 BLys）和趋化因子（例如，CCL21）结合，其可以是用于调节急性和慢性 免疫应答特别相关的。

另外，多特异性抗体可与对于将抗体靶向特定细胞类型或组织是重要 的抗原结合。例如，与PD-1和CD27（或B7-H1和CD27）二者结合的此 类抗体可辅助共定位经活化的记忆B细胞（mB_Act）和抗原呈递细胞（APC） 以致通过此APC排列的PD-1可与mB_Act B-细胞表面的配体互作以促进 mB_Act B-细胞的存活。由于mB_Act B-细胞的丢失是HIV-感染致AIDS的进 展中的促成事件（precipitating event）（Titanji,K.等人(2010)“Acute Depletion  Of Activated Memory B Cells Involves The PD-1Pathway In Rapidly  Progressing SIV-Infected Macaques,”J.Clin.Invest.120(11):3878-3890），结 合PD-1和CD27二者的抗体在HIV感染的治疗中及在预防或推迟AIDS 的发作中具有效用。如以上所讨论的，已暗示PD-1通路在慢性HIV感染 过程中的免疫功能损害（“T细胞耗竭”）中发挥关键作用（Khaitan,A.等人 (2011)“Revisiting Immune Exhaustion During HIV Infection,”Curr. HIV/AIDS Rep.8:4-11；Rodríquez-García,M.等人(2010年11月19日) “Expression Of PD-L1And PD-L2On Human Macrophages Is Up-Regulated  By HIV-1And Differentially Modulated By IL-10,”J.Leukocyte Biol.89: doi:10.1189/jlb.0610327:1-9；Grabmeier-Pfistershammer,K.等人(2011) “Identification of PD-I as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution  in HIV-1-Infected Patients on Treatment,”J Acquir.Immune Defic.Syndr. 56(2):118-124）。已显示巨噬细胞大大有助于HIV感染的起始步骤（Carter, C.A.等人(2008)“Cell Biology Of HIV-1Infection Of Macrophages,”Ann.Rev. Microbiol.62:425-443；Noursadeghi,M.等人(2006)“HIV-1Infection Of  Mononuclear Phagocytic Cells:The Case For Bacterial Innate Immune  Deficiency In AIDS,”Lancet Infect.Dis.6:794-804）。因此，与PD-1和与巨 噬细胞特异性标志物（诸如CD14、CD68、CD163、TLR2等）结合的抗 体（特别是如果与毒素缀合）在预防HIV感染中具有效用。另外，与T细 胞耗竭的多个标志物（例如，PD-1和以下的任何一种或全部：CTLA4、 TIM3、TIM4或LAG-3）结合的抗体在免疫应答性的治疗或诊断中具有效 用。其他感兴趣的靶标抗原包括癌细胞标志物。

另外，已发现PD-1⁺CD8⁺细胞具有抗-HIV活性（Killian,M.S.等人(2011) “Natural Suppression of Human Immunodeficiency Virus Type1Replication Is  Mediated by Memory CD8⁺T Cells,”J.Virol.85(4):1696-1705)。因此，与PD-1 和CD8二者结合的抗体在例如，用于分离和制备用于在治疗患者的HIV 感染和AIDS中最终使用的此类细胞的富集的群体的离体（ex vivo）方法 中具有效用。

可用于此抗-PD-1或抗-B7-H1双特异性、三特异性或多特异性抗体的 其他标志物包括CD4、CD8、CD25和CTLA-4（见，De Keersmaecker,B. 等人(2011)(“Fighting with the Enemy's Weapons?The Role of Costimulatory  Molecules in HIV,”Curr.Molec.Med.566-5240/11:1-25；和Sarikonda,G. (2011)“Immunosuppressive Mechanisms During Viral Infectious Diseases;” Methods in Molec.Biol.677:431-447，通过引用将二者并入本文）。

类似地，尽管CD4T细胞是减慢结核分枝杆菌（M.tuberculosis）的生 长和传播所需的，PD-1介导的抑制也是预防CD4⁺T细胞促进严重疾病所 需的（Barber,D.L.等人(2011)“CD4T Cells Promote Rather than Control  Tuberculosis in the Absence of PD-l-Mediated Inhibition,”J.Immunol. 186:1598-1607；Sakai,S.等人(2010)“PD-1-PD-L1pathway impairs T_hl  immune response in the late stage of infection with Mycobacterium bovis  bacillus Calmette-Guérin,”Intl.Immunol.22(12):915-925；Lázár-Molnár,E. 等人(2010)“Programmed Death-1(PD-l)-Deficient Mice Are Extraordinarily  Sensitive To Tuberculosis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 107(30):13402-13407）。因此，与CD4和PD-1二者结合的抗体在结核病的 治疗中及在预防或推迟结核病的发作中具有效用。

编码用于优选的人受体构架序列的DNA序列包括但不限于来自人种 系VH区段VH1-18和JH6和来自人种系VL区段VK-A26和JK4的FR 区段。在特定的实施方案中，使用常规重组DNA技术将一个或多个CDR 插入构架区内。该构架区可以是天然存在的或共有构架区，且优选地人构 架区（见，例如，Chothia等人,1998,J.Mol.Biol.278:457-479关于人构架 区的列表）。

本发明的人源化的或嵌合抗体可包含至少一个且典型两个可变域中 的基本上所有可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球 蛋白（即，供体抗体）的CDR区且所有或基本上所有的构架区为人免疫 球蛋白共有序列的构架区。优选地，本发明的抗体还包含免疫球蛋白恒定 区（Fc）的至少一部分，典型为人免疫球蛋白的至少部分。可选择本发明 的抗体的恒定域用于抗体的所提出的功能，特别地可能所需要的效应子功 能。在一些实施方案中，本发明的抗体的恒定域是（或包含）人IgA、IgD、 IgE、IgG或IgM域。在特定实施方案中，当本发明的人源化的抗体期望用 于治疗用途时使用人IgG恒定域，特别是IgG1和IgG3同种型的恒定域并 需要抗体效应子功能诸如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补 体依赖的细胞毒性（CDC）活性。例如，PD-1在T细胞和罕见的周围T 细胞淋巴瘤诸如血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（Angioimmunoblastic  T-cell lymphoma，AITL）上高度表达。具有ADCC或CDC活性的抗-PD-1 抗体作为用于治疗此类癌症的治疗剂特别重要。在可选的实施方案中，当 本发明的抗体期望用于治疗目的时，使用IgG2和IgG4同种型并且不需要 抗体效应子功能。例如，如果你希望通过靶向T细胞表面的PD-1增加T 细胞活性，那么将杀死T细胞的效应子功能可能是不合需要的。本发明包 含Fc恒定域，所述Fc恒定域包含改变抗体效应子功能的一种或多种氨基 酸修饰，诸如在美国专利申请公布号2005/0037000和2005/0064514中公 开的那些。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含轻链和重链的至少可变域二 者。在其他实施方案中，本发明的抗体还可包含重链的CH1、铰链区、CH2、 CH3和CH4区的一种或多种。抗体可选自包括IgM、IgG、IgD、IgA和 IgE的免疫球蛋白的任何类和包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄的任何同种型。 在一些实施方案中，恒定域是补体固定恒定域，其中抗体呈现细胞毒性活 性是理想的，且类典型地是IgG₁。在其中此细胞毒性活性是不需要的其他 实施方案中，恒定域可以是IgG₂类的。本发明的抗体可包含来自不止一个 类或同种型的序列，且选择特定的恒定域以优化期望的效应子功能在本领 域普通技术人员能力之内。

人源化抗体的构架和CDR区不需要精确对应亲本序列，例如，可通 过至少一个残基的取代、插入或缺失诱变供体CDR或共有构架以致CDR 或构架残基在那个位点处不对应共有或供体抗体。然而，此类突变优选不 是大量的。通常，至少75%、更通常90%、且最优选大于95%的人源化抗 体的残基将对应于亲本构架区（FR）和CDR序列的残基。可使用本领域 已知的多种技术制备人源化的抗体，包括，但不限于CDR-移植（欧洲专 利号EP239,400；国际公布号WO91/09967；和美国专利号5,225,539、 5,530,101和5,585,089）、镶饰或表面再塑（欧洲专利号EP592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology28(4/5):489-498；Studnicka 等人，1994,Protein Engineering7(6):805-814；和Roguska等人，1994,Proc. Natl.Acad.Sci.91:969-973)、链改组（美国专利号5,565,332)和在例如美国 专利号6,407,213、5,766,886、5,585,089，国际公布号WO9317105，Tan 等人，2002,J.Immunol.169:1119-25,Caldas等人，2000,Protein Eng. 13:353-60,Morea等人，2000,Methods20:267-79,Baca等人，1997,J.Biol. Chem.272:10678-84，Roguska等人，1996,Protein Eng.9:895-904，Couto 等人，1995,Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s，Couto等人，1995,Cancer  Res.55:1717-22；Sandhu,1994,Gene150:409-10，Pedersen等人，1994,J.Mol. Biol.235:959-73，Jones等人，1986,Nature321:522-525，Reichmann等人， 1988,Nature332:323，和Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596中公 开的技术。通常，将用来自CDR供体抗体的对应的残基取代构架区中的 构架残基以改变、优选改进抗原结合。通过本领域众所周知的方法鉴定这 些构架取代，例如，通过CDR和构架残基的互作的建模以鉴定对于抗原 结合重要的构架残基和序列比较以鉴定特定位置处异常的构架残基（见， 例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；美国公布号2004/0049014和 2003/0229208；美国专利号6,350,861；6,180,370；5,693,762；5,693,761； 5,585,089；和5,530,101和Riechmann等人，1988,Nature332:323）。

可通过本领域已知的用于多肽的制备有用的任何方法制备本发明的 抗体，例如，体外合成、重组DNA制备和类似的方法。优选地，通过重 组DNA技术制备人源化抗体。可使用重组免疫球蛋白表达技术制备本发 明的抗体。在美国专利号4,816,397（Boss等人）、美国专利号6,331,415 和4,816,567（二者都属于Cabilly等人）、英国专利GB2,188,638（Winter 等人）和英国专利GB2,209,757中描述了免疫球蛋白分子包括人源化抗体 的重组制备。用于免疫球蛋白包括人源化的免疫球蛋白的重组表达的技 术，还可见于Goeddel等人，Gene Expression Technology Methods in  Enzymology第185卷Academic Press(1991)，和Borreback,Antibody  Engineering,W.H.Freeman（1992）。涉及重组抗体的产生、设计和表达的 另外的信息可见于Mayforth,Designing Antibodies,Academic Press,San  Diego（1993）。

用于制备本发明的重组嵌合抗体的示例性的方法可包含以下：a）通过 传统的分子生物学方法构建编码和表达抗体重链的表达载体，其中将鼠抗 -B7-H1（或抗-PD-1）单克隆抗体的CDR和可变区融合至源自人免疫球蛋 白的Fc区，从而制备用于表达嵌合抗体重链的载体；b）通过传统的分子 生物学方法构建编码和表达鼠抗-B7-H1（或-PD-1）单克隆抗体的抗体轻 链的表达载体，从而制备用于表达嵌合抗体轻链的载体；c）通过传统的分 子生物学方法将表达载体转移至宿主细胞以制备用于表达嵌合抗体的经 转染的宿主细胞；和d）通过传统的细胞培养技术培养经转染的细胞以便 制备嵌合抗体。

用于制备本发明的重组人源化抗体的示例性方法可包含以下：a）通过 传统的分子生物学方法构建编码和表达抗体重链的表达载体，其中保持供 体抗体结合特异性所需的CDR和可变区构架的最小部分源自非人免疫球 蛋白，诸如鼠抗-B7-H1（或抗-PD-1）单克隆抗体，且抗体的剩余部分源 自人免疫球蛋白，从而制备用于表达人源化抗体重链的载体；b）通过传 统的分子生物学方法构建编码和表达抗体轻链的表达载体，其中保持供体 抗体结合特异性所需的CDR和可变区构架的最小部分源自非人免疫球蛋 白，诸如鼠抗-B7-H1（或抗-PD-1）单克隆抗体，且抗体的剩余部分源自 人免疫球蛋白，从而制备用于表达人源化抗体轻链的载体；c）通过传统的 分子生物学方法将表达载体转移至宿主细胞以制备用于表达人源化抗体 的经转染的宿主细胞；和d）通过传统的细胞培养技术培养经转染的细胞 以便制备人源化的抗体。

关于任一示例性的方法，可用可包含不同的选择标记、但除了重链和 轻链编码序列之外优选是相同的此类表达载体共转染宿主细胞。该方法提 供用于等量表达重链和轻链多肽。可选地，可使用编码重链和轻链多肽二 者的单个载体。用于重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA 或二者。所使用的表达本发明的重组抗体的宿主细胞可以是细菌细胞诸如 大肠杆菌（Escherichia coli）、或更优选地真核细胞（例如，中国仓鼠卵巢 （CHO）细胞或HEK-293细胞）。表达载体的选择取决于宿主细胞的选择， 并可选择表达载体以便在所选择的宿主细胞中具有期望的表达和调节特 征。可被使用的其他细胞系包括但不限于，CHO-K1、NSO和PER.C6 （Crucell,Leiden,Netherlands）。此外，当选择宿主细胞时可优化密码子使 用以考虑物种特定的密码子使用偏好并增强蛋白表达。例如，关于CHO 细胞表达，编码抗体的DNA可并入优先被中国仓鼠（Cricetulus griseus） （中国仓鼠卵巢细胞源自其）使用的密码子。可采用密码子优化的方法以 促进被期望宿主细胞的改进的表达（见，例如，Wohlgemuth,I.等人(2011) “Evolutionary Optimization Of Speed And Accuracy Of Decoding On The  Ribosome,”Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.366(1580):2979-2986； Jestin,J.L.等人(2009)“Optimization Models And The Structure Of The Genetic  Code,”J.Mol.Evol.69(5):452-457；Bollenbach,T.等人(2007)“Evolution And  Multilevel Optimization Of The Genetic Code,”Genome Res.17(4):401-404； Kurland,C.G.等人(1984)“Optimization Of Translation Accuracy,”Prog. Nucleic Acid Res.Mol.Biol.31:191-219；Grosjean,H.等人(1982) “Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes:The Optimal Codon- Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently  Expressed Genes,”Gene18(3):199-209）。

使用本领域技术人员众所周知的技术，任何以上描述的抗体可被用于 产生抗-个体基因型抗体（见，例如，Greenspan,N.S.等人(1989) “Idiotypes:Structure And Immunogenicity,”FASEB J.7:437-444；和Nisinoff,A. (1991)“Idiotypes:Concepts And Applications,”J.Immunol.147(8): 2429-2438）。

如果有需要，可通过筛选呈现此期望特征的变体以进一步改进任何以 上抗体的结合特性。例如，可使用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生 此类抗体。在噬菌体展示方法中，可将功能抗体域展示在携带编码它们的 多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。在特定实施方案中，可利用此噬菌体 以展示抗原结合域，诸如从所有组成成分（repertoire）或组合抗体库（例 如，人或鼠）表达的Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。可用抗原选择或鉴定 表达结合感兴趣抗原的抗原结合域的噬菌体，例如，使用经标记的抗原或 结合至或被捕获至固体表面或珠子的抗原。用于这些方法的噬菌体典型为 丝状噬菌体，包括fd和M13。表达抗原结合域作为噬菌体基因III或基因 VIII蛋白的重组融合蛋白。可被用于制造本发明的免疫球蛋白或其片段的 噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman,U.等人(1995)“Phage Display Of  Disulfide-Stabilized Fv Fragments,”J.Immunol.Methods,182:41-50,1995； Ames,R.S.等人(1995)“Conversion Of Murine Fabs Isolated From A  Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins,”J. Immunol.Methods,184:177-186；Kettleborough,C.A.等人(1994)“Isolation Of  Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using  Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From  These Antibody Fragments,”Eur.J.Immunol.,24:952-958,1994；Persic,L.等 人(1997)“An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of  Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display  Libraries,”Gene,187:9-18；Burton,D.R.等人(1994)“Human Antibodies From  Combinatorial Libraries,”Adv.Immunol.57:191-280；PCT公布WO 92/001047；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619； WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美国专利号5,698,426； 5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698； 5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公 开的那些。

如以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，可分离并使用来自噬 菌体的抗体编码区以产生全部抗体，包括人源化抗体或任何其他期望片 段，并可在任何期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物 细胞、酵母和细菌，例如，如以下详细描述的。例如，使用本领域已知的 方法还可采用重组制备Fab、Fab'和F(ab')₂片段的技术，诸如在PCT公布 WO92/22324；Mullinax,R.L.等人(1992)“Expression Of A Heterodimeric Fab  Antibody Protein In One Cloning Step,”BioTechniques,12(6):864-869；和 Sawai等人(1995)“Direct Production Of The Fab Fragment Derived From The  Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction And cDNA  Expression Vectors,”Am.J.Reprod.Immunol.34:26-34；和Better,M.等人 (1988)“Escherichia coli Secretion Of An Active Chimeric Antibody Fragment,” Science240:1041-1043中公开的那些。可被用于制备单链Fv和抗体的技术 的实例包括在美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston,J.S.等人(1991) “Protein Engineering Of Single-Chain Fv Analogs And Fusion Proteins,” Methods in Enzymology203:46-88；Shu,L.等人，“Secretion Of A  Single-Gene-Encoded Immunoglobulin From Myeloma Cells,”Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)90:7995-7999；和Skerra.A.等人(1988)“Assembly Of A Functional  Immunoglobulin Fv Fragment In Escherichia coli,”Science240:1038-1040中 描述的那些。

可将噬菌体展示技术用于增加本发明的抗体对于B7-H1和/或PD-1的 亲和力。该技术在获得可被用于本发明的组合方法的高亲和力抗体中将是 有用的。被称为亲和力成熟的该技术采用诱变或CDR步行（CDR walking） 和使用此类受体或配体（或它们的胞外域）或其抗原片段的再选择以鉴定 当与初始或亲本抗体相比时以较高的亲和力与抗原结合的抗体（见，例如， Glaser,S.M.等人(1992)“Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis  In A Filamentous Phage Vector System,”J.Immunol.149:3903-3913）。诱变整 个密码子而不是单个核苷酸导致氨基酸突变的半随机化的所有组成成分 （semi-randomized repertoire）。可构建由变体克隆的池组成的文库，每一 个变体克隆根据单个CDR中的单个氨基酸变化而不同且包含代表每一个 CDR残基的每一种可能的氨基酸取代的变体。可通过将被固定的突变体与 经标记的抗原接触筛选具有对抗原的增加的结合亲和力的突变体。可将本 领域已知的任何筛选方法用于鉴定具有对抗原增加的亲合力（avidity）的 突变抗体（例如，ELISA）（见，例如，Wu,H.等人(1998)“Stepwise In Vitro  Affinity Maturation Of Vitaxin,An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab,” Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95(11):6037-6042；Yelton,D.E.等人(1995) “Affinity Maturation Of The BR96Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based  Mutagenesis,”J.Immunol.155:1994-2004）。如果可能，可使用随机化轻链 的CDR步行（见，Schier等人(1996)“Isolation Of Picomolar Affinity  Anti-C-Erbb-2Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The  Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding  Site,”J.Mol.Biol.263:551-567）。

本发明因此涉及使用随机诱变与噬菌体展示的方法相结合以鉴定改 进的CDR和/或可变区。噬菌体展示技术可以可选地被用于通过定向诱变 （例如，亲和力成熟或“CDR-步行”）增加（或减弱）CDR亲和力。该技 术使用靶标抗原或其抗原片段以鉴定具有当与初始或亲本抗体相比时以 较高（或较低）亲和力与抗原结合的CDR的抗体（见，例如，Glaser,S.M. 等人(1992)“Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A  Filamentous Phage Vector System,”J.Immunol.149:3903-3913)。诱变整个密 码子而不是单个核苷酸导致氨基酸突变的半随机化的所有组成成分。可构 建由变体克隆的池组成的文库，每一个变体克隆根据单个CDR中的单个 氨基酸变化而不同且包含代表每一个CDR残基的每一种可能的氨基酸取 代的变体。可通过将被固定的突变体与经标记的抗原接触筛选具有对抗原 的增加的（或减弱的）结合亲和力的突变体。可将本领域已知的任何筛选 方法用于鉴定具有对抗原增加的（或减弱的）亲合力的突变抗体（例如， ELISA）（见，Wu,H.等人(1998)“Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of  Vitaxin,An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab,”Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)95(11):6037-6042；Yelton,D.E.等人(1995)“Affinity Maturation Of The  BR96Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis,”J.Immunol. 155:1994-2004)。如果可能，可使用随机化轻链的CDR步行（见，Schier 等人(1996)“Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2Single-Chain Fv  By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The  Center Of The Antibody Binding Site,”J.Mol.Biol.263:551-567）。

用于实现此亲和力成熟的方法在例如：Krause,J.C.等人(2011)“An  Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances  Function Of A Human Antibody,”MBio.2(1)pii:e00345-10. doi:10.1128/mBio.00345-10；Kuan,C.T.等人(2010)“Affinity-Matured  Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant  Gliomas And Melanomas,”Int.J.Cancer10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等人 (2010)“Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality  Landscapes,”J.Mol.Biol.401(l):84-96；Montgomery,D.L.等人(2009) “Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody  Against HIV-I gp41,”MAbs l(5):462-474；Gustchina,E.等人(2009)“Affinity  Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2Loop Of A  Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library  And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41Yields A Set  Of Fabs With Improved HIV-I Neutralization Potency And Breadth,”Virology 393(1):112-119；Finlay,W.J.等人(2009)“Affinity Maturation Of A Humanized  Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy:Comprehensive Mutagenesis Reveals A  High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The  Complementarity-Determining Regions,”J.Mol.Biol.388(3):541-558； Bostrom,J.等人(2009)“Improving Antibody Binding Affinity And Specificity  For Therapeutic Development,”Methods Mol.Biol.525:353-376；Steidl,S.等 人(2008)“In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By  Targeted CDR-Diversification,”Mol.Immunol.46(1):135-144；和Barderas,R. 等人(2008)“Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling,” Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)105(26):9029-9034中被描述。

本发明特别涉及任何以上描述的抗体和它们的抗原结合片段的“衍生 物”的制备和使用。术语“衍生物”指与抗原免疫特异性结合但相对于“亲本” （或野生型）分子包含一、二、三、四、五或更多个氨基酸取代、添加、 缺失或修饰的抗体或其抗原结合片段。此氨基酸的取代或增加可引入天然 存在的（即，DNA编码的）或非天然存在的氨基酸残基。此类氨基酸可被 糖基化（例如，具有改变了的甘露糖、2-N-乙酰葡糖胺、半乳糖、岩藻糖、 葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-神经氨酸乙二醇（5-glycolneuraminic  acid）等内容（content））、乙酰化、聚乙二醇化（pegylated）、磷酸化、酰 胺化、通过已知的保护/封闭基团、蛋白酶剪切、与细胞配体或其他蛋白连 接衍生化，等。在一些实施方案中，改变了的碳水化合物修饰调节以下的 一种或多种：抗体的溶解、促进抗体的亚细胞转运和分泌、促进抗体组装、 构象完整和抗体介导的效应子功能。在特定的实施方案中，相对于缺少碳 水化合物修饰的抗体，改变了的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应子 功能。导致改变了的抗体介导的效应子功能的碳水化合物修饰是本领域众 所周知的（例如，见Shields,R.L.等人(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG  N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And  Antibody-Dependent Cellular Toxicity”.J.Biol.Chem.277(30):26733-26740； Davies J.等人(2001)“Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line:Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms  Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII,” Biotechnology&Bioengineering74(4):288-294）。改变碳水化合物内容 （carbohydrate content）的方法是本领域技术人员已知的，见，例如，S.C. 等人(1988)“Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody  Against Alpha(1----6)Dextran Increases Its Affinity For Antigen,”J.Exp.Med. 168(3):1099-1109；Tao,M.H.等人(1989)“Studies Of Aglycosylated Chimeric  Mouse-Human IgG.Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector  Functions Mediated By The Human IgG Constant Region,”J.Immunol. 143(8):2595-2601；Routledge,E.G.等人(1995)“The Effect Of Aglycosylation  On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3Monoclonal  Antibody,”Transplantation60(8):847-53；Elliott,S.等人(2003)“Enhancement  Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glyco engineering,”Nature  Biotechnol.21:414-21；Shields,R.L.等人(2002)“Lack Of Fucose On Human  IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII  And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.,”J.Biol.Chem. 277(30):26733-26740）。

在一些实施方案中，人源化的抗体是衍生物。此人源化的抗体包含一 个或多个非人CDR中的氨基酸残基的取代、缺失或添加。当与非衍生物 人源化的抗体相比时，人源化的抗体衍生物可基本上具有相同的结合、更 好的结合、或更差的结合。在特定的实施方案中，CDR的一、二、三、四 或五个氨基酸残基已被取代、缺失或添加（即，被突变）。

使用本领域技术人员已知的技术，包括但不限于，特定的化学裂解、 乙酰化、配制（formulation）、衣霉素的代谢合成等，可通过化学修饰来修 饰衍生物抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体衍生物将具有与亲本 抗体相似的或相同的功能。在另一个实施方案中，相对于亲本抗体，抗体 衍生物将呈现被改变的活性。例如，相比于亲本抗体，衍生物抗体（或其 片段）可以与其表位更紧密地结合或可以更耐受蛋白水解。

衍生化的抗体中的取代、添加或缺失可以在抗体的Fc区并可从而用 来修饰抗体与一个或多个FcγR的结合亲和力。用于修饰抗体具有与一个 或多个FcγR的经修饰的结合的方法是本领域已知的，见，例如，PCT公 布号WO04/029207、WO04/029092、WO04/028564、WO99/58572、WO 99/51642、WO98/23289、WO89/07142、WO88/07089和美国专利号 5,843,597和5,642,821。在一些实施方案中，本发明包含具有对于活化的 FcγR，例如，FcγRIIIA的已被改变的亲和力的抗体。优选地，此类修饰还 具有被改变的Fc介导的效应子功能。影响Fc介导的效应子功能的修饰是 本领域众所周知的（见美国专利号6,194,551和WO00/42072）。在一个特 定的实施方案中，Fc区的修饰导致抗体具有被改变的抗体介导的效应子功 能、与其他Fc受体（例如，Fc活化受体）的被改变的结合、被改变的抗 体依赖性的细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性、被改变的C1q结合活性、 被改变的补体依赖性的细胞毒性活性（CDC）、吞噬活性或其任何组合。

衍生化的抗体可被用于改变哺乳动物、优选人中的亲本抗体的半衰期 （例如，血清半衰期）。优选地，此改变将导致大于15天、优选大于20 天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2 个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月的半衰期。本发明的人源化 的抗体或其片段在哺乳动物、优选人中增加的半衰期导致哺乳动物中所述 抗体或抗体片段的较高的血清滴度，并因此减少所述抗体或抗体片段的施 用频率和/或减少待被施用的所述抗体或抗体片段的浓度。可通过本领域技 术人员已知的技术产生具有增加的体内半衰期的抗体或其片段。例如，可 通过修饰（例如，取代、缺失或添加）经鉴定参与Fc域和FcRn受体之间 互作的氨基酸残基产生具有增加的体内半衰期的抗体或其片段。可设计本 发明的人源化的抗体以增加生物半衰期（见，例如，美国专利号6,277,375）。 例如，可在Fc-铰链域中设计本发明的人源化的抗体以具有增加的体内或 血清半衰期。

可通过将聚合物分子诸如高分子量的聚乙二醇（PEG）附着至所述抗 体或抗体片段产生具有增加的体内半衰期的抗体或其片段。可通过PEG与 所述抗体或抗体片段的N-或C-末端的位点特异性缀合或经由存在于赖氨 酸残基上的ε-氨基，用或不用多功能连接体将PEG附着至所述抗体或抗体 片段。将使用导致最小的生物活性损失的直链或支链聚合物衍生化。将通 过SDS-PAGE和质谱紧密地监测缀合的程度以确保PEG分子与抗体的适 当的缀合。可通过，例如，尺寸排阻或离子交换色谱法将未反应的PEG与 抗体-PEG缀合物（conjugates）分离。

还可通过Davis等人（见美国专利号4,179,337）描述的方法和偶联剂 修饰本发明的抗体以提供可被注射入哺乳动物的循环系统的基本上不具 有免疫原性应答的组合物。

本发明包含本发明的人源化的抗体的构架残基的修饰。可用来自CDR 供体抗体的对应的残基取代构架区中的构架残基以改变、优选改进抗原结 合。通过本领域众所周知的方法鉴定这些构架取代，例如，通过CDR和 构架残基的互作的建模以鉴定对于抗原结合重要的构架残基和通过序列 比较以鉴定特定位置处的异常构架残基（见，例如，美国专利号5,585,089； 和Riechmann,L.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies For Therapy,” Nature332:323-327)。

本发明还包含与异源分子（即，不相关的分子）重组融合或化学缀合 （包括共价地和非共价地两种缀合）的抗-人B7-H1和抗-人PD-1抗体（且 更优选地，人源化抗体）和其抗原结合片段。该融合不一定是直接的，而 是可通过连接体序列发生。

该融合融合蛋白的Fc部分可根据同种型或亚类而不同，可以是嵌合 的或杂合的，和/或可以是被修饰的，例如以改进效应子功能、半衰期控制、 组织可达性、增强生物物理表征诸如稳定性，并改进生产效率（和较少的 成本）。在构建所公开的融合蛋白中有用的许多修饰和用于制造它们的方 法是本领域已知的，见例如，Mueller,J.P.等人(1997)“Humanized Porcine  VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric Igg2/G4Constant  Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells,”Mol. Immun.34(6):441-452，Swann,P.G.(2008)“Considerations For The  Development Of Therapeutic Monoclonal Antibodies,”Curr.Opin.Immun. 20:493-499（2008），和Presta,L.G.(2008)“Molecular Engineering And  Design Of Therapeutic Antibodies,”Curr.Opin.Immun.20:460-470。在一些实 施方案中，Fc区是天然的IgG1、IgG2或IgG4Fc区。在一些实施方案中， Fc区是杂合体，例如，由IgG2/IgG4Fc恒定区组成的嵌合体。Fc区的修 饰包括但不限于，经修饰以防止与Fcγ受体和补体结合的IgG4、经修饰 以改进与一个或多个Fcγ受体结合的IgG1、经修饰以最小化效应子功能 （氨基酸变化）的IgG1、具有改变了的/不具有聚糖（典型通过改变表达 宿主）的IgG1、和具有改变了的pH依赖的与FcRn的结合的IgG1。Fc区 可包含整个铰链区或少于整个铰链区。

用用于非霍奇金淋巴瘤或Waldenstrom巨球蛋白血症的利妥昔单抗 （抗CD20的嵌合的小鼠/人IgG1单克隆抗体）治疗的患者中的治疗结果 与具有对于人IgG1的Fc域的不同的内部亲和力的Fcγ受体的等位基因变 体的个体表达相关。特别地，具有低亲和力活化Fc受体CD16A（FcγRIIIA） 的高亲和力等位基因的患者显示较高的应答率且，在非霍奇金淋巴瘤的病 例中，改进了无进展存活期。在另一个实施方案中，Fc域可包含减少与低 亲和力抑制性Fc受体CD32B（FcγRIIB）结合并保持与低亲和力活化Fc 受体CD16A（FcγRIIIA）结合的野生型水平或增强与低亲和力活化Fc受 体CD16A（FcγRIIIA）的结合的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。

另一个实施方案包含已减少与增加它们的半衰期的FcR结合的IgG2-4 杂合体和IgG4突变体。代表性的IG2-4杂合体和IgG4突变体在Angal,S. 等人(1993)“A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of  Chimeric Mouse/Human(IgG4)Antibody,”Molec.Immunol.30(1):105-108； Mueller,J.P.等人(1997)“Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal  Antibodies With Chimeric IgG2/G4Constant Regions Block Human Leukocyte  Binding To Porcine Endothelial Cells,”Mol.Immun.34(6):441-452；和美国专 利号6,982,323中描述。在一些实施方案中，IgG1和/或IgG2域被缺失， 例如，Angal等人描述了丝氨酸241被脯氨酸取代的IgG1和IgG2。

在优选的实施方案中，Fc域包含增强与CD16A的结合的氨基酸插入、 缺失或取代。增加与CD16A的结合并减少与CD32B的结合的人IgG1的 Fc域中的大量的取代是本领域已知的并在Stavenhagen,J.B.等人(2007)“Fc  Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor  Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity  Activating Fcgamma Receptors,”Cancer Res.57(18):8882-8890中描述。具有 与CD32B减少的结合和/或与CD16A增加的结合的人IgG1Fc域的示例性 变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代 可以以任何组合存在于人IgG1Fc域中。在一个实施方案中，人IgG1Fc 域变体包含F243L、R929P和Y300L取代。在另一个实施方案中，人IgG1 Fc域变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I和P296L取代。在另一个 实施方案中，人IgG1Fc域变体包含N297Q取代，由于该突变破坏了FcR 结合。

在一个实施方案中，此类异源分子是具有至少10个、至少20个、至 少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、 至少90个、或至少100个氨基酸的多肽。此类异源分子可选地可以是酶、 激素、细胞表面受体、药物部分，诸如：毒素（诸如相思豆毒蛋白（abrin）、 蓖麻毒A、假单胞菌外毒素（即，PE-40）、白喉毒素、蓖麻毒素、白树毒 素或美洲商陆抗病毒蛋白）、蛋白（诸如肿瘤坏死因子、干扰素（例如，α- 干扰素、β-干扰素）、神经生长因子、血小板衍化生长因子、组织型纤溶酶 原激活因子或凋亡剂（例如，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β））、生物 反应调节物（诸如，例如，淋巴因子（例如，白介素-1（“IL-1”）、白介素 -2（“IL-2”）、白介素-6（“IL-6”）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 （“GM-CSF”）、粒细胞集落刺激因子（“G-CSF”）、或巨噬细胞集落刺激因 子（“M-CSF”））、或生长因子（例如，生长激素（“GH”））、细胞毒素（例 如，细胞生长抑制剂或细胞自杀剂，诸如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌 肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷（etoposide）、替尼泊苷 （tenoposide）、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二 羟基炭疽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质 激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、单甲基auristatin F（MMAF）、 单甲基auristatin E（MMAE；例如，尼可占替诺）和嘌呤霉素和其类似物 或同系物）、抗代谢物（例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖 胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺）、烷化剂（例如，双氯乙基甲胺、硫脲苯丁酸 氮芥、苯丙氨酸氮芥、（亚硝脲氮芥；BSNU）和环己亚硝脲 （CCNU）、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、和 顺铂（II）（DDP）顺铂（cisplatin））、蒽环类抗生素（例如，柔红霉素（先 前称为道诺霉素）和阿霉素）、抗生素（例如，更生霉素（先前称为放线 菌素）、博来霉素、光神霉素和安曲霉素（AMC））或抗有丝分裂因子（例 如，长春新碱和长春花碱）。

用于将此治疗部分缀合至抗体的技术是众所周知的；见，例如，Arnon 等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer  Therapy”,于MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY， Reisfeld等人（编者），1985，第243-56页，Alan R.Liss,Inc.)；Hellstrom 等人，“Antibodies For Drug Delivery”,于CONTROLLED DRUG  DELIVERY（第2版），Robinson等人（编者），1987，第623-53页，Marcel  Dekker,Inc.）；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer  Therapy:A Review”,于MONOCLONAL ANTIBODIES‘84:BIOLOGICAL  AND CLINICAL APPLICATIONS，Pinchera等人（编者），1985，第475-506 页)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of  Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,于MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY,Baldwin等人 （编者），1985，第303-16页，Academic Press；Thorpe等人(1982)“The  Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates,” Immunol.Rev.62:119-158；Carter,P.J.等人(2008)“Antibody-Drug Conjugates  for Cancer Therapy,”Cancer J.14(3):154-169；Alley,S.C.等人(2010) “Antibody-Drug Conjugates:Targeted Drug Delivery For Cancer,”Curr.Opin. Chem.Biol.14(4):529-537；Carter,P.等人(2005)“Designer Antibody-Based  Therapeutics For Oncology,”Amer.Assoc.Cancer Res.Educ.Book. 2005(1):147-154；Carter,P.J.等人(2008)“Antibody-Drug Conjugates For  Cancer Therapy,”Cancer J.14(3):154-169；Chari,R.V.J.(2008)“Targeted  Cancer Therapy:Conferring Specificity To Cytotoxic Drugs,”Acc.Chem Res. 41(1):98-107；Doronina,S.O.等人(2003)“Development Of Potent Monoclonal  Antibody Auristatin Conjugates For Cancer Therapy,”Nat.Biotechnol. 21(7):778-784；Ducry,L.等人(2010)“Antibody-Drug Conjugates:Linking  Cytotoxic Payloads To Monoclonal Antibodies,”Bioconjug Chem.21(1):5-13； Senter,P.D.(2009)“Potent Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy,” Curr.Opin.Chem.Biol.13(3):235-244；和Teicher,B.A.(2009) “Antibody-Drug Conjugate Targets,”Curr Cancer Drug Targets. 9(8):982-1004。

可将本发明的任何分子与标志物序列（marker sequences）诸如肽融合 以便于纯化。在优选的实施方案中，标志物氨基酸序列是六-组氨酸肽，对 应于源自流感血凝素蛋白的表位的血凝素“HA”标签（Wilson,I.A.等人 (1984)“The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein,”Cell, 37:767-778）和“flag”标签（Knappik,A.等人(1994)“An Improved Affinity Tag  Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of  Recombinant Antibody Fragments,”Biotechniques17(4):754-761)。

本发明还包含缀合至诊断或治疗剂或期望血清半衰期被增加的任何 其他分子的抗体或它们的抗原结合片段。可诊断上使用（体内、原位或体 外）抗体以，例如，监测疾病、疾患或感染的形成或进展作为临床检测过 程的部分以，例如确定所给予的治疗方案的效果。通过将抗体偶联至可检 测的物质可便于检测。可检测的物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、 发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属和非放射性顺 磁金属离子。使用本领域已知的技术，可直接地或通过中间体（诸如，例 如，本领域已知的连接体）间接地将可检测的物质偶联或缀合至抗体。见， 例如，美国专利号4,741,900关于可被缀合至抗体用作根据本发明的诊断 剂的金属离子。可通过将抗体偶联至可检测的物质实现此诊断和检测，所 述可检测的物质包括但不限于，多种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物诸如但不限于链 亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质诸如但不限于伞形酮、荧光素、 异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白； 发光物质诸如但不限于鲁米诺；生物发光物质诸如但不限于萤光素酶、萤 光素和水母发光蛋白；放射性物质诸如但不限于铋（²¹³Bi）、碳（¹⁴C）、铬 （⁵¹Cr）、钴（⁵⁷Co）、氟（¹⁸F）、钆（¹⁵³Gd、¹⁵⁹Gd）、镓（⁶⁸Ga、⁶⁷Ga）、锗 （⁶⁸Ge）、钬（¹⁶⁶Ho）、铟（¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In）、碘（¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、 ¹²¹I）、镧（¹⁴⁰La）、镥（¹⁷⁷Lu）、锰（⁵⁴Mn）、钼（⁹⁹Mo）、钯（¹⁰³Pd）、磷（³²P）、 镨（¹⁴²Pr）、钷（¹⁴⁹Pm）、铼（¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re）、铑（¹⁰⁵Rh）、钌（⁹⁷Ru）、钐 （¹⁵³Sm）、钪（⁴⁷Sc）、硒（⁷⁵Se）、锶（⁸⁵Sr）、硫（³⁵S）、锝（⁹⁹Tc）、铊（²⁰¹Ti）、 锡（¹¹³Sn、¹¹⁷Sn）、氚（³H）、氙（¹³³Xe）、镱（¹⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb）、钇（⁹⁰Y）、 锌（⁶⁵Zn）；使用多种正电子放射断层造影术的放射正电子的金属和非放射 性顺磁金属离子。

可将本发明的分子缀合至第二抗体以形成抗体复共轭对缀合物 （antibody heteroconjugate），如由Segal在美国专利号4,676,980中所描述 的。此类复共轭对缀合物抗体可另外与半抗原（诸如荧光素，等）、或与 细胞标志物（例如，4-1-BB、B7-H4、CD4、CD8、CD14、CD25、CD27、 CD40、CD68、CD163、CTLA4、GITR、LAG-3、OX40、TIM3、TIM4、 TLR2、LIGHT、ICOS、B7-H3、B7-H7、B7-H7CR、CD70、CD47，等） 或与细胞因子（例如，IL-7、IL-15、IL-12、IL-4、TGF-β、IL-10、IL-17、 ΙFΝγ、Flt3、BLys）或趋化因子（例如，CCL21）等结合。

可将本发明的分子附着至固相支持体，其对于靶标抗原或能够与通过 与本发明的抗体或抗原结合片段结合被固定在支持体上的靶标抗原结合 的其他分子的免疫分析或纯化特别有用。此类固相支持体包括但不限于， 玻璃、纤维素、聚丙烯酸酯、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

本发明另外包括编码任何此类抗体、融合蛋白或片段的核酸分子 （DNA或RNA）和能够传递或复制此核酸分子的载体分子（诸如质粒）。 核酸可以是单链的、双链的，可包含单链和双链部分二者。

A.本发明优选的调节剂组合物

本发明特别涉及与B7-H1或与PD-1免疫特异性结合和/或调节受试者 中B7-H1与PD-1结合的能力的抗体。如本文所用的，“受试者”优选是哺 乳动物诸如非灵长类动物（例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等）和灵长 类动物（例如，猴和人），最优选地人。本发明因此特别涉及与人B7-H1 或与人PD-1免疫特异性结合和调节人或人组织中（原位或离体）B7-H1 与PD-1结合的能力的人源化抗体和其抗原结合片段。

最优选地，此类抗体和抗原结合片段将具有调节（特别当以内源浓度 表达时且）排列在受试者的APC表面的B7-H1与（特别当以内源浓度表 达时且）排列在此受试者的T细胞表面的PD-1的结合且反之亦然的能力 的足够的亲合力。术语“内源浓度”指正常细胞、癌细胞或被感染的细胞中 天然表达（即，不存在表达载体或重组启动子时）的内源分子的水平。

在一个实施方案中，此调节将包含抑制或以其他方式干扰此（优选内 源表达并）排列的B7-H1和此（优选内源表达并）排列的PD-1的结合。 在可选的实施方案中，此调节将包含增强或另外便于内源表达并排列的 B7-H1和内源表达并排列的PD-1的结合。在又另一个实施方案中，此调 节包括直接促进，据此抗-B7-H1或抗-PD-1的结合触发通过对应的受体的 信号转导。

（1）优选的抗-人B7-H1抗体和它们的CDR

根据本发明，可通过筛选杂交瘤系以确定产生人B7-H1免疫特异性的 抗体的那些杂交瘤系并随后任选地筛选此类系中关于呈现调节活性（例 如，中和活性、促进活性、被改变的信号转导活性，等）的那些系制备此 类分子。本发明特别提供了抗-人B7-H1克隆：1E12、1F4、2G11、3B6和 3D10。

将由抗-人B7-H1克隆表达的抗体测序以显示它们的可变域。CDR序 列呈粗体和下划线显示：

抗-人B7-H1克隆1E12

轻链可变区：

重链可变区：

抗-人B7-H1克隆1F4

轻链可变区：

重链可变区：

抗-人B7-H1克隆2G11

轻链可变区：

重链可变区：

抗-人B7-H1克隆3B6

轻链可变区：

重链可变区：

抗-人B7-H1克隆3D10：

轻链可变区：

重链可变区：

（2）优选的抗-人PD-1抗体和它们的CDR

可选地，可通过筛选杂交瘤系以确认产生人PD-1免疫特异性的抗体 的那些杂交瘤系及随后筛选此类系中关于呈现调节活性（例如，中和活性、 促进活性、被改变的信号转导活性，等）的那些系制备此类抗体。本发明 特别提供了抗-人PD-1克隆：1E3、1E8和1H3。

将由抗-人PD-1克隆表达的抗体测序以显示它们的可变域。CDR序列 呈粗体和下划线显示：

抗-人PD-1克隆1E3：

轻链可变区：

重链可变区：

抗-人PD-1克隆1E8：

轻链可变区：

重链可变区：

抗-人PD-1克隆1H3：

轻链可变区：

重链可变区：

（3）本发明的抗-人B7-H1和抗-人PD-1抗体的共有CDR

进行所鉴定的抗体的CDR的分析以鉴定将提供相似的结合属性的共 有CDR序列和可能的变体CDR序列。根据表1使用Blosum62.iij分析计 算此变体CDR。表1展示Blosum62.iij取代分数。分数越高取代越保守并 因此该取代将较不可能影响功能。

本发明允许具有1、2、3、4、5或6个变体CDR的新抗体和抗原结 合片段的形成。由于本发明的方法已鉴定了相当数量的不同的CDR，本发 明允许有可能是特定的经鉴定的CDR的任何变体中所需的CDR残基的识 别。此类残基在表2、表3、表4和表5中呈粗体显示。关于被发现在所 比较的CDR中不同的那些残基，表1的取代分数提供了用于确定所允许 的取代的特性的方法。例如，如果特定CDR的特定残基被发现作为R或S 而不同（vary as R or S），那么由于R和S具有取代分数-1，具有-1或更大 的取代分数的对于R或S的任何取代可与所观察到的变体（R或S）同样 可能地（或比R或S更有可能地）创造具有与特定CDR的结合属性足够 相似的结合属性的变体CDR以允许采用变体CDR替代特定CDR以形成 功能抗-B7-H1或抗-PD-1抗体或抗原结合片段。对于每一个位置，选择具 有较高取代分数的残基相比于选择具有较低取代分数的残基是优选的。

表2展示抗-B7-H1抗体的轻链CDR分析并提供了本发明的所观察到 的及优选的变体轻链抗-B7-H1CDR的共有序列。

表3展示抗-B7-H1抗体的重链CDR分析并提供了本发明的所观察到 的及优选的变体抗-B7-H1重链CDR的共有序列。

因此，除了具备抗-B7-H1抗体：1E12、1F4、2G11、3B6和3D10的 CDR的抗体和其抗原结合片段之外，本发明另外提供了具备具有以上描述 的轻链和/或重链共有序列的CDR的抗体和其抗原结合片段。

表4展示抗-PD-1抗体的轻链CDR分析并提供了本发明的所观察到的 及优选的变体轻链抗-PD-1CDR的共有序列。

表5展示抗-PD-1抗体的重链CDR分析并提供了本发明的所观察到的 及优选的变体抗-PD-1重链CDR的共有序列。

因此，除了具备抗-PD-1抗体：1E3、1E8和1H3的CDR的抗体和其 抗原结合片段之外，本发明另外提供了具备具有以上描述的轻链和/或重链 共有序列的CDR的抗体和其抗原结合片段。

本发明包含抗体或其片段，所述抗体或其片段包含与通过任何以上的 克隆制备的小鼠单克隆抗体的可变的重链和/或轻链的氨基酸序列至少 45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%一致的可变的重 链和/或可变的轻链的氨基酸序列，且所述抗体或其片段呈现与B7-H1或 PD-1的免疫特异性结合。本发明还包含抗体或其片段，所述抗体或其片段 包含与以上列举的克隆的CDR的氨基酸序列至少45%、至少50%、至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、或至少99%一致的CDR，且所述抗体或其片段呈 现与B7-H1或PD-1的免疫特异性结合。可通过BLAST蛋白比较确定两 条氨基酸序列的百分数同一性的确定。

在特定的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段将包含以上描 述的优选的抗体的CDR的一个、两个、三个、四个、五个或更优选地全 部六个并将呈现与人B7-H1或PD-1结合的能力。

B.本发明优选的组合物的治疗和预防性用途

本发明特定地涉及免疫特异性结合人B7-H1或人PD-1、和/或由于此 类分子（B7-H1或PD-1）在受试者（例如，人患者）中内源表达和排列而 能够调节B7-H1和PD-1之间结合、和/或能够调节通过PD-1或B7-H1的 信号转导的分子（特别地抗体或它们的抗原结合片段）的治疗和/或预防性 用途。

如本文所用的，术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”、“治疗 （treatment）”和“治疗用途”指消除、减少或改善由B7-H1和PD-1的互作 而加重的疾病或疾患的一种或多种症状。如本文所用的，“治疗有效量”指 足够介导此类症状的临床相关的消除、减少或改善的治疗剂的量。如果其 强度足够影响接受的受试者的健康或预后，则效果是临床相关的。治疗有 效量可以指足够推迟或最小化疾病的发作，例如推迟或最小化癌症的扩散 的治疗剂的量。治疗有效量还可以指在疾病的治疗或管理中提供治疗益处 的治疗剂的量。此外，关于本发明的治疗剂的治疗有效量指在疾病的治疗 或管理中提供治疗益处，例如，足够增强足够治疗或管理疾病的治疗抗体 的治疗疗效的单独或与其他治疗方法组合的治疗剂的量。

如本文所用的，术语“预防性剂”指在检测疾患或疾病的任何症状之前 可被用于预防此疾患或疾病的剂。“预防有效”量是足够介导此保护的治疗 剂的量。治疗有效量还可以指在疾病的预防中提供预防益处的预防性剂的 量。此外，关于本发明的预防性剂的预防有效量指在疾病的预防中提供预 防益处的单独或与其它剂组合的预防性剂的量。

本文提供的施用的剂量的量和频率被术语治疗有效和预防有效包含。 剂量和频率还将典型根据每一名患者的特定因素，取决于所施用的特定的 治疗或预防性剂、癌症的严重程度和类型、施用途径、及患者的年龄、体 重、应答和既往病史而不同。可由本领域技术人员通过考虑此类因素并根 据以下，例如，文献中所报道的剂量和Physician’s Desk Reference（2002 年，第56版）中所建议的剂量选择适合的方案。

1.免疫系统的上调节因子（Up-Modulator）的用途

在优选的实施方案中，此类抗体和片段在靠近并破坏B7-H1—PD-1结 合位点的B7-H1或PD-1的一个或多个位点处与这些抗原结合。如以上讨 论的，PD-1和B7-H1之间的互作抑制T细胞的增殖并减少多个细胞因子 的产生（见，Sharpe,A.H.等人(2002)“The B7-CD28Superfamily,”Nature Rev. Immunol.2:116-126）。因此，在优选的实施方案中，施用本发明的分子至 受试者通过对抗B7-H1—PD-1结合而上调受试者的免疫系统。在另一个实 施方案中，抗-PD-1抗体的亲合力和/或亲和力可以是使得其仅结合至（并 阻断B7-H1结合至）表达非常高水平的PD-1的T细胞，该T细胞是被耗 竭或功能异常的T细胞，并因此允许该细胞群体的特异性靶向。因此，本 发明涉及本发明的抗体介导IFN-γ的增加的产生的用途。因此，本发明涉 及此类抗体在用IFN-γ是可治疗的疾病和病症诸如卵巢癌和其他类型的癌 症、慢性肉芽肿性疾病、骨硬化病、遗传性脊髓性共济失调（Friedreich's  ataxia）等的治疗中的用途。另外，本发明特别涉及本发明的抗体介导增加 的T细胞增殖的用途。因此，其涉及此类抗体在通过增加T细胞增殖是可 治疗的诸如以下的疾病和病症的治疗中的用途：AIDS；严重联合免疫缺陷 型（SCID）；Omenn综合征；软骨毛发发育不全；器官或组织同种异体移 植和化疗的T细胞丢失或消融事件；低丙球蛋白血症；X连锁无丙种球蛋 白血症；暂时性低丙种球蛋白血症；异常丙种球蛋白血症；IgA缺乏；IgG 缺乏；IgM缺乏；高IgM综合症；Wiskott-Aldrich综合症；高IgE综合症； 常见变异型免疫缺陷；ICF综合症；胸腺发育不全（例如，Di George综合 症；Nezelof综合症；共济失调毛细血管扩张症）；嘌呤核苷磷酸化酶缺乏； 腺苷脱氨酶缺乏；ZAP70缺乏；裸淋巴细胞综合征；白血球减少症；淋巴 细胞减少症（例如，特发性CD4+淋巴细胞减少症）；或补体缺乏。本发明 特别涉及本发明的抗体介导IFN-γ的增加的产生和增加的T细胞增殖二者 的用途。

免疫系统的上调在癌症和慢性感染的治疗中是特别需要的，并因此本 发明在此类疾患的治疗中具有效用。当HIV感染时，PD-1和B7-H1二者 都是过量表达的（Xu,Huanbin等人(2010)“Increased B7-H1Expression on  Dendritic Cells Correlates with Programmed Death1Expression on T Cells in  Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques and May Contribute to T  Cell Dysfunction and Disease Progression,”J.Immunol.185:7340-7348； Grabmeier-Pfistershammer,K.等人(2011)“Identification of PD-1as a Unique  Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on  Treatment,”J Acquir.Immune Defic.Syndr.56(2):118-124）。因此，B7-H1在 此类细胞上的表达可被用于诊断人中的HIV。因此，本发明的抗-PD-1和 抗-B7-H1抗体作为用于HIV感染和AIDS治疗的治疗剂具有特定效用。如 本文所用的，术语“癌症”指由细胞的异常失控增长导致的赘生物或肿瘤。 如本文所用的，癌症明确包括白血病和淋巴瘤。术语“癌症”指涉及具有转 移至末梢部位的潜力并呈现不同于非癌细胞的表型性状的表型性状的细 胞的疾病，例如，在三维基质诸如软琼脂中集落的形成或在三维基底膜或 细胞外基质制剂中管状网络或网络样基质（matrice）的形成。非癌细胞在 软琼脂中不形成集落并在三维基底膜或细胞外基质制剂中形成不同的球 形-样的结构。

可通过本发明的方法和组合物被治疗或预防的癌症和相关的疾患包 括但不限于以下：白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血 病、急性髓细胞白血病诸如成髓细胞的、原髓细胞的、髓单核细胞的、单 核细胞的、红白血病白血病和骨髓增生异常综合征、慢性白血病诸如但不 限于慢性髓细胞（粒细胞）白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病； 真性红细胞增多症；淋巴瘤诸如但不限于霍奇金疾病淋巴瘤或非霍奇金疾 病淋巴瘤（例如，弥漫性间变性淋巴瘤激酶（ALK）阴性的大B细胞淋巴 瘤（DLBCL）；弥漫性间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性的大B细胞淋巴瘤 （DLBCL）；间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性的ALK+间变性大细胞淋巴 瘤（ALCL）、急性髓细胞性淋巴瘤（AML））；多发性骨髓瘤诸如但不限于 郁积型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、 孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；巨球蛋白血症；意义未定 的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链疾病；骨和结缔 组织肉瘤，诸如但不限于，骨肉瘤（bone sarcoma）、骨肉瘤（osteosarcoma）、 软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、 软组织肉瘤、血管肉瘤（血管内皮瘤）、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑 肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑 肿瘤，包括但不限于，神经胶质瘤、星细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、 少突神经胶质瘤、非神经胶质肿瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞 瘤、脑膜瘤、成松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、脑原发淋巴瘤、乳腺癌， 包括但不限于，腺癌、小叶（小细胞）癌、导管内癌、乳腺髓样癌、粘液 性乳腺癌、筒状乳房癌、乳头乳腺癌、佩吉特氏病和炎性乳腺癌；肾上腺 癌，包括但不限于，嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌诸如但不限于 乳头状或卵泡甲状腺癌、髓样甲状腺癌和未分化甲状腺癌；胰腺癌，包括 但不限于，胰岛瘤、胃泌素瘤、高血糖素瘤、血管活性肠肽瘤、生长抑素 分泌肿瘤、和良性肿瘤或胰岛细胞瘤；垂体癌，包括但不限于，库兴氏病、 泌乳素瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，包括但不限于，眼部黑色素瘤诸 如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑素瘤、和睫状体黑色素瘤、和成视网膜细胞瘤； 阴道癌，包括但不限于，鳞状细胞癌、腺癌、和黑色素瘤；外阴癌，包括 但不限于，鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤、和佩吉特 氏病；宫颈癌，包括但不限于，鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌包括但不限于， 子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，包括但不限于，卵巢上皮癌、交界性肿 瘤、生殖细胞肿瘤和间质瘤；食管癌，包括但不限于，鳞癌、腺癌、腺样 囊性癌、黏液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌、 和燕麦细胞（小细胞）癌；胃癌，包括但不限于，腺癌、熏状（息肉状）、 溃疡、表浅扩散、广泛扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤； 结肠癌；直肠癌；肝癌，包括但不限于，肝细胞癌和肝胚细胞瘤、胆囊癌 包括但不限于，腺癌；胆管癌，包括但不限于，乳头状、结节性和弥漫性 胆管癌；肺癌，包括但不限于，非小细胞肺癌、鳞状细胞癌（表皮样癌）、 腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌，包括但不限于，胚组织瘤、精原 细胞瘤、间变性、经典的（典型的）、精原细胞的、非精原细胞瘤、胚胎 性癌、畸胎癌、绒毛膜癌（卵黄囊瘤）、前列腺癌，包括但不限于，腺癌、 平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；阴茎癌（penal cancer）；口腔癌，包括但不限 于，鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，包括但不限于，腺癌、黏液表皮样 癌和腺样囊性癌；鼻咽癌，包括但不限于，鳞状细胞癌和疣状癌；皮肤癌， 包括但不限于，基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、浅表扩散性黑素瘤、 结节性黑素瘤、小痣恶性黑色素瘤、肢端黑色素瘤；肾癌，包括但不限于， 肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌（肾盂和/或输尿管 （uterer））；肾胚细胞瘤（Wilms’tumor）；膀胱癌，包括但不限于，移行细 胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括黏液肉瘤、骨原性肉 瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、 上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌 （关于此类疾患的综述，见Fishman等人，1985,Medicine，第2版， J.B.Lippincott Co.,Philadelphia and Murphy等人，1997,Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,and Recovery,Viking  Penguin,Penguin Books U.S.A.,Inc.,United States of America）。

因此，本发明的方法和组合物还在包括（但不限于）以下的多种癌症 或其他异常的增值性疾病的治疗和预防中是有用的：癌，包括膀胱癌、乳 腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲 状腺癌和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴系造血系统肿瘤，包括白血病、 急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋 巴瘤、Berketts淋巴瘤；骨髓系统的造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓性 白血病和早幼粒细胞性白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹 肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤 和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星细胞瘤、成神经细胞 瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉 瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、 精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌。其还涉及通过本发明的方法和组 合物还将治疗由凋亡中的畸变造成的癌症。此类癌症可包括但不限于，滤 泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤、 及癌前病变诸如家族性腺瘤息肉病和骨髓增生异常综合征。在特定的实施 方案中，通过本发明的方法和组合物治疗或预防卵巢、膀胱、乳腺、结肠、 肺、皮肤、胰腺或子宫中的恶性或不良增殖变化（诸如化生和不典型增生） 或过度增殖疾患。在其他特定的实施方案中，通过本发明的方法和组合物 治疗或预防肉瘤、黑色素瘤或白血病。

虽然通过多种机制，癌细胞在它们的形成过程中获得一组特有的功能 能力。此能力包括回避凋亡、自给自足的生长信号、对抗-生长信号不敏感、 组织浸润/转移、潜力无限的复制能力和持续的血管生成。术语“癌细胞”指 包含恶化前和恶化的癌细胞二者。在一些实施方案中，癌症指已保持在局 部的良性肿瘤。在其他实施方案中，癌症指已浸润并毁坏临近的机体结构 并扩散到远处部位的恶性肿瘤。在又其他实施方案中，癌症与特定的癌抗 原（例如，潘癌抗原（KS1/4）、卵巢癌抗原（CA125）、前列腺特异性抗 原（PSA）、癌胚抗原（CEA）、CD19、CD20、HER2/神经鞘，等）相关。

本发明的抗体和抗体片段在用于与表达异常高水平的PD-1的细胞（例 如，耗竭的T细胞、B细胞、单核细胞，等）有关的癌症的治疗中特别有 用（Youngblood,B.(2011)“Chronic Virus Infection Enforces Demethylation Of  The Locus That Encodes PD-1In Antigen-Specific CD8(+)T Cells,”Immunity 35(3):400-412；Spahn,J.等人(2011)“Ineffective CD8(+)T-Cell Immunity To  Adeno-Associated Virus Can Result In Prolonged Liver Injury And  Fibrogenesis,”Amer.J.Pathol.179(5):2370-2381；Wang,C.等人(2011) “Phenotype,Effector Function,And Tissue Localization Of PD-1-Expressing  Human Follicular Helper T Cell Subsets,”BMC Immunol.12:53,1-15； Eichbaum,Q.(2011)“PD-1Signaling In HIV And Chronic Viral Infection  Potential For Therapeutic Intervention?”Curr.Med.Chem. 18(26):3971-3980；Hallett,W.H.等人(2011)“Immunosuppressive Effects Of  Multiple Myeloma Are Overcome By PD-L1Blockade,”Biol Blood Marrow  Transplant.17(8):1133-1145；Ni,L.等人(2010)“PD-1Modulates Regulatory T  Cells And Suppresses T-Cell Responses In HCV-Associated Lymphoma,” Immunol.Cell.Biol.89(4):535-539；Inozume,T.等人(2010)“Selection Of  CD8+PD-1+Lymphocytes In Fresh Human Melanomas Enriches For  Tumor-Reactive T Cells,”J.Immunother.33(9):956-964；和Jin,H.T.等人(2010) “Cooperation Of Tim-3And PD-1In CD8T-Cell Exhaustion During Chronic  Viral Infection,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)107(33):14733-14738）。

与如以上讨论的将其应用至肿瘤类似，本发明的抗体和抗原结合片段 可被单独使用，或作为佐剂与疫苗或与抗菌剂组合以刺激针对毒素或自身 抗原或针对病原体（例如，病毒，诸如HIV、HTLV、肝炎病毒、流感病 毒、呼吸道合胞体病毒、牛痘病毒、狂犬病病毒；细菌，诸如分枝杆菌属 （Mycobacteria）、葡萄球菌属（Staphylococci）、链球菌属（Streptococci）、 肺炎球菌属（Pneumonococci）、脑膜炎球菌属（Meningococci）、淋球菌属 （Conococci）、克雷伯氏杆菌属（Klebsiella）、变形杆菌属（Proteus）、沙 雷菌属（Serratia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、军团杆菌属（Legionella）、 棒状杆菌属（Corynebacteria）、沙门氏菌属（Salmonella）、弧菌属（Vibrio）、 梭菌属（Clostridia）、杆菌属（Bacilli）、巴氏杆菌属（Pasteurella）、钩端 螺旋体（Leptospirosis）、包特氏菌属（Bordatella）的病原体、且特别是与 霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、瘟疫和莱姆病相关的此类病原体；或真 菌或寄生虫病原体，诸如假丝酵母属（Candida）（白色假丝酵母（albicans）、 克柔假丝酵母（krusei）、光滑假丝酵母（glabrata）、热带假丝酵母 （tropicalis），等）、隐球菌属（Cryptococcus）、曲霉属（Aspergillus）（烟 曲霉（jumigatus）、黑曲霉（niger），等）、毛霉属（Genus Mucorales）（毛 霉菌（mucor）、犁头霉菌（absidia）、如根霉（rhizophus））、孢子丝菌属 （Sporothrix）（申克氏孢子丝菌（schenkii））、芽生菌属（Blastomyces）（霉 菌皮炎芽生菌（dermatitidis））、副球孢子菌属（Paracoccidioides）（巴西副 球孢子菌（brasiliensis））、球孢子菌属（Coccidioides）（粗球孢子菌（immitis）） 和组织胞浆菌属（Histoplasma）（荚膜组织胞浆菌（capsulatum））、内阿米 巴属（Entamoeba）、溶组织内阿米巴（histolytica）、结肠小袋虫（Balantidium  coli）、福氏耐格原虫（Naegleria fowleri）、棘阿米巴属（Acanthamoeba sp.）、 兰氏贾第鞭毛虫（Giardia lambia）、隐孢子虫属（Cryptosporidium sp.）、卡 氏肺孢子虫（Pneumocystis carinii）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、田 鼠巴贝虫（Babesia microti）、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）、克氏锥虫 （Trypanosoma cruzi）、弓形虫（Toxoplasma gondi），等）、孢子丝菌属 （Sporothrix）、芽生菌属（Blastomyces）、副球孢子菌属（Paracoccidioides）、 球孢子菌属（Coccidioides）、组织胞浆菌属（Histoplasma）、内阿米巴属 （Entamoeba）、溶组织内阿米巴（Histolytica）、肠袋虫属（Balantidium）、 耐格里属（Naegleria）、棘阿米巴属（Acanthamoeba）、贾第虫属（Giardia）、 隐孢子虫属（Cryptosporidium）、肺孢子虫属（Pneumocystis）、疟原虫属 （Plasmodium）、巴贝虫属（Babesia）或锥虫属（Trypanosoma），等的免 疫应答。因此，本发明的抗体和抗原结合片段在传染病的治疗中具有效用。

2.免疫系统的下调节因子的用途

在可选的实施方案中，采用本发明的抗-B7-H1或抗-PD-1抗体以制备 B7-H1或PD-1的抗个体基因型肽或抗体（Wallmann,J.等人(2010)“Anti-Ids  in Allergy:Timeliness of a Classic Concept,”World Allergy Organiz.J. 3(6):195-201；Nardi,M.等人(2000)“Antiidiotype Antibody Against Platelet  Anti-Gpiiia Contributes To The Regulation Of Thrombocytopenia In HIV-1-ITP  Patients,”J.Exp.Med.191(12):2093-2100）或模拟物（Zang,Y.C.等人(2003) “Human Anti-idiotypic T Cells Induced By TCR Peptides Corresponding To A  Common CDR3Sequence Motif In Myelin Basic Protein-Reactive T Cells,”Int. Immunol.15(9):1073-1080；Loiarro,M.等人（2010年4月8日电子出版） “Targeting TLR/IL-1R Signalling In Human Diseases,”Mediators Inflamm. 2010:674363)。此类分子作为B7-H1或PD-1的替代，并因此它们至受试者 的施用通过模拟或促进B7-H1-PD-1结合下调此受试者的免疫系统。此类 分子在移植物抗宿主病的治疗中具有效用。类似地，i）增强此类抗体和此 受体/配体之间的结合或ii）当直接与B7-H1或PD-1结合时触发信号转导 的激动剂抗体，作为B7-H1-PD-1信号传导的激动剂具有效用并因此在通 过直接或间接地促进受体活性治疗炎症和自身免疫病中具有效用。

呈现与PD-1和B7-H1二者免疫特异性结合的双特异性抗体能够与 APC和T细胞二者结合并因此促进APC和T细胞的共定位。此共定位促 进此类细胞经由未与抗体复合的B7-H1和PD-1分子或通过共抑制分子结 合在一起的能力。此结合提供了接受者的免疫系统的下调。

免疫系统的下调在炎症和自身免疫疾病和移植物抗宿主病（GvHD） 的治疗中是所需的。可通过施用本发明的抗体被治疗的自身免疫疾患的实 例包括，但不限于，斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性爱 迪生氏病、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫 性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞氏 病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜性皮炎（celiac sprue-dermatitis）、慢 性疲劳免疫功能紊乱综合征（CFIDS）、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病 变、变应性肉芽肿性血管炎、疤痕性类天疱疮、CREST综合症、冷凝集素 疾病、克罗恩氏病、盘状红斑狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌 痛肌纤维组织炎、血管球性肾炎、格雷夫斯氏病（Graves’disease）、 Guillain-Barre、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性 紫癜（ITP）、IgA神经病变、幼年型关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、梅尼 埃尔氏病、混合性结缔组织疾病、多发性硬化、视神经脊髓炎（NMO）、1 型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性 多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌 炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、银屑病性 关节炎、Raynauld症候、赖特综合征、风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病、 干燥综合征、全身肌强直综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、 颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血 管炎诸如疱疹样皮炎血管炎、白癫风和韦格纳肉芽肿病。

根据本发明的方法可被预防、治疗或管理的炎症疾患的实例包括，但 不限于，哮喘、脑炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病（COPD）、过敏性疾 病、感染性休克、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、 炎症性骨溶解和由慢性病毒或细菌感染导致的慢性炎症。

因此，本发明的抗体和抗原结合片段在炎症和自身免疫疾病的治疗中 具有效用。

C.施用方法

多种递送系统是已知的并可被用于施用本发明的治疗或预防性组合 物，例如，在脂质体、微米粒子、微米胶囊中包封、能够表达抗体或融合 蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用（见，例如，Wu and Wu,1987,J.Biol. Chem.262:4429-4432）、构建核酸作为逆转录或其他载体的部分，等。

施用本发明的人源化的抗体的方法包括，但不限于，注射，如通过肠 胃外的施用（例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下）、硬膜外和粘 膜（例如，鼻内和口服途径）。在特定的实施方案中，肌内、静脉内或皮 下施用本发明的抗体。组合物可通过任何方便的途径，例如，通过输注或 弹丸注射、通过经由上皮或粘膜皮肤衬里（例如，口腔粘膜、直肠和肠粘 膜，等）的吸收被施用并可与其他生物活性剂一起被施用。施用可以是全 身性或局部的。另外，还可采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾 器和具有雾化剂的制剂。见，例如，美国专利号6,019,968；5,985,20； 5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和 PCT公布号WO92/19244；WO97/32572；WO97/44013；WO98/31346； 和WO99/66903。在特定的实施方案中，将本发明的药物组合物局部施用 至需要治疗的区域可能是所需的；这可通过例如，且不以限制的方式，局 部输注、通过注射、或通过植入物获得，所述植入物是多孔的、无孔的或 凝胶状材料，包括膜，诸如硅橡胶膜或纤维。优选地，当施用本发明的抗 体时，必须小心使用抗体或融合蛋白不会被其吸附的材料。

在一些实施方案中，在用于靶向递送本发明的抗体的脂质体中配制本 发明的人源化的或嵌合抗体。脂质体是由同中心有序的磷脂双层组成的、 包封水相的囊泡。脂质体典型包含多种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂。 脂质体的组分在双层结构中排列，与生物膜的脂质排列类似。脂质体是特 别优选的递送载体，部分由于它们的生物相容性、低免疫原性和低毒性。 用于制备脂质体的方法是本领域已知的且被包含在本发明内，见，例如， Epstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688；Hwang等人，1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4；美国专利号4,485,045和4,544,545。

本发明还包含制备具有延长的血清半衰期，即，增加的循环时间的脂 质体的方法，诸如美国专利号5,013,556中公开的方法。用于本发明方法 的优选的脂质体没有被从循环中快速清除，即，未被单核吞噬细胞系统 （MPS）吸收。本发明包含使用本领域技术人员已知的常规方法制备的空 间稳定脂质体。尽管不想被特定的作用机制所限制，空间稳定脂质体包含 具有体积大的且高度灵活的亲水性部分的脂质成分，其减少了脂质体与血 清蛋白的不想要的反应，减少了与血清成分的调理作用并减少了被MPS 识别。优选使用聚乙二醇制备空间稳定脂质体。关于脂质体和空间稳定脂 质体的制备，见，例如，Bendas等人，2001BioDrugs,15(4):215-224；Allen 等人，1987FEBS Lett.223:42-6；Klibanov等人，1990FEBS Lett.,268:235-7； Blum等人，1990,Biochim.Biophys.Acta.,1029:91-7；Torchilin等人，1996, J.Liposome Res.6:99-116；Litzinger等人，1994,Biochim.Biophys.Acta, 1190:99-107；Maruyama等人，1991,Chem.Pharm.Bull,39:1620-2；Klibanov 等人，1991,Biochim Biophys Acta,1062;142-8；Allen等人，1994,Adv.Drug  Deliv.Rev,13:285-309。本发明还包含适于特定组织靶向，见，例如，美国 专利号4,544,545，或特定细胞靶向，见，例如美国专利申请公布号 2005/0074403的脂质体。可通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和 PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺（PEG-PE）的脂质组合物产生用于本发明的 组合物和方法的特别有用的脂质体。通过确定的孔径的滤器压制脂质体以 产生具有期望直径的脂质体。在一些实施方案中，使用先前描述的方法可 将本发明的抗体的片段，例如，F(ab')缀合至脂质体，见，例如，Martin等 人，1982,J.Biol.Chem.257:286-288。

还可将本发明的人源化或嵌合的抗体配制为免疫脂质体。免疫脂质体 指脂质体组合物，其中将本发明的抗体或其片段共价地或非共价地连接至 脂质体的表面。将抗体连接至脂质体表面的化学过程是本领域已知的并被 包含在本发明内，见，例如，美国专利号6,787,153；Allen等人，1995,Stealth  Liposomes,Boca Rotan:CRC Press,233-44；Hansen等人，1995,Biochim. Biophys.Acta,1239:133-144。在最优选的实施方案中，用于本发明的方法 和组合物的免疫脂质体被进一步空间稳定。优选地，将本发明的人源化的 抗体共价或非共价地连接至疏水性锚形物，其稳定地扎根于脂质体的脂质 双层。疏水性锚形物的实例包括，但不限于磷脂，例如，磷脂酰乙醇胺（PE）、 磷脂酰肌醇（PI）。为了在抗体和疏水性锚形物之间实现共价连接，可使用 本领域任何已知的生物化学策略，见，例如，J.Thomas August,ed.,1997, Gene Therapy:Advances in Pharmacology，第40卷，Academic Press,San  Diego,CA，第399-435页。例如，抗体分子上的功能基团可与缔合疏水性 锚形物的脂质体上的活性基团反应，例如，抗体上的赖氨酸侧链的氨基可 耦合至缔合N-戊二酰-磷脂酰乙醇胺的用水溶性碳化二亚胺活化的脂质 体；或还原抗体的硫醇基团可经由硫醇反应锚形物，诸如吡啶硫丙酰-磷脂 酰乙醇胺（pyridylthiopropionylphosphatidylethanolamine）耦合至脂质体。 见，例如，Dietrich等人，1996,Biochemistry,35:1100-1105；Loughrey等人， 1987,Biochim.Biophys.Acta,901:157-160；Martin等人，1982,J.Biol.Chem. 257:286-288；Martin等人，1981,Biochemistry,20:4429-38。尽管不想被特 定的作用机制限制，包含本发明抗体的免疫脂质体制剂作为治疗剂特别有 效，由于它们将抗体递送至靶细胞的细胞质，即，包含抗体所结合的受体 的细胞。免疫脂质体优选在血液、特定的靶细胞中具有增加的半衰期，并 可内化到靶细胞的细胞质中从而避免治疗剂的丢失或被内溶酶体的通路 所降解。

本发明的免疫脂质体组合物包含一种或多种形成囊泡的脂质、本发明 的抗体或其片段或衍生物、和任选地亲水性聚合物。形成囊泡的脂质优选 是具有两条烃链的脂质，诸如酰基链和极性头部基团。形成囊泡的脂质的 实例包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、 鞘磷脂和糖脂，例如，脑苷脂、神经节苷脂。在本发明的制剂中有用的另 外的脂质是本领域技术人员已知的并被包含在本发明内。在一些实施方案 中，免疫脂质体组合物还包含增加脂质体的血清半衰期的亲水性聚合物， 例如，聚乙二醇和神经节苷脂GM1。将亲水性聚合物缀合至脂质体的方法 是本领域众所周知的并被包含在本发明内。关于免疫脂质体和制备它们的 方法的综述，见，例如，美国专利申请公布号2003/0044407；PCT国际申 请公布号WO97/38731、Vingerhoeads等人，1994,Immunomethods, 4:259-72；Maruyama,2000,Biol.Pharm.Bull.23(7):791-799；Abra等人， 2002,Journal of Liposome Research,12(1&2):1-3；Park,2002,Bioscience  Reports,22(2):267-281；Bendas等人，2001BioDrugs,14(4):215-224,J. Thomas August,ed.,1997,Gene Therapy:Advances in Pharmacology，第40 卷，Academic Press,San Diego,CA，第399-435页。

本发明还提供在显示抗体的量的密闭容器诸如安瓿或密封袋 （sachette）中包装本发明的人源化的或嵌合抗体。在一个实施方案中，在 密闭容器中提供本发明的抗体作为干燥无菌冻干的粉末或无水浓缩物并 可被例如，用水或盐水重建至用于施用至受试者的适宜的浓度。优选地， 以至少5mg、更优选至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、 至少45mg、至少50mg、或至少75mg的单位剂量在密闭容器中提供本 发明的抗体作为干燥无菌冻干粉末。应在2℃和8℃之间将本发明的冻干 的抗体储存的它们的原始容器中且抗体应在被重建后的12小时内、优选6 小时内、5小时内、3小时内、或1小时内被施用。在一个可选的实施方 案中，在显示抗体、融合蛋白或缀合的分子的量和浓度的密闭容器中呈液 态提供本发明的抗体。优选地，在密闭容器中提供至少1mg/ml、更优选 至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、 至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少 200mg/ml的抗体的液态抗体。

在制剂中待被采用的精确剂量还将取决于施用的途径和病症的严重 性，并应根据从业者的判断和每一名患者的情况而决定。有效的剂量可从 源自体外或动物模型试验体系的剂量反应曲线而推测。关于本发明包含的 抗体，施用至患者的剂量典型从患者体重的0.01mg/kg至100mg/kg。优 选地，施用至患者的剂量在患者体重的0.01mg/kg和20mg/kg之间、0.01 mg/kg和10mg/kg之间、0.01mg/kg和5mg/kg之间、0.01mg/kg和2mg/kg 之间、0.01mg/kg和1mg/kg之间、0.01mg/kg和0.75mg/kg之间、0.01 mg/kg和0.5mg/kg之间、0.01mg/kg至0.25mg/kg之间、0.01mg/kg至0.15 mg/kg之间、0.01mg/kg至0.10mg/kg之间、0.01mg/kg至0.05mg/kg之 间或0.01mg/kg至0.025mg/kg之间。特别地，本发明涉及被施用至患者 的剂量为0.2mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或10mg/kg。 预测低至0.01mg/kg的剂量将显示可观的药效作用。预测0.10-1mg/kg的 剂量水平是最适宜的。较高的剂量（例如，1-30mg/kg）也将被期望是有 活性的。通常，由于针对外来多肽的免疫应答，人抗体比来自其他物种的 抗体具有更长的人体内的半衰期。因此，较低剂量的人抗体和较少频率的 施用通常是可能的。此外，本发明的抗体或其片段的施用剂量和频率可通 过修饰诸如，例如脂化以增强抗体的摄入和组织渗入而被减少。

在又另一个实施方案中，可在控释或缓释系统中递送组合物。本领域 技术人员已知的任何技术可被用于制备包含本发明的一种或多种抗体的 缓释制剂。见，例如，美国专利号4,526,938；PCT公布WO91/05548；PCT 公布WO96/20698；Ning等人，1996,“Intratumoral Radioimmunotheraphy of  a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy&Oncology39:179-189，Song等人，1995,“Antibody Mediated  Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of  Pharmaceutical Science&Technology50:372-397；Cleek等人，1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular  Application,”Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam 等人，1997,“Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal  Antibody for Local Delivery,”Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater. 24:759-760。在一个实施方案中，可在控释系统中使用泵（见，Langer,上 述；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20；Buchwald等人，1980, Surgery88:507；和Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321:574）。在另一 个实施方案中，可将聚合材料用于实现抗体的控释（见，例如，Medical  Applications of Controlled Release,Langer和Wise（编者），CRC Pres.,Boca  Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design  and Performance,Smolen和Ball（编者），Wiley,New York(1984)；Ranger 和Peppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还见Levy 等人，1985,Science228:190；During等人，1989,Ann.Neurol.25:351；Howard 等人，1989,J.Neurosurg.71:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号 5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号 5,128,326；PCT公布号WO99/15154；和PCT公布号WO99/20253)。用 于缓释制剂的聚合物的实例包括，但不限于，聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)、 聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯/醋酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯 酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐类、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、 聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚乳酸(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)和 聚正酯。在又另一个实施方案中，可将控释系统放置在治疗靶标（例如， 肺）的附近，因此仅需要全身性剂量的一部分（见，例如，Goodson,于 Medical Applications of Controlled Release,上述，第2卷，第115-138页 （1984））。在另一个实施方案中，根据Dunn等人（见U.S.5,945,155）使 用作为控释植入物有用的聚合组合物。这个特定的方法基于生物活性物质 从聚合物系统中原位控释的治疗效果。该植入通常可在需要治疗处理的患 者的身体内的任何地方发生。在另一个实施方案中，使用非聚合的持续递 送系统，据此受试者的身体中的非聚合的植入物被用作药物递送系统。当 植入身体内时，植入物的有机溶剂将从组合物中驱散、分散或浸出进入周 围的组织液中，且非聚合的物质将逐渐地凝结或沉淀以形成固体、微孔基 质（见U.S.5,888,533）。在Langer（1990,Science249:1527-1533）的综述 中讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术都可被用于制备包含 本发明的一种或多种治疗剂的缓释制剂。见，例如，美国专利号4,526,938； 国际公布号WO91/05548和WO96/20698；Ning等人，1996,Radiotherapy &Oncology39:179-189；Song等人，1995,PDA Journal of Pharmaceutical  Science&Technology50:372-397；Cleek等人，1997,Pro.Int'l.Symp.Control. Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等人，1997,Proc.Int'l.Symp.Control  Rel.Bioact.Mater.24:759-760。

在特定的实施方案中，其中本发明的治疗或预防组合物是编码本发明 的抗体或其抗原结合片段的核酸，通过例如使用逆转录病毒载体（见美国 专利号4,980,286）将该核酸构建作为适宜的核酸表达载体的部分并施用其 以致该核酸变为细胞内的、或通过直接注射、或通过使用微米粒子轰击（例 如，基因枪；Biolistic,Dupont），或用脂或细胞表面受体或转染剂涂覆，或 通过施用连接到已知进入细胞核的同源框-样肽的核酸（见例如，Joliot等 人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868）等，该核酸可被体内施 用以促进其所编码的抗体的表达。可选地，可将核酸细胞内引入并并入宿 主细胞DNA内用于通过同源重组表达。

使用本发明的抗体的治疗或预防有效的量的治疗受试者可包含单一 的治疗或，优选地，可包含一系列的治疗。

D.药物组合物

本发明的组合物包含在可被用于单位剂型的制备的药物组合物（即， 适于施用至受试者或患者的组合物）的制造中有用的原料药组合物。此类 组合物包含本文公开的预防或治疗有效量的预防和/或治疗剂或那些剂的 组合和药学上可接受的载体。优选地，本发明的组合物包含本发明的预防 或治疗有效量的人源化抗体和药学上可接受的载体。

在特定实施方案中，术语“药学上可接受”指由美国联邦监管机构或州 政府批准的或在美国药典或其他一般公认药典中列出的用于在动物且更 特别地在人中使用。术语“载体”指稀释剂、佐剂（例如，弗氏佐剂（完全 和不完全））、赋形剂、表面活性剂、冷冻保护剂或用其施用治疗剂的媒介 物。此类药学载体可以是无菌液体，诸如水或油，包括石油、动物、植物 或合成起源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和类似的油。当 静脉施用药物组合物时，水是优选的载体。还可采用盐水溶液和水葡萄糖 和丙三醇溶液作为液态载体，特别地用于可注射的溶液。适合的药物赋形 剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅 胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、丙三醇、丙 烯、乙二醇、水、乙醇、多乙氧基醚等等。如果有需要，该组合物还可包 含少量的湿润或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、 乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等等的形式。

通常，本发明的组合物的成分可呈单位剂型单独地或混合在一起提 供，例如，作为显示活性剂的量的密闭容器诸如安瓿或密封袋中干燥冻干 的粉末或无水浓缩物。其中通过输注施用组合物时，可用包含无菌药物级 水或盐水的输液瓶调制组合物。其中通过注射施用组合物时，可提供用于 注射的一个安瓿的无菌水或盐水以便可在施用之前混合成分。

本发明的组合物可被配制作为中性或盐形式。药学上可接受的盐包 括，但不限于，用阴离子诸如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的 阴离子形成的盐，和用阳离子诸如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙 胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。

E.药盒

本发明提供了包含用本发明的人源化抗体填充的一种或多种容器的 药物包装或药盒。另外，用于治疗疾病有用的一种或多种其他预防或治疗 剂也可被包含在药物包装或药盒中。本发明还提供了包含用本发明的药物 组合物的一种或多种成分填充的一种或多种容器的药物包装或药盒。任选 地，与此（类）容器相关的可以是呈由监管药物或生物产品的制造、使用 或销售的政府机构规定的形式的公告，该公告体现由机构批准的用于人施 用的制造、使用或销售。

本发明提供了可被用于以上方法的药盒。在一个实施方案中，药盒包 含本发明的一种或多种人源化的抗体。在另一个实施方案中，药盒还包含 一种或多种容器中的用于治疗癌症有用的一种或多种其他预防或治疗剂。 在另一个实施方案中，药盒还包含结合与癌症相关的一种或多种癌抗原的 一种或多种细胞毒性抗体。在特定实施方案中，其他预防或治疗剂是化学 治疗剂。在其他实施方案中，预防或治疗剂是生物或激素治疗剂。

F.诊断方法

本发明的抗体和它们的抗原结合片段可被用于诊断目的，诸如以检 测、诊断或监测与B7-H1或PD-1表达相关的疾病、疾患或感染。本发明 提供了疾病、病患或感染，特别是自身免疫疾病的检测或诊断，包含：（a） 使用与此类抗原免疫特异性结合的一种或多种抗体（或其片段）测定受试 者的细胞或组织样品中的B7-H1或PD-1的表达；和（b）比较抗原的水平 与对照水平，例如，正常组织样品中或处理之前的水平，据此，相比于抗 原的对照水平所测定的抗原水平中的增加或降低指示疾病、病患或感染， 或指示受试者对治疗的响应。因此，本发明还提供了用于监测疾病、病患 或感染的进展，包含：（a）使用与此类抗原免疫特异性结合的一种或多种 抗体（或其片段）测定受试者的细胞或组织样品中某个时间点的B7-H1或 PD-1的表达；和（b）在另一个时间点或跨时间进程比较受试者的细胞或 组织样品中B7-H1或PD-1的表达水平，据此，所测定的抗原水平中的增 加或降低指示疾病、病患或感染的进展。本发明另外提供了用于监测对治 疗的响应，包含：（a）使用与此类抗原免疫特异性结合的一种或多种抗体 （或其片段）测定受试者的细胞或组织样品在治疗之前的B7-H1或PD-1 的表达；和（b）在治疗后的一个或多个时间点之前测定受试者的细胞或 组织样品中的B7-H1或PD-1的表达，并比较随时间的推移抗原的水平， 据此，与处理之前的抗原的水平相比，所测定的抗原水平的增加或降低指 示对治疗的响应。优选在免疫测定诸如酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射 免疫测定（RIA）和荧光激活细胞分选术（FACS）中采用此类抗体和片段。

本发明的一个方面涉及此类抗体和片段，特别地与人B7-H1结合的此 类抗体和片段，作为用于体外或原位组织样品或体内细胞中IHC分析的试 剂的用途。例如，由于癌细胞表达而正常组织不表达B7-H1（Dong,H.(2003) “B7-H1Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,”J.Mol. Med.81:281-287），通过此细胞与此类抗体或片段的结合检测B7-H1在细 胞上的存在指示并诊断癌细胞。因此，本发明提供了用于诊断受试者中癌 症的存在的细胞学分析。

已发现Β7-Η1在肿瘤细胞上存在增强了响应肿瘤的T细胞的凋亡（美 国专利号7,794,710）。因此，通过确定癌症患者的肿瘤细胞在它们的表面 呈现Β7-Η1的范围或程度，本发明提供了用于确定癌症的临床意义和其对 于免疫应答将是难治的范围的方法。

类似地，Β7-Η1在淋巴和粘膜树突细胞（二者都是骨髓样和浆细胞样 树突细胞）上表达，且其表达在SIV感染之后显著增加（Xu,Huanbin等 人(2010)“Increased B7-H1Expression on Dendritic Cells Correlates with  Programmed Death I Expression on T Cells in Simian Immunodeficiency  Virus-Infected Macaques and May Contribute to T Cell Dysfunction and  Disease Progression,”J.Immunol.185:7340-7348）。因此，B7-H1在此类细 胞上的表达可被用于诊断人中的HIV。另外，已发现CD8+细胞上的PD-1 表达在HIV感染的情况下被增加（Killian,M.S.等人(2011)“Natural  Suppression of Human Immunodeficiency Virus Type1Replication Is Mediated  by Memory CD8⁺T Cells,”J.Virol.85(4):1696-1705）。因此，与PD-1和CD8 二者结合的抗体在HIV感染和AIDS进展的诊断中具有特定效用。

本发明另外的方面涉及此类抗体和片段，且特别地与人PD-1结合的 此类抗体和片段的用途。PD-1作为慢性免疫活化和T细胞耗竭的标志物具 有特定效用。其在HIV感染的病毒血症患者的T细胞上的表达被增强并与 在这些患者中的病毒载量有关（Khaitan,A.等人(2011)“Revisiting Immune  Exhaustion During HIV Infection,”Curr.HIV/AIDS Rep.8:4-11； Grabmeier-Pfistershammer,K.等人(2011)“Identification of PD-1as a Unique  Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on  Treatment,”J Acquir.Immune Defic.Syndr.56(2):118-124）。因此，PD-1作 为HIV进展的标志物具有特定效用。最优选地，将使用流式细胞术评价 PD-1的表达。通过使用此类抗体和片段，可分析T细胞（其表达PD-1） 的多种参数（例如，细胞计数、细胞尺寸、表型和细胞健康,等），尽管存 在于异质制备物（heterogeneous preparation）中。因此，与PD-1的抗体和 它们的抗原结合片段配合，此类方法可被用于诊断影响T细胞数目和健康 的AIDS、白血病和其他疾病的程度或严重性。可适于本发明的目的的流 式细胞术的方法在Peters,J.M.等人(2011)“Multiparameter Flow Cytometry  In The Diagnosis And Management Of Acute Leukemia,”Arch.Pathol.Lab. Med.135(l):44-54；Meyerson,H.J.(2010)“A Practical Approach To The Flow  Cytometric Detection And Diagnosis Of T-Cell Lymphoproliferative  Disorders,”Lab.Hematol.16(3):32-52；Vandewoestyne,M.等人（2010年8 月3日电子出版）“Laser Capture Microdissection In Forensic Research:A Review,”Int.J.Legal.Med.124(6):513-521；Ornatsky,O.等人（2010年7月 21日电子出版）“Highly Multiparametric Analysis By Mass Cytometry,”J. Immunol.Meth.361(1-2):1-20；Mach,W.J.等人（2010年7月13日电子出 版）“Flow Cytometry And Laser Scanning Cytometry,A Comparison Of  Techniques,”J.Clin.Monit.Comput.24(4):251-259；和Chattopadhyay,P.K. 等人(2010)“Good Cell,Bad Cell:Flow Cytometry Reveals T-Cell Subsets  Important In HIV Disease,”Cytometry A.77(7):614-622；及在美国专利号 7,876,436；7,847,923；7,842,244；7,746,466；7,590,500；7,527,978；7,507,548； 7,491,502；7,486,387；7,479,630；7,465,543；7,354,773；6,794,152和6,784,981 中公开。

因此，本发明的抗体和片段在人的疾病、疾患或感染的检测和诊断中 具有效用。在一个实施方案中，此诊断包含：a）将与B7-H1或PD-1免疫 特异性结合的有效量的经标记的抗体或抗原结合片段（例如，肠胃外、皮 下或腹膜内）施用至受试者；b）在施用之后等待一个时间间隔用于允许 经标记的分子优先地在患者中B7-H1或PD-1表达的部位浓缩（并用于未 结合的经标记的分子被清除至背景水平）；c）确定背景水平；和d）确定 受试者中经标记的抗体，以便在背景水平之上的经标记的抗体的检测指示 受试者患有疾病、疾患或感染。根据本实施方案，使用本领域技术人员已 知的显像系统可检测的显像部分标记抗体。可通过多种方法确定背景水 平，包括，将检测到的经标记的分子的量与先前确定的用于特定系统的标 准曲线比较。

在本领域中将被理解的是所使用的对象的尺寸和显像系统将决定制 备诊断图像所需的显像部分的数量。体内肿瘤显像在S.W.Burchiel等人， “Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their  Fragments.”(Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer中第13 章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes，编者，Masson Publishing Inc.（1982） 中描述。

取决于几个可变因素，包括使用的标记类型和施用的方式，施用之后 用于允许经标记的分子优先地在受试者中部位处浓缩并用于未结合的经 标记的分子被清除至背景水平的时间间隔是6至48小时或6至24小时或 6至12小时。在另一个实施方案中，施用之后的时间间隔是5至20天或 5至10天。

在一个实施方案中，通过例如，初次诊断后1个月、初次诊断后6个 月、初次诊断后1年等重复用于诊断疾病、病患或感染的方法，实施疾病、 疾患或感染的监测。

使用用于体内扫描的本领域已知的方法可检测受试者中经标记的分 子的存在。这些方法取决于所使用的标记的类型。技术人员将能够确定用 于检测特定标记的适宜的方法。可用于本发明的诊断方法的方法和装置包 括，但不限于，计算机断层摄影（CT）、全身扫描诸如正电子发射断层摄 影（PET）、磁共振成像（MRI）和超声波扫描术。

在特定的实施方案中，使用放射性同位素标记分子并使用放射响应的 手术设备在患者中检测（Thurston等人，美国专利号5,441,050）。在另一 个实施方案中，用荧光化合物标记分子并使用荧光响应的扫描设备在患者 中检测。在另一个实施方案中，用发射正电子的金属标记分子并使用正电 子发射断层摄影术在患者中检测。在又另一个实施方案中，用顺磁标记标 记分子并使用磁共振成像（MRI）在患者中检测。

现在已一般地描述了本发明，通过参考下面的实施例，本发明将更容 易地被理解，实施例通过阐述的方式被提供且不期望限制本发明，除非另 有指明。

实施例1

抗-人B7-H1抗体的分离和表征

为了分离高亲和力中和抗-人B7-H1抗体（high affinity neutralizing  anti-human B7-H1antibodies），用人B7-H1-Fc首次免疫小鼠并随后加强。 遵循标准的操作说明，将来自抗-B7-H1阳性动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融 合。筛选所得的鼠杂交瘤中表达B7-H1-免疫反应性单克隆抗体的杂交瘤。 另外评价抗体以确定它们是否是IgG或IgM抗体。因此，将B7-H1-Fc或 阴性对照固定至固相支持体。随后将杂交瘤上清液放置与支持体接触，并 使用经标记的抗-小鼠IgG或抗-小鼠IgM确定抗-B7-H1抗体的存在。图1 显示所检测的杂交瘤上清液的结果并显示表达与人B7-H1具有免疫反应性 的抗体的多个杂交瘤系的分离。

筛选经鉴定的杂交瘤以确定它们表达的抗体是否是中和抗体并因此 能够阻断B7-H1和PD-1之间的结合。将PD-l-Fc固定至固相支持体，其 随后在包含生物素化的B7-H1-Fc的稀释的条件培养基存在下被孵育。通 过测定链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）与固相支持体的结合检测 B7-H1和PD-1与彼此结合的能力。能够调节B7-H1与PD-1结合的抗 -B7-H1抗体因此介导本试验中SA-HAS结合的减少。该实验的结果在图2 中显示，并显示一些经分离的杂交瘤表达人B7-H1中和抗体。抗体MIH-1 （抗-人CD274（B7-H1）（Chen,Y.等人（2005年11月11日电子出版） “Expression Of B7-H1In Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,” Nephron.Exp.Nephrol.102(3-4):e81-e92）被用作阳性对照。29E.2AE是抗 -PD-1抗体，但在该试验中显示是非中和的。来自不相关的杂交瘤（随机 Ab）的条件培养基和载体对照（VC）被用作阴性对照。

为了确定所表达的中和抗体是否能够与排列在细胞表面上的B7-H1结 合，进行了细胞结合试验。将每一个杂交瘤克隆的上清液1:4稀释并在亲 本CHO细胞和过表达全长人B7-H1的克隆CHO系的存在下孵育。在允许 结合发生之后，洗涤细胞并使用荧光标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合细胞 的剩余抗-B7-H1抗体的存在。关于与CHO-hB7-H1结合的中值荧光强度 （MFI）在图3中显示。没有发现所检测的克隆与亲本CHO系交叉反应， 显示所表达的抗体是人B7-H1特异性的。

作为另外的评价，将不同浓度的三个克隆与抗-B7-H1抗体MIH-1比 较。使用蛋白G纯化抗体并评价抗体与当以内源水平存在并如在APC的 表面上排列时的B7-H1结合的能力。将表达人B7-H1的CHO细胞与不同 浓度（10、1或0.1μg/ml）的抗-B7-H1抗体一起孵育，随后与缀合APC 的驴抗-小鼠抗体一起孵育。通过测量中值荧光强度报告结合。结果显示了 所检测的抗体对B7-H1比对照抗体（MIH1）呈现更大的亲合力（图4）且 抗体1E12对B7-H1比对照抗-B7-H1抗体（5H1）呈现更大的亲合力（Dong, H.等人(2002)“Tumor-Associated B7-H1Promotes T-Cell Apoptosis:A  Potential Mechanism Of Immune Evasion,”Nature Med.8(8):793-800）（图5）。

概括地说，该数据显示获得多个表达抗-人B7-H1的杂交瘤。所有克 隆都是识别B7-H1-Fc的IgG抗体。克隆1B3、1D11、1E2、1E4、1E10、 2A6、2E12、2F2、2F5、2F11、3A4和3B1在筛选结合试验中是弱的。低 信号可能是由于低表达水平和/或弱的亲和力。

显著地，一些克隆（例如，克隆：1D5、1E12、1F4、2A7、2G11、3B6、 3D10）显示强的中和活性。在所检测的所有浓度下所有抗体都是中和的并 呈现与抗原良好地结合。关于与CHO-B7-H1细胞结合的MFI如下： 1D5=50,821；1E12=56,152；1F4=62,015；2A7=49,008；2G11=55,947； 3B6=59,638；3D10=53,114。

实施例2

抗-人PD-1抗体的分离和表征

为了分离高亲和力中和抗-人PD-1抗体（high affinity neutralizing  anti-human PD-1antibodies），用人PD-l-Fc首次免疫小鼠并随后加强。遵 循标准的操作说明，将来自抗-PD-1阳性动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。 筛选所得的鼠杂交瘤中表达高亲和力人PD-1-免疫反应性单克隆抗体的杂 交瘤。另外评价抗体以确定它们是否是IgG或IgM抗体。因此，将PD-l-Fc 或阴性对照（B7-H4-Fc）固定至固相支持体。随后将杂交瘤上清液放置与 支持体接触，并使用经标记的抗-小鼠IgG或抗-小鼠IgM确定抗-PD-1抗 体的存在。图6显示经分离的抗-人PD-1抗体的抗原结合和同种型并显示 表达与人PD-1具有免疫反应性的抗体的多个杂交瘤系的分离。

筛选经鉴定的杂交瘤以确定它们表达的抗体是否是中和抗体并因此 能够阻断B7-DC和PD-1之间的结合。将结合PD-l的融合蛋白B7-DC-Fc 固定至固相支持体，其随后在包含生物素化的PD-l-Fc的稀释的条件培养 基存在下被孵育。通过分析链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）与固 相支持体的结合检测B7-DC和PD-1与彼此结合的能力。能够阻断B7-DC 与PD-1结合的抗-PD-1抗体因此介导本试验中SA-HRP结合的减少。该实 验的结果在图7A和7B中显示，并显示一些表达人PD-1中和抗体的经分 离的杂交瘤（图7B显示与图7A相同的图，但处于不同的比例尺）。

进行细胞结合试验以确定所表达的中和抗体是否能够与排列在细胞 表面的PD-1结合。将每一个杂交瘤克隆的上清液1:4稀释并在亲本CHO 细胞和过表达全长人PD-1的克隆的CHO系的存在下孵育。在允许结合发 生之后，洗涤细胞并使用荧光标记的抗-小鼠IgG抗体检测结合细胞的剩余 抗-PD-1抗体的存在。关于与CHO-hPD-1结合的中值荧光强度在图8中显 示。结果说明抗体1E3、1E8和1H3特别能够与在细胞表面表达的人PD-1 结合。没有发现所检测的克隆与亲本CHO系交叉反应，显示所表达的抗 体是人PD-1特异性的。J116是商业可得的抗-人PD-1对照抗体（eBioscience, Inc.）。同种型分析揭示1E3、1E8、1H3是IgG1/κ。

选择两个克隆（1E3和1H3）用于进一步的研究。作为另外的评价， 将不同浓度的两个克隆与抗-PD-1抗体M3和EH-12比较。使用蛋白G纯 化抗体并评价抗体与在CHO细胞表面表达的PD-1结合的能力。用未标记 的抗-PD-1抗体（10、1和0.1μg/mL）染色CHO-hPD1细胞、随后用缀合 APC的驴抗-小鼠抗体染色CHO-hPD1细胞，并报告了中值荧光强度。该 试验的结果在图9中报告。阴性对照是鼠IgG（mIgG1）；阳性对照是M3 （抗人PD-1的中和单克隆抗体）（Wu,K.等人(2009)“Kupffer Cell  Suppression of CD8+T Cells in Human Hepatocellular Carcinoma Is  Mediated by B7-H1/Programmed Death-1Interactions,”Cancer Res69(20): 8067-8075）和抗-PD-1抗体EH12（Dorfman,D.M.等人(2006)“Programmed  Death-1(PD-1)Is A Marker Of Germinal Center-Associated T Cells And  Angioimmunoblastic T-Cell Lymphoma,”Am.J.Surg.Pathol.30(7):802-810）。

通过将50,000CHO-hPD1细胞与抗-PD-1抗体（以从0-0.1mg/ml的浓 度范围存在）一起孵育30分钟执行基于细胞的竞争试验。随后添加10 μg/ml APC标记的B7-DC-Fc并继续孵育持续另外的30分钟，其后测量结 合的B7-DC-Fc的荧光。中值荧光强度在图10中显示。以20μg/mL的固 定的抗体浓度重复竞争（图11）。

概括地说，结果显示克隆1E3、1E8和1H3呈现中和活性并良好地识 别抗原。克隆1E6能够交联PD-1而不中和PD-1，从而给予增强的结合。 然而，该克隆似乎并不结合细胞表面上的PD-1。

实施例3

人源化抗体的制备：一般方法

如以上显示的，为了特定的目的，包括例如用于人疾病的体内治疗， 优选采用以上描述的抗-人B7-H1和/或抗-人PD-1抗体的人源化衍生物。

为了形成此类衍生物，首先将3D10或1H3抗体的构架序列（“亲本” 序列）与一组“受体”人抗体的构架序列比对以鉴定构架序列中的差异。通 过取代亲本和受体之间未匹配的构架残基实现人源化。分析在可能重要位 置处的取代诸如Vernier区、VH/VL链间界面或CDR标准类决定位置 （canonical class determining positions）的取代的预期回复突变（prospective  back mutations）（见，Foote,J.等人(1992)“Antibody Framework Residues  Affecting The Conformation Of The Hypervariable Loops,”J.Molec.Biol. 224:487-499）。鉴定了总计14个人源化变体序列。

保守域数据库（COD）（Marchler-Bauer,等人(2011)“COD:A Conserved  Domain Database For The Functional Annotation Of Proteins,”Nucleic Acids  Res.39:D225-D229）被用于确定每一条氨基酸链的域内容（content）和每 一个域的近似的边界。根据一些常用的定义，与互补决定区（CDR）的边 界一起精确确定可变域边界（Kabat,E.A.等人(1991)“Sequences of Proteins  of Immunological Interest,”第5版.NIH公布号91-3242；Chothia,C.等人(1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,”J. Mol.Biol.196:901-917）；Honegger,A.等人(2001)“Yet Another Numbering  Scheme For Immunoglobulin Variable Domains:An Automatic Modeling And  Analysis Tool,”J.Molec.Biol.309(3):657-670；以下将使用关于此类人源化 序列的Chothia CDR定义（Chothia,C.等人(1987)“Canonical Structures For  The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917）。

使用MAFFT产生亲本序列与小鼠和人种系序列的多重比对（Katoh,K. 等人(2002)“MAFFT:A Novel Method For Rapid Multiple Sequence Alignment  Based On Fast Fourier Transform,”Nucleic Acids Res.30:3059-3066）并根据 与亲本序列的序列同一性排序每一个比对中的条目（entries）。通过在100% 序列同一性的聚类和排除冗余的条目将参考集（reference sets）减少至唯一 序列集。

最佳的受体构架选择基于亲本抗体与受体跨两条链的构架的整体序 列同一性；然而，构成VH/VL链间界面的位置是令人特别感兴趣的。另 外，将负责对于5个CDR定义的标准结构的离散集（discrete set）的CDR- 环长度和CDR位置（Chothia,C.等人(1987)“Canonical Structures For The  Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917； Martin,A.C.等人(1996)“Structural Families In Loops Of Homologous  Proteins:Automatic Classification,Modelling And Application To Antibodies,” J.Molec.Biol263:800-815；Al-Laziniki,B.等人(1997)“Standard  Conformations For The Canonical Structures Of Immunoglobulins,”J.Molec. Biol.273:927-948）与种系比较，以确定哪些种系的构架具有相同的界面残 基并已知支持相似的CDR-环构象。表6和表7显示VH/VL界面内的保守 位置和确定CDR标准类的位置（分别地），具有根据Chothia的定义的编 号。

基于亲本抗体与人种系的序列比对，鉴定了最接近的匹配条目。优选 的人种系的选择基于排序标准：（1）跨构架的序列同一性；（2）一致的或 相容的链间界面残基；（3）具有亲本CDR标准构象的支撑环；（4）在所 表达的抗体中发现重和轻种系的组合；和（5）必须被去除的N-糖基化位 点的存在。

产生了抗体1H3的Fv-区的结构模型。基于它们与靶标的序列同一性 及模板结构的定性结晶测量诸如分辨率，以埃计，从抗体数据库中 计分、排名并选择关于构架（FR）和互补决定区（CDR）的候选结构模板 片段及完整的Fv。

为了结构比对CDR与FR模板，CDR的任一侧上的5个残基被包含 在CDR模板中。基于所产生的重叠区段和结构序列比对产生片段的比对。 通过MODELLER处理模板片段连同比对（Sali,A.等人(1993)“Comparative  Protein Modelling By Satisfaction Of Spatial Restraints,”J.Molec.Biol. 234:779-815）。该操作说明创建了源自所比对的结构模板的集的构象限制。 通过共轭梯度和经模拟的退火优化程序创建满足限制的结构的集合。基于 源自蛋白结构的分数的能量分数和满足构象限制从该集合中选择模型结 构。检查模型并使用侧链优化算法和能量最小化优化靶标和模板之间有差 异的位置的侧链。一套可视化和计算工具被用于评价CDR构象可变性、 局部堆积和表面分析以选择一个或多个优选的模型。

构建了亲本抗体的结构模型并检查了缺陷诸如差的原子堆积、键长中 的应变（strain in bond lengths）、键角或二面角。这些缺陷可显示关于抗体 的结构稳定性的潜在问题。建模方案致力于最小化此类缺陷。人源化Fv 的初始结构模型包含所有安全的取代（即，不应影响结合亲和力或稳定性 的取代）和谨慎的取代（即，作出取代的位置，但该位置对于结合亲和力 可能是重要的）。被认为与降低的结合亲和力或减少的稳定性的风险相关 的位置处的取代没有改变。独立于亲本模板搜索执行模板搜索和选择以创 建好的独立的模型而不是接近匹配的亲本的变体模型。随着执行潜在的取 代的评价，模型被更新以体现优选的取代和回复突变的影响。

实施例4

人源化抗-人B7-H1抗体的制备

为了说明此类人源化衍生物的制备，根据以上描述的过程制备了抗- 人B7-H1抗体3D10的人源化衍生物。

使用：IGKV3轻链种系（IGKV3-11*01、IGKV3-11*02、 IGKV3-NL5*01、IGKV3D-11*01、IGKV3-NL4*01、IGKV3D-7*01、 IGKV3D-20*01、IGKV3-20*01、IGKV3-20*02和IGKV3-15*01）、IGKV1 轻链种系（IGKV1-9*01、IGKV1-39*01、IGKV1D-13*01、IGKV1-16*01、 IGKV1-8*01、IGKV1-13*02、IGKV1-NL1*01、IGKV1D-43*01、 IGKV1-27*01和IGKV1-12*01）和IGKJ轻链种系（IGKJ4*01、IGKJ2*02、 IGKJ2*01、IGKJ2*04、IGKJ2*03、IGKJ5*01、IGKJ1*01和IGKJ3*01） 产生比较3D10轻链可变域与人种系的序列比对。

使用：IGHV1重链种系（IGHV1-2*02、IGHV1-2*04、IGHV1-f*01、 IGHV1-48*01、IGHV1-2*03、IGHV1-2*01、IGHV1-46*02、IGHV1-2*05、 IGHV1-3*01和IGHV1-8*01）、IGHV3重链种系（IGHV3-49*04、 IGHV3-49*01、IGHV3-49*02、IGHV3-49*03、IGHV3-64*01、IGHV3-64*02、 IGHV3-72*01、IGHV3-66*01和IGHV3-23*01）和IGHJ重链种系 （IGHJ3*02、IGHJ6*01、IGHJ3*01、IGHJ6*03、IGHJ5*02、IGHJ5*01、 IGHJ4*01、IGHJ1*01、IGHJ6*04和IGHJ2*01）产生比较3D10重链可变 域与人种系的序列比对。

（A）轻链的人源化

基于以上的标准，发现抗体3D10的轻链与种系轻链IGKV3-11*01 （SEQ ID NO:78）：

和IGKV1-9*01（SEQ ID NO:79）：

最相似，其中IGKV3-11*01是优选的，如在表8中显示的（抗体3D10的 CDR残基以斜体显示，经比对一致的残基以下划线显示）：

跨FR4将J-区段基因与亲本序列比较，并选择J-区段IGKJ4*01（SEQ  ID NO:80：LTFGGGTKVEIK）用于轻链。

如以上显示的，抗体3D10的轻链具有与标准的I类环类似的短的10 个残基CDR L1。人种系不具有此短的CDR L1。每一个所选择的种系， IGKV3-11*01和IGKV1-9*01具有包含正确的构架残基的较短的L1环以支 撑该类型的环。在受体构架和亲本序列之间观察到好的整体序列相似性， 然而，在界面位置Y33和P45处观察到重要的差异。残基Y33在CDR L1 中且虽然两条所选择的受体家族在该位置不包含酪氨酸，其他种系序列则 包含。受体构架和亲本序列之间在位置P45处的差异是亲本种系具有与任 何人种系都不相似的FR2的结果。结果，不管所选择的受体构架如何，都 提议该区中的变化，因此IGKV3-11*01和IGKV1-9*01被提出作为受体构 架。

对于两个优选的受体构架IGKV3-11*01和IGKV1-9*01的每一个创建 了三条人源化的链。三条LC1链源自IGKV3-11*01；三条LC2链源自 IGKV1-9*01。每一个受体构架的第一条人源化的链包含被认为可能的所有 人源化的取代且是三条链中最类似于人的（most human）。每一个受体构架 的第二条人源化的链包含在改变电荷、潜在地干扰核堆积或可能影响CDR 的构象的位置处的一些回复突变。每一个受体构架的第三条链包含最多的 回复突变，包括改变电荷和可能潜在地改变结合亲和力的取代。这六条人 源化的链的序列在以下显示：

关于这六条人源化的链的序列在表9中显示，相对于亲本3D10轻链 的差异以粗体和下划线显示。

（B）重链的人源化

根据以上讨论的标准，选择两条候选种系受体构架：IGHV1-2*02 （IGHV1种系）和IGHV3-49*04（IGHV3种系）用于抗体3D10的重链的 人源化。

选择受体构架IGHV1-2*02是由于其序列与亲本序列的相似性及其包 含与参与域的核堆积非常相似的残基的事实。在考虑并抛弃与IGHV1-2*02 相似的其他种系序列之后选择了受体构架IGHV3-49*04。由于受体构架 IGHV3-49*04比IGHV1-2*02与亲本序列轻微地更不相似，因此要求较大 数目的取代，然而，该种系受体构架可支撑亲本CDR。受体构架 IGHV1-2*02和受体构架IGHV3-49*04的序列在以下显示：

受体构架IGHV1-2*02（SEQ ID NO:87）：

受体构架IGHV3-49*04（SEQ ID NO:88）：

表10显示这些序列与抗体3D10的重链的比对（抗体3D10的CDR 残基以斜体显示，经比对一致的残基以下划线显示）。

跨FR4将J-区段基因与亲本序列比较，并选择J-区段IGHJ3*02（SEQ  ID NO:89：DAFDIWGQGTMVTVSS）用于重链。

对于两个优选的受体构架IGHV1-2*02和IGHV3-49*04的每一个创建 了三条人源化的链。三条HC1链源自IGHV1-2*02；三条HC2链源自 IGHV3-49*04）。每一个受体构架的第一条人源化的链包含被认为可能的所 有人源化的取代且是是三条链中最类似于人的。每一个受体构架的第二条 人源化的链包含在改变电荷、潜在地干扰核堆积或可能影响CDR的构象 的位置处的一些回复突变。每一个受体构架的第三条链包含最多的回复突 变，包括改变电荷和可能潜在地改变结合亲和力的取代。关于这六条人源 化的链的序列在以下显示：

关于这六条人源化的链的序列在表11中显示，相对于亲本3D10重链 的差异以粗体和下划线显示。

（C）抗体3D10的人源化衍生物

搜索确认了存在具有与IGKV3-11*01和IGHV1-2*02配对相似的种系 组合的抗体。该配对标记为受体1。另外，发现具有与IGKV1-9*01和 IGHV3-49*04的配对相似的种系组合的抗体。该配对标记为受体2。

将以上描述的轻链和重链人源化链组合以创建14个变体人源化抗体， 它们的序列在表12中描述。

实施例5

人源化抗-人PD-1抗体的制备

为了说明此类人源化衍生物的制备，根据以上描述的过程制备了抗- 人PD-1抗体1H3的人源化衍生物（并入1H3的可变区和人IgG1Fc区的 嵌合抗体被用作亲本抗体）。

使用：IGKV3轻链种系（IGKV3-11*01、IGKV3-11*02、IGKV3D-11*01、 IGKV3D-20*01、IGKV3-NL4*01、IGKV3D-7*01、IGKV3-20*01、 IGKV3-NL5*01、IGKV3-15*01、IGKV3-NL1*01、IGKV3-20*01、 IGKV3-NL2*01、IGKV3-NL3*01）、IGKV1轻链种系（IGKV1-9*01、 IGKV1D-43*01、IGKV1-39*01、IGKV1D-13*02、IGKV1-8*01、 IGKV1D-13*01、IGKV1-12*01、IGKV1D-16*01、IGKV1-5*01和 IGKV1-NL1*01）和IGKJ轻链种系（IGKJ2*02、IGKJ2*01、IGKJ2*04、 IGKJ2*03、IGKJ5*01、IGKJ4*01、IGKJ3*01和IGKJ1*01）产生比较1H3 轻链可变域与人种系的序列比对。

使用：IGHV3重链种系（IGHV3-48*01、IGHV3-48*02、IGHV3-48*03、 IGHV3-11*01、IGHV3-21*01、IGHV3-11*03、IGHV3-30*03、IGHV3-9*01、 IGHV3-7*01和IGHV3-30*10)、IGHV1重链种系（IGHV1-3*01、 IGHV1-69*08、IGHV1-69*11、IGHV1-46*01、IGHV1-69*05、IGHV1-69*06、 IGHV1-69*01、IGHV1-46*02、IGHV1-69*02和IGHV1-69*10）和IGHJ 重链种系(IGHJ6*01、IGHJ6*03、IGHJ4*01、IGHJ6*04、IGHJ5*02、 IGHJ3*02、IGHJ5*01、IGHJ3*01、IGHJ2*01和IGHJ1*01）产生比较1H3 重链可变域与人种系的序列比对。

基于整体序列同一性、配对的界面位置和经相似分类的CDR标准位 置，为每一条轻链和重链鉴定了两个种系家族作为可能的受体构架 （IGKV3和IGKV1用于轻链且1GHV3和IGHV1用于重链）。发现抗体 1H3与轻链种系1GKV3-11*01和重链种系IGHV3-48*01最相似。基于整 体序列同一性、配对的界面位置和经相似分类的CDR标准位置，为每一 条轻链和重链鉴定两个种系家族作为可能的受体构架（IGKV3和IGKV1 用于轻链且IGHV3、IGHV1用于重链）。

（A）轻链的人源化

抗体1H3具有短的10个残基CDR L1并落入标准的类I。人种系不具 有此短的CDR L1，但每一个所选择的家族中最接近的种系（IGKV3-II*01 和IGKV1-9*01）具有短的L1环并包含正确的构架残基以支撑类I L1环。 两个受体构架的整体序列相似性都是好的；然而，在两个界面位置（Y33 和P45）处具有差异。Y33位于CDR L1且虽然两个受体家族在此位置处 不包含酪氨酸，其他可能的受体家族则包含。P45处的差异与亲本轻链的 FR2中一些其他差异有关（tied in）。简言之，亲本种系属于具有与人种系 中任何事物都不相似的FR2的小鼠种系家族。

选择种系1GKV3-11*01和IGKV1-9*01作为轻链受体构架。 1GKV3-11*01和IGKV1-9*01的轻链的序列分别作为SEQ ID NO:78和 SEQ ID NO:79在以上显示。这些序列与抗体1H3的轻链的比对在表13 中显示（抗体1H3的CDR残基以斜体显示，经比对一致的残基以下划线 显示）：

跨FR4将J-区段基因与亲本序列比较，并选择J-区段IGKJ2*02（SEQ  ID NO:96：CTFGQGTKLEIK）用于轻链。

对于两个优选的受体构架IGKV3-11*01和IGKV1-9*01的每一个创建 了两条人源化的链。两条LC1链源自IGKV3-11*01；两条LC2链源自 IGKV1-9*01。每一个受体构架的第一条人源化链包含被认为可能的所有人 源化的取代且是三条链中最类似于人的。每一个受体构架的第二条人源化 链包含在改变电荷、潜在地干扰核堆积或可能影响CDR的构象的位置处 的一些回复突变。这四条人源化的链的序列在以下显示：

关于这四条人源化的链的序列在表14中显示，相对于亲本1H3Var1 轻链的差异以粗体和下划线显示。

（B）重链的人源化

根据以上讨论的标准，选择两条候选种系受体构架：IGHV3-48*01 （IGHV3种系）和IGHV1-3*01（IGHV1种系）用于抗体1H3Var1的重链 的人源化。

选择受体构架1GHV3-48*01作为基本重链受体构架，由于其整体序 列相似性。除了其中一些变化是允许的位置H35，界面残基匹配且其包含 正确的用于确定CDR H1的标准的类的残基。由于位置56处的酪氨酸， CDR H2没有落入任何基于序列的标准的类。在去除与IGHV3-48*01密切 相关的任何种系之后，作出第二重链受体构架的选择。随后，最接近的种 系变为IGHV1-3*01。由于较低的核的堆积是不同的，考虑的差异的数目 变得较大，然而，种系应支撑CDR并行使适合的受体构架的功能。注意 到亲本序列在保守的位置60处包含半胱氨酸，在该位置处所有的人种系 则具有酪氨酸。受体构架1GHV3-48*01和受体构架IGHV1-3*01的序列在 以下显示：

受体构架1GHV3-48*01（SEQ ID NO:101）：

受体构架IGHV1-3*01（SEQ ID NO:102）：

表15显示这些序列与抗体1H3的重链的比对（抗体1H3的CDR残 基以斜体显示，经比对一致的残基以下划线显示）。

跨FR4将J-区段基因与亲本序列比较，并选择J-区段IGHJ6*01（SEQ  ID NO:103：WGQGTTVTV)用于重链。

对于两个优选的受体构架IGHV3-48*01和IGHV1-3*01的每一个创建 了三条人源化的链。三条HC1链源自IGHV3-48*01；三条HC2链源自 IGHV1-3*01。每一个受体构架的第一条人源化的链包含被认为可能的所有 人源化的取代且是三条链中最类似于人的。每一个受体构架的第二条人源 化的链包含在改变电荷、潜在地干扰核堆积或可能影响CDR的构象的位 置处的一些回复突变。每一个受体构架的第三条链包含最多的回复突变， 包括改变电荷和可能潜在地改变结合亲和力的取代。这六条人源化的链的 序列在以下显示：

关于这六条人源化的链的序列在表16中显示，相对于亲本1H3重链 的差异以粗体和下划线显示。

（C）抗体1H3的人源化衍生物

搜索确认了存在具有与IGKV3-11*01和重链IGHV3-48*01的配对接 近的种系组合的抗体。配对标记为受体1。随后，发现具有与IGKVI-9*01 和IGHVI-3*01相似的配对的抗体。配对标记为受体2。

将以上描述的轻链和重链人源化链组合以创建14个变体人源化抗体， 它们的序列在表17中描述。

实施例6

1H3抗-人PD-1抗体的表征

为了评价本发明的抗-PD-1抗体的特性，制备了具有嵌合（“ch”）抗 体1H3的鼠抗-人PD-1Fab区和人IgG1Fc区（chimeric(“ch”)murine  anti-human PD-1Fab regions of antibody1H3and a human IgG1Fc region）的 构建体（1H3构建体）。检测该构建体关于其结合人PD-1的能力。

图12显示如下实验的结果，其中将经人全长PD-1转染的CHO细胞 与饱和剂量的PD-1mAb一起预孵育，然后用生物素标记的抗-hB7-H1-Fc 或抗-hB7-DC mFc染色。图12，显示具有嵌合（“ch”）抗体1H3的鼠抗- 人PD-1Fab区和人IgG1Fc区的鼠单克隆抗体构建体阻断B7-H1-Fc和 B7-DC-Fc与表达人PD-1的细胞的结合，作为抗体与细胞结合的结果。M1、 m3和1E8都是阳性对照抗-PD-1抗体。在非还原凝胶上，构建体作为约 200MW的单一条带迁移；在还原条件下，该条带被约52MW处的条带代 替。

1H3构建体呈现2.19nM的亲和力K_D、0.734×10^-5/Ms的“结合速率”K_a和1.61×10^-4/s的“解离速率”K_d。发现构建体的EC₅₀为75ng。图13比较了 用这个构建体获得的结合与商业可得的抗-PD-1抗体EH12获得的结合。 发现构建体能够完全阻断hPD-1（由CHO细胞表达）与B7-H1-Fc或 B7-DC-Fc结合的能力，如在图14中显示的。图15显示嵌合的1H3构建 体能够与hPD-l-Fc结合并阻断此hPD-l-Fc与由CHO细胞表达的hB7-H1 的结合。

相对于对照抗体（帕利珠单抗；Medimmune,Inc.），评价 了1H3构建体与人原代T细胞结合的能力；1H3展示了与CD8细胞和CD4 细胞二者增强的结合（图16A-16B）。

为了说明本发明的抗体的功能特征，评价了构建体1H3、和具有抗体 1H3（“1H3构建体”）、1E3（“1E3构建体”）和抗体3D10（“3D10构建体”） 的FAB区的嵌合抗体构建体增强T细胞活性的能力。将未成熟的树突细胞 （DC）持续两天暴露于TNFα和PGE2（在成熟的第二天，在50μg/ml的 破伤风类毒素（TT）存在下过夜孵育细胞）。发现所得细胞已变为成熟的 DC，如通过它们获得的表达B7-H1和B7-DC的能力所确定的。随后在羧 基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的自身T细胞和100ng/ml TT和以 上描述的抗体构建体存在下，持续两周孵育成熟的DC细胞。如在图17 中显示的，本发明的抗体能够阻断B7-H1-PD-1互作，如通过抗原特异性 记忆T细胞的扩增所测量的。在第7天时，进行了存在于细胞上清液的细 胞因子的分析（表18）。

如在表18中显示的，两种抗-hPD-1抗体构建体都促进Th1应答和Th2 应答二者。在上清液中发现非常低量的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10 和G-CSF。所有的mAb都具有非常低的内毒素，小于0.01EU/mg；另外， DC和T细胞保持在无血清培养基中。第7天细胞的细胞内IFN-γ染色显 示了尽管仅对照细胞的0.15%是IFN-γ⁺，与1H3构建体一起孵育的细胞的 1.9%、与1E3构建体一起孵育的细胞的0.91%和与3D10构建体一起孵育 的细胞的3.2%是IFN-γ⁺。

因此，总而言之，发现1H3构建体介导T细胞增殖约7倍增加且每个 细胞的IFN-γ生产约12倍的增加。此作用的累积效应为IFN-γ分泌约100 倍的增加。

作为进一步的功能表征，通过与TNFα和PGE2一起孵育使得源自单 核细胞的DC成熟。随后在混合的I类和II类限制的CEF肽（即，巨细胞 病毒（Cytomegalovirus）、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus）和流感病毒 （influenza virus）的肽）的集合的存在下持续2小时脉冲细胞，并与CFSE 标记的自身T细胞（LD柱，95%提纯）一起持续两周孵育。随后，在CFSE 标记的自身T细胞（LD柱，95%提纯）和以上描述的抗体构建体存在下 持续两周孵育经处理的细胞。在第7天，发现与对照抗体一起孵育的细胞 的CFSE-稀释的T细胞的百分数为40%、与1H3构建体一起孵育的细胞的 CFSE-稀释的T细胞的百分数为37%、与3D10构建体一起孵育的细胞的 CFSE-稀释的T细胞的百分数为50%及与抗体CA-18C3（抗-IL-1α-特异性 的单克隆抗体）一起孵育的细胞的CFSE-稀释的T细胞的百分数为57%。 在第11天，再次评价了CFSE-稀释的T细胞的百分数。随后，发现与对 照抗体一起孵育的细胞的CFSE-稀释的T细胞百分数为17%且与1H3构建 体一起孵育的细胞的CFSE-稀释的T细胞百分数为38%。随后，发现与抗 体CA-18C3一起孵育的细胞的CFSE-稀释的T细胞百分数为27%。

在第7天时，还分析了被处理的细胞的上清液的IL-2和IFN-γ细胞因 子（表19）。

在第11天时，还分析了被处理的细胞的上清液的IFN-γ、TNFα和 GM-CSF细胞因子。相对于对照抗体，发现1H3构建体介导所有三种细胞 因子的增加（表20）。

作为进一步的功能表征，通过暴露于TNFα和PGE2使得源自单核细 胞的DC（从HLA-A2阳性供体PBMC获得）成熟，并随后用HLA-A2限 制的MART-1和Flu M1肽持续2小时脉冲成熟的DC。之后，在CFSE标 记的自身T细胞（LD柱，95%提纯）和以上描述的1H3构建体或3D10 构建体的存在下持续两周孵育细胞。MART-1和M1肽对细胞因子产生的 影响在表21中显示。

实施例7

人源化抗-PD-1抗体的表征

评价以上描述的人源化的1H3_var1-1H3_var14抗体（见表17）以确 认它们与人PD-1结合的能力和它们的治疗能力。在CHO细胞中表达编码 抗体的多肽并通过ELISA确定功能抗体的滴度（表22）。

为了确保结合是人PD-1特异性的，使用已被转染以表达人PD-1的 CHO细胞评价结合。此结合实验的结果在图18A-18D中显示。通过在1ng、 3ng、10ng、30ng、100ng、300ng、1000ng或3000ng的h1H3变体的 存在下重复此结合实验，发现此类人源化的抗体与PD-1结合的能力在所 有情况下都取决于抗体浓度。

为了说明本发明人源化的抗-PD-1抗体阻断PD-1和其天然的配体之间 的互作的能力，在B7-H1（或B7-DC）和所选择的h1H3变体存在下孵育 表达PD-1的HEK293细胞。发现h1H3变体抗体能够阻断B7-H1与HEK293 细胞的结合（图19A（B7-H1）；图19B（B7-DC）（Ctl=synagis，WT=嵌合 1H3））。

表23提供了500ml规模的瞬时表达和纯化过程中获得的结果。非还 原凝胶显示所表达的抗体主要作为约160kD的单一条带而迁移；当在还原 凝胶中分析时，该条带被约60kD和30kD的条带所代替。结果显示受体 1h1H3变体：h1H3Var1、h1H3Var3、h1H3Var4和h1H3Var6呈现与人 PD-1好的结合，而受体2h1H3变体：h1H3Var7-h1H3Var14呈现与人PD-1 较差的结合。因此，将来自受体1h1H3变体：h1H3Var1-h1H3Var6的重 链和轻链克隆入双基因载体（DGV;Lonza Biologies,Berkshire,UK; Bebbington,C.R.等人(1992)“High-Level Expression Of A Recombinant  Antibody From Myeloma Cells Using A Glutamine Synthetase Gene As An  Amplifiable Selectable Marker,”Biotechnology(NY)10(2):169-175）并转染 进入CHO细胞以允许稳定的产生抗体的细胞系的制备。

在0.5ng/ml、1.5ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml和 500ng/ml及1.5μg/ml、5μg/ml、15μg/ml和50μg/ml的抗体浓度下分析 结合显示结合是浓度依赖性的。在从0至约350nM范围的抗体浓度下确 定变体的PD-1特异性结合能力。图20显示h1H3Var1-h1H3Var6的所得 曲线，并显示这些抗体结合PD-1。相对于亲本抗体，抗体h1H3Var1和 h1H3Var4呈现减少的结合。相比之下，h1H3Var2、h1H3Var3、h1H3Var 5和h1H3Var6呈现与亲本抗体的结合相当的结合。这些抗体的EC50数 据在表23中显示。

本说明书中提及的所有出版物和专利，与如同每一个单独的出版物或 专利申请被特定和单独地指出通过引用整体并入的相同的程度通过引用 被并入本文。尽管已联系其特定的实施方案描述了本发明，将被理解的是 其能够具有另外的变化，且本申请期望覆盖一般而言根据本发明的原理并 包括如落入本发明所属的领域内已知的或惯例内的实践和如可被应用至 上文中阐述的基本特性的从本公开的此类偏离的本发明的任何变化形式、 用途或改编。